Soutenance mémoire
Télécharger le fichier pdf d’un mémoire de fin d’études
Lipidome
Le lipidome des HDL se réfère à la totalité des lipides qui constituent les HDL ; on parle aussi de profil lipidique des HDL. A ce jour, le lipidome des HDL est composé de plus de 200 lipides. La teneur des HDL en composants lipidiques majeurs a été analysée dans plusieurs études et varie selon la sous-population de HDL, temoignant du remodelage dynamique permanent des HDL dans le plasma (Kontush, Lhomme, & Chapman, 2013).
La composition lipidique des HDL contribue aux propriétés athéroprotectrices des HDL (Kontush et al., 2013). Par exemple, la quantité et la qualité des phospholipides contribuent à l’efflux de cholestérol des cellules périphériques vers les HDL (les phospholipides insaturés à l’état liquide sont des meilleurs accepteurs de cholestérol que leurs analogues saturés en état gel) (Jian et al., 1998) (Yancey et al., 2000). Les HDL transportent également des lipides bioactifs tels que la sphingosine-1-phosphate (S1P) qui joue un rôle important dans la protection endothéliale grâce à ses propriétés vasodilatatrices et antiapoptotiques qui passent par l’activation de l’oxyde nitrique synthase endothéliale (eNOS) (Mineo et al., 2006) (J. R. Nofer et al., 2004) (Igarashi & Michel, 2008) (Matsuo et al., 2007).
Métabolome
En plus des lipides et des protéines, les HDL transportent aussi tout un répertoire de petites molécules regroupées sous le nom de métabolome des HDL (Vickers & Remaley, 2014). Dans ce répertoire nous retrouvons des vitamines liposolubles comme la vitamine E (α-tocophérol), la vitamine D, la vitamine A (rétinol) ou ses précurseurs, les caroténoïdes. Nous retrouvons également des hormones et stéroïdes telles que la tétraiodotyronine (thyroxine) ou l’œstradiol, la pregnénolone et la déhydroépiandrostérone. Ces hormones pourraient agir comme régulateurs transcriptionnels ou pourraient servir de précurseurs pour la synthèse cellulaire des stéroïdes (Vickers & Remaley, 2014). Parmi les multiples molécules véhiculées par les HDL on retrouve des acides biliaires. Dans la circulation la majorité des acides biliaires sont sous forme libre ou liée à l’albumine et se retrouvent dans la circulation portale hépatique et en moindre proportion dans la circulation systémique (reflet de la circulation entéro-hépatique).
Transcriptome
Vickers et al. ont démontré que les HDL circulantes transportent diverses espèces d’ARN (acides ribonucléiques ou RiboNucleic Acid) non codants, telles que des fragments de Ribonucléase P (ribonucléase qui clive l’ARN), des fragments dérivés de tRNA (tRFs) (fragments des ARN de transfert dont la fonction n’est pas totalement élucidée), et enfin des microRNA (miRNA). Les miRNA sont des petits ARN non codants (environ 22 nt) qui contrôlent l’expression des ARNm (ARN messagers) avec des séquences complémentaires. Plus de 90% des miRNA extracellulaires sont empaquetés avec des protéines telles que les HDL ou Ago2 alors que les 10% restants sont contenus dans des LDL ou des particules telles que des exosomes, des microvésicules ou des corps apoptotiques (Zhu & Fan, 2011) (Vickers et al., 2011) (Chen et al., 2012) (Arroyo et al., 2011). Les travaux de Vickers et al. suggèrent que les miRNA transportés par les HDL peuvent être délivrés aux cellules et altérer l’expression de leurs gènes cibles au sein de la cellule (Vickers et al., 2011). Parmi les miRNA retrouvés à plus haute concentration dans les HDL, se trouvent le miR-223, le miR-126 et le miR-92a (Wagner et al., 2013). Le miR-223, qui compte pour 8% de l’ensemble des miRNA circulants a été très étudié et serait impliqué dans le métabolisme glucidique des cardiomyocytes, la granulopoïèse ou la différenciation ostéoclastique (Wagner et al., 2013) (Vickers et al., 2011).
Les HDL et leurs fonctions.
Les HDL possèdent plusieurs propriétés protectrices vis à vis de l’athérosclérose. Cet effet protecteur des HDL est attribué en grande partie à leur rôle primordial dans le Transport Retour du Cholestérol, mais est également associé aux effets pléiotropes de ces lipoprotéines sur la paroi vasculaire (anti-inflammatoires, antioxydantes, antithrombotiques…). Les différentes sous-populations de HDL de par leur taille et leur composition auront des fonctionnalités différentes.
Propriétés pléiotropes des HDL.
Un évènement majeur impliqué dans l’initiation de la formation de la plaque d’athérome est la dysfonction endothéliale (modification du profil de l’endothélium vers un profil vasoconstricteur, inflammatoire et thrombotique), qui induit une infiltration des LDL dans l’espace sous-endothélial où elles seront oxydées. Les LDL oxydées (LDLox) sont extrêmement pro-athérogènes et inflammatoires.
En effet, les LDLox ainsi que différentes cytokines inflammatoires (Facteur de nécrose tissulaire : TNFa et Interleukine-1 : IL-1) vont induire l’activation de l’endothélium qui va exprimer de nombreuses molécules d’adhérence des leucocytes telles que la molécule d’adhérence aux cellules vasculaires-1 (VCAM-1), la molécule intercellulaire d’adhérence-1 (ICAM-1) et les E et P-sélectines (O’Connell & Genest, 2001). Les LDLox vont également participer à la sécrétion par les cellules endothéliales de molécules chimio-attractantes comme MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein-
1) et de facteurs de croissance comme le M-CSF (Macrophage Colony-Stimulating Factor), qui vont respectivement induire la migration des monocytes dans l’espace sous-endothélial, et la différenciation des monocytes en macrophages (Young & McEneny, 2001). Ainsi, les monocytes circulants vont se lier aux molécules d’adhérence à la surface de l’endothélium, pénétrer dans l’espace sous-endothélial, guidés par les cytokines chimio-attractantes (telles que MCP-1), et se différencier en macrophages sous l’effet de facteurs de croissance (tels que M-CSF). Les macrophages phagocytent les LDLox via des récepteurs scavengers tels que les Scavenger Receptors class A types I et II (SR-AI et SR-AII), CD36, CD68 et les Scavenger Receptors class B types I et II (SR-BI et SR-BII) (Mendoza et al., 2013) (Levitan et al., 2010). Les LDLox s’accumulent au sein des macrophages qui se transforment en macrophages spumeux. Des macrophages spumeux, et en moindre mesure, des lymphocytes s’accumulent dans la paroi artérielle. Les LDLox intravasculaires vont activer les macrophages via les récepteurs CD36 et TLR (Toll-Like receptors, TLR4 et TLR6) exprimés à leur surface et initier une cascade d’inflammation (production de cytokines pro-inflammatoires, de MPPs (Matrix Metalloproteases), et de facteurs procoagulants) (Hansson et al., 2006) (Stewart et al., 2010). En parallèle les cellules musculaires lisses, constituants majoritaires de la média, tunique moyenne des artères, vont proliférer sous l’action des MMPs (exprimées par les macrophages et les cellules endothéliales) et former la chape cellulaire et fibreuse. L’infiltration des cellules immunitaires, l’apoptose des cellules et la dégradation de la matrice extracellulaire peuvent générer une chape fibreuse mince et instable formée d’un noyau nécrotique riche en lipides. L’instabilité de la plaque peut induire la formation d’un thrombus.
