Soutenance mémoire
Les hydrolysats de coproduits d’origine aquatique
Les bactéries lactiques
Les bactéries lactiques (BL) forment un groupe hétérogène, composé de coques, et de bacilles, dont la principale caractéristique est la production d’acide lactique à partir de la fermentation des sucres. Ce sont des cellules procaryotes, hétérotrophes, et chimioorganotrophes, non pathogènes, à Gram positif, généralement immobiles, non sporulées, anaérobies mais aérotolérantes, ne possédant pas la catalase ni la nitrate réductase ni la cytochrome-oxydase, ne liquéfiant pas la gélatine, et ne produisant pas d’indole ni d’hydrogène sulfureux (De Roissart et Luquet, 1994). Ces bactéries peuvent être homofermentaires (70 % du produit métabolique est de l’acide lactique), ou hétérofermentaires (50 % d’acide lactique complété par d’autres composés tels que l’acide acétique, le CO2, ou l’éthanol) (Novel, 1993).
Elles ont été isolées à partir de plusieurs milieux naturels (végétaux, animaux et humains) (De Roissart et Luquet, 1994) et sont classées en plusieurs genres : Aerococcus, Alloiococcus, Atopobium, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus et Weisella (Pot,2008).
Situation de la pêcherie mondiale
Depuis longtemps, l’exploitation des ressources marines permet de répondre à un besoin croissant d’alimentation pour l’homme. Dans son rapport de 2016, l’organisation des nations unies pour l’alimentation et l’agriculture (FAO) considère que les ressources marines constituent une source importante d’aliments nutritifs et de protéines animales pour une grande part de la population mondiale (FAO, 2016). Elles procurent 20 % des apports en protéines animales de la population mondiale.
Toutefois le rythme de croissance de la production mondiale de poisson est plus prononcé que celui de la population mondiale. En effet, l’offre mondiale de poisson de consommation a progressé de manière spectaculaire depuis cinquante ans, avec un taux moyen de croissance de 3,2 % par an sur la période 1961-2009, soit un rythme supérieur à la croissance démographique mondiale annuelle, qui est de 1,7 % sur la même période. L’une des premières conséquences de cette situation est de faire passer la consommation par habitant d’une moyenne de 9,9 kg dans les années 60, à 18,4 kg en 2009 .
Identification de la souche
L’analyse de la séquence de gène de l’ADNr 16S est l’une des techniques les plus utilisées pour l’identification d’espèces étant donnée sa rapidité, sont efficacité et sa reproductibilité comparée aux techniques conventionnelles utilisant des critères morphologiques et physiologiques. La souche a été purifiée sur milieu MRS. Le gène de l’ADNr 16S a été amplifié à partir de l’ADN génomique de la souche DM19. Le produit PCR a été analysé par électrophorèse, purifié et enfin séquencé en utilisant la plateforme d’analyse génomique Illumina MiSeq (Goodwin et al., 2016). En utilisant l’algorithme ‘’BLAST’’, la comparaison de la séquence nucléotidique ribosomale ADNr 16S de la souche DM19 avec toutes les séquences correspondantes disponibles sur la base de données ‘’NCBI’’, a montré 99% d’homologie avec la souche Enterococcus faecalis. Suite au résultat obtenu, la souche a été nommée Enterococcus faecalis DM19.
Caractérisation biochimique de l’activité protéolytique extracellulaire de la souche E.faecalis DM19
L’effet des paramètres pH et température ainsi que l’effet d’inhibiteurs sur l’activité des protéases produites dans le milieu de culture sont analysés par spectrophotométrie en utilisant le substrat chromophore azocaséine.
Effet de la température: L’influence de la température sur l’activité protéolytique de l’extrait enzymatique brut a été analysée dans les conditions de température variable (20 °C à 80 °C).
