Les facteurs de croissance chondrogéniques

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Les laminines et les nidogènes

Les laminines sont des hétérotrimères composées de trois chaînes  parmi les 5 chaînes , 3 chaînes  et 3 chaînes  actuellement identifiées, donnant naissance à 15 isoformes de laminine différentes d’expression spatiale ou temporelle spécifique. Les chaînes se trimérisent grâce à leurs domaines C-terminaux qui forment le bras long des laminines. Les bras courts des laminines sont constitués des domaines N-terminaux libres des trois chaînes et sont nécessaire à la polymérisation des laminines dans la membrane basale (figure 11). Le bras long des laminines (Laurie et al. 1986), plus précisément le module E3 C-terminal de la chaîne  (Battaglia et al. 1992) interagit avec les chaînes HS du domaine I (Sasaki et al. 1998) ou du domaine V du perlecan (Friedrich et al. 1999). Une affinité plus faible est observée entre les chaînes HS du perlecan et le fragment N-terminal V/VI de la chaîne 1 des laminines.
Il existe deux types de nidogènes 1 et 2, également appelés entactines 1 et 2. Ces nidogènes sont présents dans de nombreux tissus : coeur, muscle squelettique, nerfs, cerveau, vaisseaux, poumon, rein, pancréas et rate. Ils favorisent l’attachement cellulaire, l’angiogenèse et jouent un rôle important dans la formation des membranes basales. Malgré la faible homologie de séquence protéique entre les nidogènes 1 et 2 (de seulement 27% chez la souris), les nidogènes conservent la même structure. Ils sont composés de trois modules globulaires (G1 à G3), avec une région de liaison entre chaque module (figure 11). Les nidogènes, via le module G3, interagissent avec la laminine 1, avec une affinité beaucoup plus forte pour le nidogène 1 que le nidogène 2. Le perlecan, via son domaine IV ou V, interagit très fortement avec le domaine G2, et plus faiblement avec le domaine G3 des nidogènes 1 et 2 (Battaglia et al. 1992; Brown et al. 1997; Hopf et al. 1999). Plus précisément, les boucles B/C et F/G du module IgG3 du domaine IV du perlecan interagissent très fortement avec les nidogènes 1 et 2, alors que seul le nidogène 1 va interagir avec la boucle D/E (Hopf et al. 2001). L’interaction avec les nidogènes 1 et 2 est également possible via le module LG2 du domaine V du perlecan (Friedrich et al. 1999). Cela permet donc la formation de trimères perlecan-nidogène-laminine, qui pourraient être important pour le renforcement de l’organisation structurale des membranes basales.

Fibronectine – Fibuline – Fibrilline

La fibronectine est une glycoprotéine homodimérique présente dans les membranes basales et importante pour l’adhésion cellulaire. Elle interagit avec les chaînes HS et le domaine IV du perlecan (Battaglia et al. 1992; Hopf et al. 1999) avec une forte affinité pour les module IgG4 et une plus faible pour les module IgG5, IgG10 à 15 du perlecan (Hopf et al. 2001). Les fibulines sont des protéines des membranes basales impliquées dans l’adhésion et la prolifération cellulaire (Timpl et al. 2003). Cette famille est composée de cinq membres : les fibulines 1 à 5. Le perlecan, via son domaine IV (Brown et al. 1997; Hopf et al. 1999), plus spécifiquement le module IgG2, et plus faiblement les modules IgG 3, 4, et 13 à 15, interagit avec la fibuline 2 (Hopf et al. 2001). De façon intéressante, on peut noter que le pont disulfure se formant entre les deux Cys présentes dans les modules IgG1 et IgG19 du perlecan humain (IgG1 et IgG12 du perlecan murin) rapproche les deux sites d’interaction avec la fibronectine et la fibuline, permettant sans doute la formation d’une structure plus compacte. La fibuline 2 interagit également avec les modules EG3 et 4 du domaine V du perlecan (Friedrich et al. 1999).
Le perlecan interagit avec la fibrilline 1 (Tiedemann et al. 2005). Cette glycoprotéine est le composant principal des microfibrilles, agrégats supramoléculaires présents dans de nombreuses matrices extracellulaires qui couvrent la surface des cellules élastiques de certains organes tels que les muscles squelettiques, la peau, les vaisseaux sanguins…). Elle consiste en une répétition de modules cbEGF (calcium binding epidermal growth factor). Le plus long module central interagit avec le domaine II du perlecan, et avec une affinité moins grande avec les chaînes HS du domaine I. La fibronectine, également associée aux microfibrilles au début de leur biogenèse, n’interagit pas avec la fibrilline 1. Le perlecan pourrait alors jouer le rôle d’un pont entre la fibronectine et la fibrilline 1 et ainsi être impliqué dans la biogenèse des microfibrilles. Il pourrait également servir à ancrer les microfibrilles aux membranes basales.