Ainsi, l’athérosclérose est une pathologie qui fait intervenir de façon importante des processus d’oxydation, d’inflammation, d’apoptose des cellules, de vasoconstriction artérielle locale et dans le cas de plaque d’athérome instable, des processus thrombotiques. L’effet athéroprotecteur des HDL, bien qu’il soit en grande partie attribué au rôle des HDL dans le mécanisme du Transport Retour du Cholestérol (RCT), est également attribué aux propriétés pléïotropes des HDL qui incluent leurs propriétés antioxydantes, anti-inflammatoires, protectrices de l’endothélium vasculaire et antithrombotiques.
Activité antioxydante
L’oxydation des LDL dans l’espace sous-endothélial est considérée comme un phénomène majeur dans l’initiation et le développement de la plaque d’athérome. Les LDL oxydées contiennent de nombreux lipides oxydés toxiques tels que des peroxydes lipidiques, des aldéhydes et des oxystérols.
L’oxydation de ces derniers a lieu dans le milieu intravasculaire lorsqu’il y a un déséquilibre entre facteurs pro-oxydants tels que les radicaux libres et les facteurs antioxydants (stress oxydant). Les lipides polyinsaturés subissent dans un premier temps l’action de radicaux libres oxygénés, et notamment du radical OH., lui-même formé secondairement à la production d’anions superoxydes. Plusieurs enzymes sont impliquées dans la génération de radicaux libres oxygénés et dans la peroxydation lipidique (myeloperoxydase, NADPH (Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate) oxydase, lipoxygénase) (Yoshida & Kisugi, 2010)(Yoshida & Kisugi, 2010). La peroxydation des acides gras polyinsaturés conduit à la génération en chaîne des radicaux peroxyl et de peroxydes lipidiques et finalement, à la fragmentation des chaînes d’acides gras et à la libération d’aldéhydes qui vont interagir avec les fonctions amines des protéines. Cette forme pro-athérogène des LDL est captée par les récepteurs scavengers des macrophages, s’accumulera au sein des macrophages spumeux et aura des effets inflammatoires multiples (induction de l’expression de molécules d’adhérence par les cellules endothéliales et activation TLR-dépendante des macrophages). Les LDLox sont aussi responsables d’effets délétères tels que l’apoptose des cellules endothéliales et la rupture de la chape fibreuse via la sécrétion de métalloprotéases (Hansson et al., 2006) (Libby, 2008). Chez l’humain, il a été démontré que les LDLox peuvent également se retrouver dans la circulation sanguine où leurs taux élevés sont considérés comme un marqueur de risque des maladies cardiovasculaires (Holvoet et al., 2001) (Schwedhelm et al., 2004) (Meisinger et al., 2005). Un des effets athéroprotecteurs des HDL consiste en la prévention ou la diminution de l’oxydation des LDL.
Un des mécanismes majoritaires par lequel les HDL réduisent l’oxydation des LDL est le transfert des lipides oxydés délétères des LDL vers les HDL. Ces lipides concernent notamment les lipides hydroperoxydes (LOOH) mais aussi des phospholipides oxydés à courte chaîne (oxPL). Leur transfert se fait directement entre les monocouches de phospholipides à la surface des lipoprotéines, soit de façon spontanée soit par l’intermédiaire de protéines de transfert des lipides telles que la CETP (Vila, Korytowski, & Girotti, 2002) (Girotti, 2009) (Christison, Rye, & Stocker, 1995). Les lipides oxydés transférés aux HDL sont ensuite éliminés de la circulation via le foie, soit sous sa forme de lipide oxydé, soit sous forme de produit inactif après inactivation par les HDL (Bowry, Stanley, & Stocker, 1992). L’apoA-I est notamment capable de lier et inactiver les LOOH in vitro ainsi que in vivo après injection chez la souris ou perfusion chez l’homme (Navab et al., 2000b) (Kotosai et al., 2013). L’hydrolyse des LOOH par l’apoA-I fait appel à un processus qui implique l’oxydation de résidus méthionine de l’apoA-I et leur hydrolyse successive par des méthionine sulfoxyde réductases (Garner et al., 1998) (Panzenböck & Stocker, 2005) (Zerrad-Saadi et al., 2009). De plus les HDL transportent plusieurs enzymes anti-oxydantes telles que la PON1, PAF-AH et LCAT et la GSPx, capables d’hydrolyser les lipides oxydés (Navab et al., 2000a) (Mackness, Arrol, & Durringtorm, 1991)(Watson et al., 1995a) (A. D. Watson et al., 1995b) (Arthur, 2000) (Goyal et al., 1997). PON1 joue un rôle antioxydant important (Duell & Malinow, 1997) (Evans et al., 1997). Chez les souris invalidées pour PON1, comparées aux souris sauvages, on observe une susceptibilité accrue à l’oxydation des HDL ainsi qu’au développement de l’athérosclérose sous régime enrichi en graisses et cholestérol (Shih et al., 1998).
Les HDL petites et denses caractérisées par une concentration importante en apoA-I, une activité des enzymes PON1, LCAT et PAF-AH élevée et un ratio sphingomyéline/phosphatidylcholine faible, exercent une puissante activité antioxydante par rapport aux HDL larges et légères (telles que les HDL2) (Zerrad-Saadi et al., 2009).