D’après la figure 29, on constate que l’activité protéolytique est maximale à 40 °C puis diminue rapidement pour s’annuler à 50 °C. Ce résultat corrobore avec les données de la littérature ; une protéinase extracellulaire de Enterococcus faecalis subsp. liquefaciens a exprimé une activité maximale à 45 °C (García de Fernando et al., 1991).
Effet du pH:Les résultats obtenus (Figure 30) indiquent que l’activité protéolytique est maximale à pH 7.Cette activité est très sensible aux pH supérieurs à 8 et inférieur à 5. Ces résultats rejoignent ceux de García de Fernando et al. (1991) qui, dans une étude similaire sur la protéinase purifiée de Enterococcus faecalis subsp. liquefaciens ont rapporté une activité maximale à pH 7,5.
Étude de la stabilité à la température et au pH: Dans cette partie de l’étude, l’extrait enzymatique est incubé pendant 30 min à des températures ou des pH différents pour évaluer la stabilité de l’activité protéolytique. Ainsi, cette activité apparait stable entre 30 °C et 40 °C (Figure 31) et dans l’intervalle de pH 6, 7, 8. L’activité protéolytique est totalement inactivée à 50 °C et aux pH très acides et très basiques. On peut conclure que les enzymes produites par la souche E.faecalis DM19 sont des protéases thermostables à pH neutre.
Sur la base de ces résultats, la température 40 °C et pH 7 ont été retenus pour le procédé d’hydrolyse enzymatique.
Analyse de la composition en acides aminés
Après analyse de la composition en acides aminés (Tableau 16), il semble que le taux de certains acides aminés se trouvant dans les hydrolysats tels que : Asp (103/1000 résidus), Glu (133/1000 résidus), Ala (99/1000 résidus), Val (55/1000 résidus), Met (14/1000 résidus), Leu (75/1000 résidus) et Tyr (13/1000 résidus) soit plus important dans l’hydrolysat HPC que dans l’hydrolysat HPEC. Il a été rapporté que ont rapporté que les acides amiés Trp, Tyr, Met (dans leur forme libre) donnent la plus haute activité antioxydante, suivie par les acides aminés Cys, His et Phe (Dávalos et al., 2004). D’autres acides aminés tels que His, Lys et Trp ont également montré des propriétés antioxydantes (Chen et al., 1996). De plus, la présence de résidus hydrophobes (Gly, Pro, Ala, Val et Leu) dans des hydrolysats a été liée au pouvoir piégeur des radicaux libres (Mendis et al., 2005). En effet, Dans une étude similaire, Zhu et al. (2006) ont également rapporté que les hydrolysats de protéines de soja avaient une activité antioxydante plus élevée que la protéine de soja non hydrolysée. L’hydrolyse de la protéine a libéré des séquences peptidiques contenant des acides aminés hydrophobes. Ces acides aminés peuvent contribuer de manière significative à la solubilité des peptides dans les lipides et par conséquent à l’augmentation de leur activité antioxydante (Chen et al., 1996). En plus de leur nature hydrophobe, leur positionnement dans la séquence peptidique joue également un rôle crucial dans la manifestation de l’activité antioxydante (Chen et al. 1998).