Activité anti-inflammatoire
Les HDL jouent un rôle anti-inflammatoire important illustré par leurs actions multiples dont, la diminution de l’expression de molécules d’adhérence par les cellules endothéliales, l’inhibition de l’adhérence des leucocytes à l’endothélium, et l’inhibition de l’activation des leucocytes et leur infiltration dans l’espace sous-endothélial.
In vitro, dans des cellules endothéliales (HUVEC), les HDL peuvent inhiber, à des doses physiologiques, l’induction de l’expression des molécules d’adhérence VCAM-1, ICAM-1 et E-sélectine par le TNFa ou l’IL-1 (Cockerill et al., 1995). Cette capacité inhibitrice des HDL pourrait être associée à l’apoA-I lipidée et à certaines espèces de phosphatidylcholines constituants les HDL et fait appel à une activation du récepteur SR-BI et de sa protéine adaptatrice PDZK1 (PDZ-containing kidney protein 1) qui déclenche une voie de signalisation intracellulaire faisant intervenir la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) et eNOS (Figure 4) (Baker et al., 1999) (Baker et al.,2000) (Kimura et al., 2006). Les HDL ont également la capacité d’inhiber directement l’adhérence des monocytes et des polynucléaires neutrophiles à l’endothélium. Murphy et al. ont montré aussi bien sur des monocytes que sur des polynucléaires neutrophiles isolés de sang total humain, que les HDL essentiellement via l’apoA-I, diminuent l’expression de CD11b, molécule d’adhérence à la surface des monocytes et neutrophiles activés interagissant avec VCAM-1 et ICAM-1 présents à la surface de l’endothélium. Ceci a été confirmé chez l’homme où une perfusion de HDL reconstituées chez des patients atteints de maladies vasculaires périphériques induit une diminution significative de l’expression de CD11b par les leucocytes et donc une inhibition de leur activation. L’inhibition de l’expression de CD11b par les HDL et l’apoA-I fait intervenir respectivement SR-BI et l’ATP Binding Cassette A1 (ABCA1) (Murphy et al., 2008) (Murphy et al., 2011). En effet, cette étude met en relief ce que d’autres études avaient également suggéré, l’existence d’un lien mécanistique entre efflux de cholestérol des cellules vers les HDL, régulé par ABCA1, l’ATP Binding Cassette G1 (ABCG1) et SR-BI, et les propriétés anti-inflammatoires des HDL (Yvan-Charvet et al., 2010a). Par ailleurs, des études in vitro montrent que la production endothéliale de chimiokines pro-inflammatoires telles que MCP-1, et de cytokines anti-inflammatoires telles que le TGF-β (Transforming Growth Factor-β), peut être modulée par les HDL. Finalement, il est important de souligner que l’hydrolyse des lipides oxydés par l’apoA-I et les enzymes associées aux HDL (PON1, PAF-AH et LCAT), contribuent aux propriétés anti-inflammatoires des HDL, puisque les lipides oxydés jouent un rôle important dans l’inflammation liée à l’athérosclérose (Navab et al., 2004a).
Les HDL3, petites et denses ont une capacité supérieure aux HDL2 à inhiber l’expression de la molécule d’adhérence VCAM-1 par les cellules endothéliales (Ashby et al., 1998).
Activités protectrices des HDL sur l’endothélium.
L’athérosclérose est caractérisée par une perte de fonction des cellules endothéliales. Les HDL contribuent au maintien de l’intégrité et de la fonctionnalité endothéliale notamment via leur activité vasodilatatrice associée en grande partie à la stimulation de la production d’oxyde nitrique (NO) par les cellules endothéliales. Sur les cellules endothéliales, le NO participe à l’intégrité de l’endothélium en inhibant l’apoptose et stimulant la prolifération et la migration cellulaire (Cooke, 2003). Chez l’homme la perfusion intraveineuse de HDL reconstituées induit une augmentation de la vasodilatation médiée par la production endothéliale de NO et déterminée via l’augmentation du volume sanguin dans l’avant-bras en réponse à une infusion d’Acétylcholine (Ach) (Spieker et al., 2002). Les HDL stimulent la production de NO en contribuant à l’activité de l’eNOS par différents mécanismes :
– Les HDL interagissent avec SR-BI via l’apoA-I ainsi qu’avec les récepteurs S1PR1 et S1PR3 via la S1P contenue dans les HDL et induisent l’activation de la eNOS (Kimura et al., 2010) (Mineo et al., 2003) (Yuhanna et al., 2001) (Assanasen et al., 2005). L’activation de SR-BI ainsi que celle des récepteurs S1PR1/S1PR3 activent l’AMPK (AMP-activated protein kinase) qui va stimuler les acteurs phosphoinositide 3-Kinase (PI3-kinase)/Akt qui à leur tour activent la eNOS (phosphorylation de eNOS sur la sérine 1177 par Akt) (Figure 4). La liaison des HDL sur SR-BI est également capable d’induire l’activation de la eNOS par la voie de signalisation MAPK (PI3-kinase/Mitogen-Activated Protein Kinase), mais le mécanisme lié à cette voie est moins clair (Mineo et al., 2003). L’activation de la eNOS est corrélée avec l’efflux de cholestérol. L’hypothèse proposée à ce jour établit que les domaines transmembranaires C-terminaux de SR-BI joueraient un rôle comme senseurs de lipides. Les modifications de la composition lipidique membranaire induiraient un changement conformationnel des domaines C-terminaux transmembranaires de SR-BI qui se propagerait vers ses motifs d’intéraction aux domaines PDZ localisés à son extrémité C-terminal cytoplasmique, lequel, par des interactions avec les domaines PDZ N-terminaux de PDZK1, déclencherait la signalisation intracellulaire (Assanasen et al., 2005).
– L’apport de cholestérol par les HDL via SR-BI empêche l’appauvrissement en cholestérol des cavéoles par les LDLox et empêche ainsi la délocalisation et l’inactivation de la eNOS cavéolaire par les LDLox (de la Llera-Moya et al., 1999).
– Les HDL ou l’apoA-I seule, augmentent le temps de demi-vie de la eNOS via un mécanisme faisant intervenir ERK1/2 (Extracellular signal-regulated kinase 1/2) et Akt (Rämet et al., 2003).
En outre les HDL participent également à la régulation de l’apoptose des cellules endothéliales. L’équipe de A. Nègre-Salvayre, a mis en évidence, que les HDL principalement via l’apoA-I augmentent la résistance des cellules endothéliales aux effets cytotoxiques des LDLox (Suc et al., 1997). Cet effet antiapoptotique est associé à une interaction directe entre l’apoA-I et les cellules endothéliales qui permet d’inhiber l’augmentation de calcium intracellulaire associée à la cytotoxicité des LDLox. En effet, une grande partie de l’effet antiapoptotique des HDL (70%) serait attribuée à l’apoA-I (de Souza et al., 2010). Des travaux de notre équipe ont mis en évidence que l’apoA-I interagit avec l’ecto-F1-ATPase exprimée à la surface des cellules endothéliales (HUVEC) et induit une inhibition de l’apoptose induite par une privation en sérum et facteurs de croissance (Figure 4) (Radojkovic et al., 2009). La S1P transportée par les HDL en se liant sur son récepteur S1PR1, contribue également à l’effet antiapoptotique des HDL (Figure 4) (Kimura et al., 2003) (Okajima, Sato, & Kimura, 2009) (Mineo & Shaul, 2012). En outre le lysosphingolipide sphingosylphosphorylcholine (SPC) et le lysosulfatide (LSF) véhiculés par les HDL inhibent la voie mitochondriale caspase-dependante déclenchant l’apoptose. La voie de signalisation passe par l’activation de Akt qui phosphoryle BAD (Bcl-2-associated death promoter), protéine pro-apoptotique qui se dissocie alors de BCL-XL (B-cell lymphoma-extra large), et devient alors disponible pour inhiber les voies mitochondriales pro-apoptotiques (J. R. Nofer et al., 2001). Les particules HDL3, petites, denses et riches en apoA-I et S1P ont une capacité supérieure à protéger les cellules endothéliales de l’apoptose par rapport aux particules HDL2 (de Souza et al., 2010). Par ailleurs les HDL ont la capacité d’induire la survie et la migration des cellules endothéliales. Ces effets passent par l’action de la S1P transportée par les HDL sur les récepteurs S1PR1 et S1PR3 (Kimura et al., 2003). L’induction de la migration des cellules endothéliales par les HDL implique aussi le récepteur SR-BI. Lorsque le HDL se lie à SR-BI, cela induit une activation de kinases de la famille Src, qui déclenche les voies PI3K/MAPK et la voie PI3K/AKT. Ces évènements conduisent à une augmentation de l’activité de la protéine RAC qui contrôle la formation de lamellipodes qui permettront la migration endothéliale (Figure 4) (Seetharam et al., 2006). In vivo, la réendothélialisation de l’artère carotidienne suite à une agression électrique, processus impliquant la migration des cellules endothéliales, est diminuée chez les souris invalidées pour SR-BI ainsi que chez les souris invalidées pour l’apoA-I, qui possèdent des taux plasmatiques de HDL très faibles (Seetharam et al., 2006). Notre équipe a montré́que l’apoA-I, via son interaction avec l’ecto-F1-ATPase exprimée à la surface des cellules endothéliales (HUVEC), protège contre l’apoptose et induit la prolifération des cellules. L’inhibiteur de l’activité ATP hydrolase de l’ecto-F1-ATPase, l’IF1 (Inhibitory Factor 1) et des anticorps spécifiques de l’ecto-F1-ATPase, inhibent ces effets de l’apoA-I. Les anticorps dirigés contre SR-BI, inhibent quant à eux, non pas l’effet antiapoptotique et mitogène de l’apoA-I libre, mais des HDL (Radojkovic et al., 2009). En parallèle l’équipe de von Eckardstein et Rohrer a récemment montré que l’activation de l’ectoF1-ATPase par la liaison de l’apoA-I, entraîne le transport transendothélial à la fois de l’apoA-I libre et de la particule HDL, permettant aux HDL d’accéder aux macrophages spumeux de l’espace sous-endothélial (Cavelier et al., 2012) (Rohrer et al., 2006). Ce processus est dépendant de la production extracellulaire d’ADP par l’ecto-F1-ATPase et de l’activation du récepteur purinergique P2Y12, présent à la membrane endothéliale, par cet ADP. La voie de signalisation en aval de P2Y12 impliquée dans ce mécanisme n’est pas encore élucidée. De façon complémentaire, des études in vitro, suggèrent que les HDL agissent sur la différenciation et la fonctionnalité des précurseurs de cellules endothéliales EPC via l’activation de SR-BI, PI3K/akt, MAPK et eNOS (Feng et al., 2009) (Q. Zhang et al., 2010) (Sumi et al., 2007).
En conclusion, l’ensemble de ces études suggère que les HDL induisent la vasodilatation, ainsi que la survie et la migration des cellules endothéliales via des mécanismes qui impliquent notamment l’interaction des HDL avec SR-BI, l’interaction de l’apoA-I avec l’ecto-F1-ATPase et l’interaction de S1P avec les récepteurs S1PR1 et S1PR3 (Figure 4).
Le Transport Retour du Cholestérol (RCT).
Le Transport Retour de Cholestérol, est un processus au cours duquel le cholestérol excédentaire des cellules périphériques, et notamment des macrophages de l’espace sous-endothélial, est capté et estérifié au sein des HDL puis ramené au foie où il sera ensuite sécrété dans la bile sous forme de cholestérol libre ou après transformation en acides biliaires, réduisant de ce fait l’importance des lésions athéromateuses.
Ce processus de RCT joue donc un rôle majeur dans la protection vis à vis de l’athérosclérose (Rosenson et al., 2012). Dans ce contexte, il apparaît essentiel d’étudier le mécanisme du RCT allant de l’efflux de cholestérol des macrophages vers les HDL jusqu’à la captation hépatique des HDL et l’excrétion biliaire en cholestérol et acides biliaires.