Profil moléculaire des hydrolysats
Les différentes tailles des peptides composant les hydrolysats ont été analysées . Trois principaux pics sont identifiés pour les deux types d’hydrolysats. Les Tableaux 17 et 18 montrent la distribution des peptides des hydrolysats selon leurs poids moléculaires (PM). La variation des PM a révélé des différences considérables dans le degré d’hydrolyse (DH) des protéines selon la nature du substrat. Ainsi, 9 % à 21 % des hydrolysats de protéines HPEC ont un PM supérieur à 1000 Da . Par contre 79 % à 99 % voire 100 % possèdent un poids moléculaire inférieur à 1000 Da. Les poids moléculaires correspondant à ce pourcentage élevé de peptides pourraient représenter les acides aminés, les dipeptides, tripeptides ou tetrapeptides et autres peptides de faible PM. Durant l’hydrolyse enzymatique, une grande variété de peptides de petite taille ainsi que des acides aminés sont générés, cela dépend de la spécificité de l’enzyme mise en jeu. La modification de la taille des peptides ainsi que les acides aminés qu’ils les composent affectent par conséquent l’activité antioxydante (Wu et al., 2003). Dans ce contexte, Il est très bien documenté que ce sont les peptides de faible PM qui présentent l’activité la plus importante (Phanturat et al., 2010 ;
Yang et al., 2008 ; Kim et al., 2001), et ils pourraient, ainsi, franchir la barrière intestinale et exercer leur activité biologique (Rufian-Henares et Morales, 2007). Nos résultats sont en accord avec ceux rapportée par Wu et al. (2003) qui observent une activité antioxydante très élevée avec les peptides dont le poids moléculaire est inférieur à 1,4 kDa. De même, les travaux de Je et al. (2005) ont montré une corrélation entre l’activité antioxydante et la masse moléculaire des peptides dans les hydrolysats de protéines de Colin d’Alaska, avec une activité antioxydante plus importante associée à des peptides dont le PM est inférieur à 1 kDa.
On note également que la capacité réductrice de fer semble ne pas être bien corrélée avec l’abondance des peptides à PM inférieur à 1 kDa dans les deux types d’hydrolysats. Cela peut être dû à l’activité spécifique de l’enzyme mise en œuvre, qui pourrait produire des peptides pourvus ou dépourvus à la fois de l’activité antioxydante, ce qui dénote l’importance de la séquence peptidique (composition en acides aminés) plutôt que sa taille moléculaire (Giménez et al., 2009).
Mesure de l’activité inhibitrice des hydrolysats vis-à-vis de l’ECA
Les hydrolysats à partir des deux types de substrats (protéines de carapace et protéines d’eau de cuisson) générés à 120 min ont été recueillis et testés pour leur capacité à inhiber l’enzyme de conversion de l’angiotensine I. Les résultats obtenus ont révélé que les deux types d’hydrolysats (HPEC et HPC) sont capables d’inhiber l’enzyme de conversion de l’angiotensine I avec un taux d’inhibition de 1,8 % et 32,66 % respectivement. Le dernier résultat semble plus élevé, mais il n’est pas intéressant lorsque l’on compare avec les données de la littérature. Muguerza et al. (2006) ont démontré que l’hydrolyse des caséines au cours de la fermentation du lait par des souches d’E.faecalis générait des peptides dotés d’activité inhibitrice de l’ECA supérieure à 70 %. Ainsi, une autre étude a montré que les protéases de Bacillus sp. SM98011 permettent de libérer de peptides en hydrolysant les protéines d’une crevette (Acetes chinensis) avec une forte activité d’inhibition de l’ECA (Hai-Lun et al. 2006). D’autres études ont souligné que l’effet antihypertensif in vivo et in vitro des hydrolysats de protéines dépend fortement du type de protéases utilisées ou des conditions de
protéolyse ainsi que la nature du substrat protéique à partir duquel les peptides antihypertensifs sont issus (Alashi et al., 2014 ; He et al., 2013 ; Marrufo-Estrada et al., 2013 ; Ewart et al., 2009). Par exemple, il a été démontré que l’hydrolyse des concentrés protéiques de lactosérum (CPL) avec l’alcalase produisait des hydrolysats de protéines avec des taux d’activité inhibitrice de l’ECA plus élevés à ceux des hydrolysats produits par l’action de flavourzyme et de pancreatine (Morais et al., 2014). Li et al. (2006) ont également montré que l’activité antihypertensive d’un hydrolysat de haricot mungo préparé à l’aide de l’alcalase était supérieure à celle de l’hydrolysat obtenu par la neutrase. L’ensemble de ces données démontre que les différences d’activité entre les produits d’hydrolyse enzymatique sont dues à la nature et la spécificité d’action de l’enzyme et aussi à la nature des peptides (taille de la séquence peptidique et composition en acides aminés) et leur concentration dans l’hydrolysat
(Aluko et al., 2015).