La biogénèse des HDL : efflux cellulaire du cholestérol et remodelage plasmatique
Lipidation de l’apoA-I et formation des particules HDL a : rôle de ABCA1
La biosynthèse et le remodelage plasmatique des HDL sont des processus complexes qui se font en plusieurs étapes successives et font intervenir différents partenaires protéiques. La biogenèse des HDL débute par la production et la sécrétion d’apoA-I (70% par le foie et 30% par l’intestin) et dans une moindre proportion de apoA-II (par le foie). Ces apolipoprotéines acquièrent rapidement des phospholipides et du cholestérol libre des mêmes tissus qui ont permis leur synthèse via le transporteur ABCA1 retrouvé à la membrane plasmique par un mécanisme d’efflux actif (après hydrolyse d’ATP) (Cavelier et al., 2006a). ABCA1 est une glycoprotéine composée de 2 261 acides aminés, qui comporte 12 domaines transmembranaires et deux sites intracellulaires de liaison à l’ATP nécessaires à son activité. La lipidation par ABCA1 de l’apoA-I libre constitue l’étape limitante dans le maintien des concentrations plasmatiques d’HDL et cette première étape du transport retour du cholestérol est essentielle (Lee & Parks, 2005). La lipidation de l’apoA-I permet la formation des précurseurs discoïdaux HDL préβ. Ces particules préβ acquièrent du cholestérol libre et des phospholipides via l’ABCA1 présent à la surface des cellules périphériques et notamment des macrophages de l’espace sous-endothélial, contribuant ainsi à leur maturation en particules HDL a.
Le rôle du transporteur ABCA1 dans l’efflux de cholestérol cellulaire et la biogénèse des HDL a été mis en évidence en 1999, quand il a été identifié comme étant le gène muté responsable de la maladie de Tangier. A ce jour, plus de 70 mutations, affectant l’efflux de cholestérol, ont été identifiées chez l’homme (Singaraja et al., 2003). Ainsi, on retrouve des mutations affectant la maturation d’ABCA1 ou la fixation de l’apoA-I à ABCA1. Il existe 2 syndromes associés aux mutations de ABCA1 : l’hypoalphalipoprotéinemie familiale et la maladie de Tangier. Une des formes de l’hypoalphalipoprotéinemie familiale est causée par des mutations hétérozygotes de ABCA1 (forme autosomique dominante). Les patients atteints de ce syndrome ne présentent pas de symptôme clinique particulier mais peuvent présenter des taux de HDL-C et d’apoA-I diminués par rapport aux patients contrôles (Kral & Becker, 2007) (Brooks-Wilson et al., 1999) (Schaefer et al., 1980) (Couvert & Carrié, 2011). La maladie de Tangier est quant à elle causée par des mutations homozygotes ou hétérozygotes composites de ABCA1 (Mott et al., 2000) (Brunham et al., 2015). Les individus atteints de cette maladie sont notamment caractérisés par : un dépôt anormal de lipides dans plusieurs tissus ; des taux extrêmement bas de HDL-C variant entre 1% et 10% par rapport à des individus du même âge et sexe, et des faibles taux d’apoA-I (0.040 g/L) résultant d’un catabolisme accéléré de l’apoA-I libre par le rein. De plus cette maladie est caractérisée par une élévation des taux de triglycérides (>2 g/L) et une diminution des taux de LDL-Cholestérol (LDL-C) chez certains patients (Daniil et al., 2011) (Brunham et al., 2006a) (Orso et al., 2000) (Timmins et al., 2005) (Weissglas-Volkov & Pajukanta, 2010) (Singaraja et al., 2003) (Schaefer et al., 1980) (von Eckardstein, 2006). Les faibles taux de LDL-C pourraient s’expliquer par un RCT diminué pouvant modifier le métabolisme hépatique. Il est également possible que puisque les taux de HDL-C sont très bas, le transfert de cholestérol entre les HDL et les LDL/VLDL via la CETP soit diminué (Hobbs & Rader, 1999). Les symptômes de la maladie de Tangier sont divers et sont différents selon l’âge (splénomégalie, neuropathies,..) (Couvert & Carrié, 2011)(Hobbs & Rader, 1999). Le risque de développer une pathologie cardiovasculaire de façon précoce chez les patients souffrant de la maladie de Tangier existe, mais il n’est pas proportionnel à la baisse du HDL-C (Frikke-Schmidt, 2010). Les homozygotes (souffrant de la maladie de Tangier) auraient un risque augmenté d’un facteur 3 à 6 et les hétérozygotes (patients atteints d’hypoalphalipoprotéinemie familiale) un risque accru d’environ 1,5 fois (Weissglas-Volkov & Pajukanta, 2010) (Oram & Vaughan, 2006) (Serfaty-Lacrosniere et al., 1994). Toutefois, dans certaines familles porteuses on n’observe pas cette augmentation du risque (Frikke-Schmidt, 2010), ce qui pourrait s’expliquer par les faibles taux de LDL-C retrouvés chez ces patients (Schaefer et al., 1980).
Une méta-analyse de 11 études cas-témoins indépendantes, avec un total de 5 416 patients coronariens et 20 897 sujets sains, a été réalisée afin d’évaluer l’association du polymorphisme d’un seul nucléotide ou SNP (Single Nucleotide Polymorphism) rs4149313 dans le locus de ABCA1 avec le risque de maladie coronarienne (les infarctus du myocarde, les angines de poitrine instables, les revascularisations coronaires ou les dèces associés à une maladie coronarienne). Le SNP rs4149313 a été associé à un risque augmenté de maladie coronarienne dans la population asiatique, mais cette association n’a pas été retrouvée dans la population caucasienne (Fan et al., 2014). Bien que les différences des relations entre génotype et phénotype entre les ethnies soient mal comprises, une explication possible de ce résultat serait que l’ethnicité constitue une variable démographique importante contribuant au développement et à la progression des maladies coronariennes.
Les études épidémiologiques mais également de nombreuses études réalisées chez des modèles animaux montrent que ABCA1 est une protéine clé dans l’efflux du cholestérol des macrophages, le RCT et la protection contre l’athérosclérose (McNeish et al., 2000) (M. D. Wang et al., 2007) (Aiello et al., 2002) (van Eck et al., 2002) (Van Eck et al., 2006) (Yvan-Charvet et al., 2010b) (Zhao et al., 2010). L’expression d’ABCA1 est régulée à plusieurs niveaux par de nombreux acteurs comme les récepteurs nucléaires PPAR (Peroxisome Proliferator-Activating Receptor) et LXR (Liver X Receptor), ainsi que plusieurs miRNA, dont la famille des miR33 qui exercent respectivement un controle positif et négatif sur l’expression d’ABCA1. Des agonistes PPAR, des agonistes LXR ou des inhibiteurs de ces miRNA sont par conséquent quelques exemples des molécules pharmacologiques qui peuvent s’avérer intéressantes dans la prévention et/ou le traitement de l’athérosclérose. Les PPARs représentent un sous-groupe de la famille des récepteurs nucléaires incluant le PPARα, PPARγ et PPARδ. Ils régulent l’expression des gènes qui contrôlent le métabolisme lipidique en s’héterodimérisant avec d’autres récepteurs nucléaires, les Retinoid X Receptors (RXR). Le PPARγ est fortement exprimé dans le tissu adipeux où il joue un rôle dans la différenciation adipocytaire, et est également exprimé dans les macrophages, dans lesquels il sérait impliqué dans l’absorption des lipides et la formation des cellules spumeuses. Le PPARδ est fortement exprimé dans le cerveau, le tissu adipeux et le foie et joue un rôle important dans le métabolisme des acides gras. PPARα est exprimé dans le foie, les macrophages, les cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses et régule l’expression des gènes liés au métabolisme des acides gras ainsi que l’expression de nombreux gènes clés dans le métabolisme des HDL (ABCA1, Lipoprotéine Lipase ou LPL, l’apoC-III, la PLTP, l’apoA-I, l’apoA-II,…). Parmi les ligands de PPARa couramment utilisés en clinique se trouvent les fibrates (Fénofibrate, Bézafibrate, Ciprofibrate, Gemfibrosil) utilisés comme médicaments hypolipémiants (Farnier, Bonnet, Bruckert, Ferrières, & Paillard, 2006). En accord avec leur capacité d’augmenter les concentrations de HDL-C et diminuer celles de triglycérides et LDL-C (Jun et al., 2010), leurs effets sur l’incidence des maladies coronariennes semblent être plus prononcés chez des patients avec des taux de triglycérides élevés (200 mg/dL) et/ou HDL-C faibles (40 mg/dL). La thérapie à base de fibrates présente certaines limitations, telles que son efficacité qui dépend de la population ciblée (Staels, 2010). Face à cette problématique, des nombreux agonistes PPAR très sélectifs et puissants ont été développés et sont actuellement testés dans différentes phases des essai clinique : K-877 (agoniste de PPARa, phase III), GFT505 (agoniste PPAR dual a/d, phase IIb), INT-131 (agoniste de PPARg, phase II) et DSP-8658 (modulateur de PPARa/g, phase I) (Fruchart, 2013). Les agonistes LXR modulent également l’expression de ABCA1 (Larrede et al., 2009). Il existe deux isoformes du récepteur nucléaire LXR : les isoformes a et b. Parmi les gènes dont l’expression est régulée par les LXR, on retrouve des gènes impliqués dans le métabolisme du cholestérol (CETP) et le RCT (ABCA1, ABCG1, ABCG5/8 hépatique, CYP7A1) (Naik et al., 2006). Cependant les agonistes LXR sont également impliqués dans la modulation de l’expression de deux gènes clés dans la biosynthèse des acides gras, FAS (Fatty Acid Synthase) et SREBP-1c (Sterol-Regulatory Binding Protein 1c), et induisent, de ce faite, des effets secondaires dont la stéatose hépatique et l’hypertriglycéridémie (Calkin & Tontonoz, 2012). Ces effets ont notamment été attribués aux LXRa, qui sont fortement exprimés dans le foie. Afin de minimiser ces effets secondaires, les stratégies thérapeutiques actuelles se focalisent sur le développement d’agonistes sélectifs LXRb et/ou de ligands qui agissent de façon sélective dans des tissus spécifiques (Lehrke et al., 2005). BMS-852927 est un nouveau agoniste sélectif LXRb, dont l’effet chez l’homme a récemment été étudié. Chez les individus sains ou hypercholestérolémiques, le BMS-852927 induit les voies du RCT (induction des ARNm ABCA1 et ABCG1 dans le sang après un traitement de 4h) de façon similaire à celle observée chez la souris et le singe cynomolgus. Cependant, le traitement a également induit des effets sécondaires indésirables dont une augmentation des triglycérides plasmatiques et hépatiques et du LDL-C et une diminution des neutrophiles circulants qui n’avaient pas été observés chez les modèles pré-cliniques (Kirchgessner et al., 2016). Finalement les inhibiteurs de la famille de miR33 sont également capables de moduler ABCA1 et ont fait l’objet de nombreuses études (Marquart et al., 2013) (Rottiers et al., 2013). Rayner et al. ont montré l’efficacité et la tolérance d’un anti-miR33, l’oligonucléotide anti-sens modifié 2F’/MOE anti-miR33, qui chez la souris conduit à une régression de l’athérosclérose et induit l’efflux du cholestérol des macrophages au sein de la plaque, et chez des primates, des singes verts africains augmente la capacité d’efflux de cholestérol des macrophages et les taux de HDL-C (Rayner et al., 2011a) (Rayner et al., 2010) (Rayner et al., 2011b).
Maturation et remodelage des HDL.
L’efflux du cholestérol excédentaire des cellules périphériques et notamment des macrophages vers les HDL a matures nouvellement formées met en jeu deux transporteurs présents à la membrane plasmique des macrophages, ABCG1 via un efflux actif ATP dépendant, et dans une moindre mesure le récepteur CLA-1 ou son homologue murin SR-BI via un efflux passif (ne nécessitant pas d’ATP) qui pourrait impliquer le remodelage des domaines de cholestérol de la membrane cellulaire (Cavelier et al., 2006a) (de la Llera-Moya et al., 1999)(Ji et al., 1997). L’équipe du Professeur Von Eckardstein, a montré que l’efflux de cholestérol des cellules endothéliales vasculaires vers les HDL matures via ABCG1 et SR-BI, fait intervenir un processus de transcytose (transport vésiculaire d’un côté à l’autre d’une cellule) des HDL à travers les cellules endothéliales, suivi d’un processus de resécretion (Rohrer et al., 2009) (Cavelier et al., 2006b) (Rohrer et al., 2006). Les auteurs ont montré, sur des cellules endothéliales isolées d’aorte bovine, que l’invalidation de ABCG1 et dans une moindre mesure celle de SR-BI, entraînent une diminution de la transcytose des HDL, sans modification du transport paracellulaire (perméabilité de l’inuline non altérée).