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Table des matières
1. Introduction
1.1. Les bactéries lactiques
1.1.1. Définition et caractéristiques principales
1.1.2. Métabolisme
1.1.2.1. Métabolisme des carbohydrates
1.1.2.2. Métabolisme de l’azote
1.1.3. Les bactériocines produites par les bactéries lactiques.
1.1.3.1. Définition des bactériocines
1.1.3.2. Classification des bactériocines
1.1.3.3. Mode d’action
1.1.3.4. Applications des bactériocines
1.1.4. Le genre Enterococcus
1.1.4.1. Caractères généraux
1.1.4.2. Habitat
1.1.4.3. Utilisation des entérocoques dans l’alimentation
1.2. Situation de la pêcherie mondiale
1.3. Les hydrolysats de coproduits d’origine aquatique
1.3.1. Définition
1.3.2. Les coproduits et leur valorisation
1.3.3. L’hydrolyse enzymatique
1.3.4. Intérêt nutritionnel des hydrolysats
1.3.4.1. Composition des hydrolysats
1.3.4.2. Applications des hydrolysats
1.3.4.3. Support de milieu de culture microbienne
1.3.5. Intérêt fonctionnel
1.3.5.1. Les peptides bioactifs
1.3.5.2. Régulation du système immunitaire
1.3.5.3. Régulation du système cardio-vasculaire
1.3.5.4. Autres bioactivités
1.4. La réaction de Maillard
1.4.1. Historique.
1.4.2. Les grandes étapes de la réaction
1.4.3. Les facteurs influençant la RM
1.4.3.1. L’activité de l’eau
1.4.3.2. La température et la durée de chauffage
1.4.3.3. Le pH du milieu réactionnel
1.4.3.4. Les réactants
1.4.4. Implication de la RM en agro-alimentaire
1.4.4.1. Effets bénéfiques de la RM
1.4.4.1.1. Génération d’arômes et de coloration
1.4.4.1.2. Propriétés antioxydantes
1.4.4.1.3. Propriétés prébiotiques
1.4.4.1.4. Propriétés antibiotiques
1.4.4.1.5. Propriétés antiallergènes
1.4.4.1.6. Propriétés antimutagènes
1.4.4.2. Effets néfastes de la RM
1.4.4.2.1. Réduction de la valeur nutritionnelle
1.4.4.2.2. Génération de composés toxiques
2. Matériel et Méthodes
2.1. Matériel
2.1.1. La souche bactérienne utilisée
2.1.1.1. Origine de la souche DM19
2.1.1.2. Vérification de la pureté de la souche DM19
2.1.2. Souches indicatrices : cultures bactériennes et milieux
2.1.3. Les coproduits marins : origine et collecte
2.2. Méthodes
2.2.1. Identification génotypique de la souche DM19
2.2.2. Préparation de l’extrait enzymatique
2.2.2.1. Dosage de l’activité protéolytique
2.2.2.2. Détermination de l’activité spécifique
2.2.2.3. Caractérisation biochimique de l’extrait enzymatique
2.2.2.3.1. Effet du pH sur l’activité et la stabilité des protéases
2.2.2.3.2. Effet de la température sur l’activité et sur la stabilité des protéases
2.2.2.3.3. Effet des ions métalliques sur l’activité enzymatique
2.2.2.3.4. Effet des inhibiteurs sur les protéases
2.2.2.4. Détermination des constantes cinétiques
2.2.3. Hydrolyses enzymatiques
2.2.3.1. Hydrolyse par les protéases de la souche DM19
2.2.3.2. Hydrolyse par les enzymes commerciales et endogènes
2.2.3.3. Suivi de la cinétique des hydrolyses
2.2.3.4. Calcul du degré d’hydrolyse
2.2.3.5. Arrêt des réactions d’hydrolyse
2.2.3.6. Traitements post-hydrolyses
2.2.4. Réaction de Maillard
2.2.4.1. Préparation des PRM
2.2.4.2. Méthodes de mesure de la RM
2.2.4.2.1. Mesure du pH