La capacité d’efflux de cholestérol (CEC) des HDL à partir des macrophages mais également les activités anti-oxydantes et anti-inflammatoires des HDL sont compromises par des conditions d’inflammation aiguë ou chronique ainsi que par des conditions de décompensation métabolique. Durant l’inflammation, la synthèse des protéines inflammatoires produites par le foie augmente très rapidement, en particulier celle de la Sérum Amyloïde A (SAA), protéine véhiculée par les HDL (Malle et al., 1993). La SAA peut alors déplacer l’apoA-I de sa liaison aux HDL, altérant ainsi la CEC des HDL qui est majoritairement régulée par l’apoA-I. La SAA peut également déplacer les enzymes antioxydantes et anti-inflammatoires transportées par les HDL telles que PON1, PAF-AH et LCAT, affectant ainsi les propriétés des HDL associées à ces enzymes (Banka et al., 1995).
Les HDL nouvellement générées se retrouvent alors dans la circulation où un processus de maturation et de remodelage prend place.
Dans un premier temps, les HDL discoïdaux sont remodelées par la Lecithin Cholesterol Acyl Transferase (LCAT) qui, stimulée par son cofacteur naturel, l’apoA-I estérifie le cholestérol libre cellulaire capté par les HDL (Fielding et al., 1972). Ce dernier devient hydrophobe et va alors s’accumuler au cœur des particules HDL et augmenter leur taille, permettant la conversion des HDL discoïdaux en HDL matures sphériques, et ensuite des HDL3, particules petites et denses, en HDL2, particules larges et moins denses (Rajaram OV, 1986).
Les HDL2 vont ensuite subir l’action des diverses protéines :
– La Phospholipid Transfer Protein (PLTP) qui permet le transfert des phospholipides des VLDL et LDL vers les HDL (Tall et al., 1983) (Huuskonen et al., 2001).
– La Cholesteryl Ester Transfer Protein (CETP) qui transfère le CE, produit dans les HDL sous l’action de la LCAT, vers les LDL et VLDL en échange de leurs TG (Hopkins & Barter, 1980) (Barter et al., 2003). Son effet aboutit à la déplétion des HDL en esters de cholestérol avec un enrichissement en triglycérides conduisant à une réduction de leur taille (Lewis & Rader, 2005). Cette protéine est absente chez la souris. La CETP en transférant le cholestérol estérifié des HDL vers les LDL offre une voie alternative de retour du cholestérol au foie via le LDLR.
– La Lipase Hépatique (LH) et la Lipase Endothéliale (LE) qui hydrolysent les phospholipides et les triglycérides des HDL matures (HDL2) permettant d’obtenir : des particules HDL plus petites et plus denses appelées remnants de HDL2 (par rapport aux HDL2, perte de 60% de triglycérides et 15% de phospholipides) qui seront captées par le foie (Maugeais et al., 2003) (S. Santamarina-Fojo et al., 2004) (Annema & Tietge, 2011). La PLTP permet également la fusion de deux molécules d’HDL3 conduisant à la formation d’une particule HDL2 plus large (avec perte d’une apoA-I faiblement lipidée) (von Eckardstein et al., 1996).
La maturation des HDL est elle-même source de précurseurs de HDL : l’apoA-I libre et les pré- β HDL peuvent être générés lors de la conversion de HDL3 en HDL2 par la LH (Barrans et al., 1994), la PLTP (von Eckardstein et al., 1996) et la CETP (Liang, Rye, & Barter, 1994). Le métabolisme des chylomicrons et des VLDL permet également de générer des précurseurs d’HDL (mécanisme impliquant notamment l’hydrolyse de triglycérides).
Transport hépato-biliaire des acides biliaires.
La sécrétion canaliculaire des acides biliaires se fait via des transporteurs par un mécanisme actif, dépendant de l’hydrolyse d’ATP. Le principal transporteur des acides biliaires au niveau de la membrane canaliculaire des hépatocytes est la BSEP (Bile Salt Export Pump), également appelé ABCB11 (Figure 9) (Dikkers & Tietge, 2010). Les souris transgéniques surexprimant BSEP présentent une augmentation du flux et des sécrétions biliaires en cholestérol, phospholipides et acides biliaires, sans modification de l’expression des transporteurs hépato-biliaires de cholestérol (ABCG5/G8) et phospholipides (ABCB4), suggérant que les sécrétions biliaires en cholestérol et phospholipides sont couplées quantitativement à la sécrétion d’acides biliaires (Henkel et al., 2011). Chez la souris, la protéine MDR1 (Multidrug Resistant protein) exprimée au niveau canaliculaire des hépatocytes serait également impliquée dans le transport d’acides biliaires dans la bile, mais dans une moindre mesure que BSEP (Lam et al., 2005).
Transport hépato-biliaire du cholestérol.
ABCG5 et ABCG8 sont deux hémi-transporteurs impliqués dans le transport hépato-biliaire du cholestérol. ABCG5 et ABCG8 sont composés de 6 domaines transmembranaires et sont principalement localisés au niveau de la membrane apicale des cellules intestinales et au niveau de la membrane canaliculaire des hépatocytes. Au niveau hépatique et intestinal, l’hétérodimère ABCG5/G8 assure l’excrétion du cholestérol dans la bile et la lumière intestinale, respectivement. Il participe majoritairement à l’excrétion des stérols végétaux (Figure 9) (X. H. Yu et al., 2014). SR-BI exprimé au niveau de la membrane canaliculaire des hépatocytes serait également impliqué dans le transport du cholestérol dans la bile, mais dans une moindre mesure que ABCG5/8 (Figure 9) (Wiersma et al., 2009) (Dikkers & Tietge, 2010). Des études chez la souris ont mis en évidence que la protéine NPC1L1 (Niemann-Pick C1-like 1), exprimée au niveau de la membrane apicale de l’intestin, participe à la réabsorption intestinale du cholestérol, contrebalançant ainsi l’action de ABBG5/G8 (Figure 9). Chez la souris, NPC1L1 est uniquement exprimé au niveau intestinal, contrairement à l’homme ou NPC1L1 est exprimé au niveau du foie et de l’intestin. Afin d’étudier la contribution hépatique de NPC1L1 chez l’homme, Temel et al. ont généré des souris transgéniques exprimant NCP1L1 au niveau du foie (NPC1L1FoieTg). Les souris NPC1L1FoieTg montrent une réduction importante des sécrétions biliaires en cholestérol (>90%) sans modification des sécrétions biliaires en acides biliaires et phospholipides. Les auteurs proposent que NCP1L1 pourrait être responsable d’un retro-transport du cholestérol du canalicule biliaire vers les hépatocytes, prévenant ainsi l’excès de perte de cholestérol biliaire (Temel et al., 2007).
Transport hépato-biliaire des phospholipides.
C’est le transporteur ABCB4 (MDR2), exprimé au niveau de la membrane canaliculaire des hépatocytes, qui assure la sécrétion de phospholipides, en particulier de phosphatidylcholines, dans la bile (Figure 9). L’invalidation de ABCB4 chez la souris entraîne au niveau biliaire, une diminution des sécrétions en cholestérol et phospholipides (Elferink et al., 1996) (Kruit et al., 2005). Ces résultats sont en accord avec des études précédentes mettant en évidence que les sécrétions biliaires en cholestérol et phospholipides sont quantitativement couplées (Mazer & Martin, 1984) (Robins & Armstrong, 1976).
|
Table des matières
CHAPITRE I : LES LIPOPROTÉINES DE HAUTE DENSITÉ
1. Classification et structure
1.1. Classification
1.2. Composition
1.2.1. Protéome
1.2.2. Lipidome
1.2.3. Métabolome
1.2.4. Transcriptome
2. Les HDL et leurs fonctions
2.1. Propriétés pléiotropes des HDL
2.1.1. Activité antioxydante
2.1.2. Activité anti-inflammatoire
2.1.3. Activités protectrices des HDL sur l’endothélium
2.1.4. Propriétés antithrombotiques
2.2. Le Transport Retour du Cholestérol (RCT)
2.2.1. La biogénèse des HDL : efflux cellulaire du cholestérol et remodelage plasmatique
2.2.1.1. Lipidation de l’apoA-I et formation des particules HDL a : rôle de ABCA1
2.2.1.2. Maturation et remodelage des HDL
2.2.2. Captation hépatique du HDL-C : voies SR-BI et Ecto-F1-ATPase/P2Y13
2.2.3. L’Elimination biliaire du cholestérol
2.2.3.1. La biosynthèse des acides biliaires
2.2.3.2. Transport hépato-biliaire des acides biliaires
2.2.3.3. Transport hépato-biliaire du cholestérol
2.2.3.4. Transport hépato-biliaire des phospholipides
2.2.3.5. Le cycle entéro-hépatique des acides biliaires
2.2.4. Le transport intestinal du cholestérol
2.2.4.1. L’absorption intestinale du cholestérol
2.2.4.2. Excrétion Trans-intestinale du Cholestérol : TICE
CHAPITRE II : CAPTATION HÉPATIQUE DES HDL PAR LES VOIES SR-BI ET ECTO-F1-ATPase/P2Y13
1. Voie SR-BI
1.1. Recherche fondamentale : Fonctions, mécanismes moléculaires impliqués et régulation
1.1.1. Description du récepteur SR-BI et ses fonctions
1.1.2. Mécanisme moléculaire : Captation sélective du cholestérol estérifié
1.1.3. Régulation de l’expression de SR-BI
1.1.3.1. Régulation transcriptionnelle
1.1.3.2. Régulation post-traductionnelle
1.2. Rôles de SR-BI : l’apport des modèles animaux
1.2.1. Invalidation ubiquitaire de SR-BI
1.2.2. Invalidation ou surexpression de SR-BI spécifiquement au niveau du foie
1.2.3. Invalidation de SR-BI dans le foie dans un modèle de souris exprimant la CETP
1.3. Variants nucléotidiques du récepteur SR-BI chez l’homme
1.3.1. Mutations de SR-BI.
1.3.2. Polymorphismes de SR-BI
1.4. Perspectives thérapeutiques
2. Voie ecto-F1-ATPase/P2Y13
2.1. Découverte et mécanismes moléculaires impliqués
2.1.1. Rôle de la voie de l’ecto-F1-ATPase / P2Y13 dans l’endocytose de l’holo-particule HDL
2.1.2. La F1-ATPase : Structure, fonctions et implication dans l’endocytose des HDL
2.1.3. Le récepteur P2Y13 : caractéristiques et implication dans la voie d’endocytose des HDL
2.1.4. Régulation de l’ecto-F1-ATPase et du récepteur P2Y13
2.2. Etudes précliniques : rôle de P2Y13 dans le RCT et l’athérosclérose
2.2.1. Invalidation ubiquitaire du récepteur P2Y13
2.2.2. Activation du récepteur P2Y13.
2.3. Etudes cliniques
2.3.1. IF1 : un biomarqueur des maladies coronariennes
2.4. Perspectives thérapeutiques.
CHAPITRE III : LES HDL DANS LA PRÉVENTION ET LE TRAITEMENT DU RISQUE CARDIOVASCULAIRE : UN CHANGEMENT DE PARADIGME?
1. HDL et génétique
1.1. Mutations monogéniques et concentrations de HDL-C
1.2. Lien entre les SNPs régulant les taux de HDL-C et le risque coronarien
2. Biomarqueurs associés aux HDL et leur intérêt dans la prédiction et le traitement du risque cardiovasculaire
CHAPITRE IV : RÉSULTATS EXPÉRIMENTAUX
1. Introduction générale
2. Rôle du récepteur P2Y13 dans le développement de l’athérosclérose dans le modèle murin pro-athérogène, apoE-/-
2.1. Article 1
2.2. Matériel et méthodes
2.3. Résultats.
2.4. Discussion.
3. ARTICLE 2 : CONTRIBUTION DES RECEPTEURS SR-BI HEPATIQUE ET P2Y13 DANS LE METABOLISME HEPATO-BILAIRE DU CHOLESTEROL ET LE DEVELOPPEMENT DE L’ATHEROSCLEROSE
3.1. Introduction
3.2. Matériel et méthodes
3.3. Résultats
3.4. Discussion
4. Conclusion générale
5. Perspectives
5.1. Finalisation de la mise en évidence des contributions respectives de P2Y13 et SR-BI hépatique dans le métabolisme du HDL-C et le développement de l’athérosclérose.
5.1.1. Analyse de l’expression génique hépatique et intestinale
5.1.2. Evaluation du RCT hépato-biliaire, du TICE et de l’absorption intestinale
5.2. Récepteurs SR-BI et P2Y13 comme cibles potentielles pour lutter contre l’athérosclérose.127
BIBLIOGRAPHIE
Télécharger le rapport complet