2.2.4.2.2. Dosage des PRM formés par spectrophotométrie
2.2.4.2.3. Dosage des composés fluorescents par spectroscopie de fluorescence
2.2.4.2.4. Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (IR-TF)
2.2.4.2.5. Dosage des acides aminés résiduels
2.2.5. Méthodes d’étude des peptides et de leurs PRM
2.2.5.1. Analyse de la composition en acides aminés
2.2.5.2. Distribution du poids moléculaire
2.2.5.3. Recherche des activités biologiques
2.2.5.3.1. Recherche de l’activité inhibitrice vis-à-vis de l’ECA
2.2.5.3.2. Méthodes de mesure du pouvoir antioxydant
a. Mesure du pouvoir réducteur du fer
b. Mesure du pouvoir anti-radicalaire
c. Mesure du pouvoir chélateur de fer
2.2.5.3.3. Évaluation de l’activité antimicrobienne
2.2.6. Valorisation des coproduits marins en tant que milieu de culture pour la souche DM19
2.2.6.1. Conditions de culture
2.2.6.2. Analyses biochimiques
2.2.6.2.1. Dosage des protéines
2.2.6.2.2. Mesure du pH
2.2.6.2.3. Dosage des acides organiques et du glucose
2.2.6.3. Recherche de l’activité bactériocinogène dans les surnageants de culture
2.2.6.4. Séquençage du génome et identification de gènes putatifs codant pour la bactériocine
2.2.7. Analyses statistiques
3. Résultats et Discussion
3.1. Identification de la souche
3.2. Caractérisation biochimique de l’activité protéolytique extracellulaire de la souche E.faecalis DM19
3.2.1. Effet de la température
3.2.2. Effet du pH
3.2.3. Etude de la stabilité à la température et au pH
3.2.4. Effet des inhibiteurs irréversibles et des ions métalliques
3.2.4.1. Effet des inhibiteurs
3.2.4.2. Effet des ions métalliques
3.2.5. Détermination des constantes cinétiques
3.3. Hydrolyse enzymatique
3.3.1. Activités antioxydantes des hydrolysats
a. Pouvoir réducteur de Fer
b. Capacité de piégeage des radicaux libres
c. Capacité de chélation de Fer
3.3.2. Analyse de la composition en acides aminés
3.3.3. Profil moléculaire des hydrolysats
3.3.4. Mesure de l’activité inhibitrice des hydrolysats vis-à-vis de l’ECA
3.4. Réaction de Maillard
3.4.1. Mesure du pH
3.4.2. Mesures de l’absorbance des PRM formés
a. Mesure à 420 nm
b. Mesure à 294 nm
3.4.3. Mesure de la fluorescence
3.4.4. Dosage des acides aminés résiduels
3.4.5. Analyse de la composition en acides aminés
3.4.6. Distribution des poids moléculaires
3.4.7. Spectroscopie infrarouge à transformation de Fourrier (IR-TF)
3.4.8. Étude de l’activité antioxydante des PRMa. Étude du pouvoir réducteur
b. Étude du pouvoir antiradicalaire et chélateur de fer
3.4.9. Étude de l’activité antibactérienne
3.5. Valorisation des coproduits marins en tant que milieu de culture pour la souche E.faecalis DM19
3.5.1. Effet des hydrolysats de coproduits d’origine marine sur la consommation du glucose et
de protéines et la production d’acides organiques.
3.5.2. Effet des hydrolysats de coproduits d’origine aquatique sur la croissance
3.5.3. Effet des hydrolysats de coproduits sur l’activité bactériocinogène
3.5.4. Identification de gènes codant pour la bactériocine
4. Conclusion et perspectives
5. Références bibliographique
6. Annexes
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