Les protéines spécifiques de la matrice cartilagineuse

L’ECM1 (extracellular matrix protein 1) est une glycoprotéine secrétée, impliquée dans la formation des os et l’angiogenèse. Elle est constituée d’un domaine N-terminal, de deux domaines centraux et d’un domaine C-terminal. C’est ce dernier qui interagit avec les modules EG du domaine V du perlecan (Mongiat et al. 2003). Ces deux molécules sont notamment co-exprimées dans les vaisseaux sanguins et les os en développement, et cette interaction pourraient donc jouer un rôle dans l’angiogenèse et la formation endochondrale des os. La protéine WRAP est exprimée spécifiquement par les chondrocytes, et joue un rôle dans l’assemblage et le maintien des structures cartilagineuses (Allen et al. 2006). Le domaine III-2 et les chaînes HS du perlecan interagissent avec une grande affinité avec cette protéine.

Les autres protéines des membranes basales et matrices extracellulaires

L’héparine interagit avec le domaine IV du perlecan (Brown et al. 1997; Hopf et al. 1999), plus précisément le module IgG5 dans lequel les résidus Arg 1973, 1977, 2005 et 2007 jouent un rôle très important (Hopf et al. 2001), mais aussi via les modules EG1 et EG2 du domaine V (Friedrich et al. 1999). Le perlecan pourrait donc interagir via ces domaines avec les autres HSPGs des membranes basales. Le perlecan peut se dimériser, voire former des trimères ou des tétramères par des liaisons non covalentes au niveau du domaine V (Yurchenco et al. 1987; Brown et al. 1997). Le perlecan interagit aussi avec les sulphatides via son domaine V, impliquant au moins 2 modules LG, ce qui pourrait avoir un rôle dans l’adhesion cellulaire (Friedrich et al. 1999).
La thrombospondine 1 (TSP-1) est une protéine de la matrice extracellulaire impliquée dans la coagulation, l’adhésion, la migration et la prolifération cellulaire. Ces diverses activités biologiques résultent de l’interaction de cette protéine avec des récepteurs cellulaires, notamment l’intégrine V3. Le perlecan interagit avec TSP-1 via ses chaînes HS, jouant un rôle de co-récepteur pour lier et concentrer la TSP-1 à la surface cellulaire (Vischer et al. 1997; Feitsma et al. 2000).

Les facteurs de croissance chondrogéniques

Le BMP-2 (Bone morphogenetic Protein 2) est un facteur de croissance de la famille des TGFs. Il se présente sous la forme d’un homodimère. Il induit la formation du cartilage et de l’os et joue un rôle dans la différenciation des ostéoblastes. Il possède en N-terminal un motif de 10 acides aminés basiques, chargé positivement, qui interagit avec l’héparine et les chaînes HS des protéoglycanes tels que le perlecan (Ruppert et al. 1996; Yang et al. 2006). Le perlecan interagit également avec un autre facteur de croissance spécifique des chondrocytes : le CTGF/Hcs24 (connective tissue growth factor/hypertrophic chondrocyte-specific gene product 24) via ses chaînes HS et le corps de la protéine. Le complexe perlecan-CTGF forme un trimère avec les intégrines (notamment , 1 et 3) pour stimuler la prolifération et la différenciation des chondrocytes via les voies des MAP Kinases p42/44 et p38, respectivement (Nishida et al. 2003).

Les facteurs de croissance tumorigéniques

Plus récemment, il a été montré que le perlecan liait la progranuline via les modules LG1-EG1-EG2 du domaine V (Gonzalez et al. 2003). La progranuline est un facteur de croissance présent dans les tumeurs et les zones de cicatrisation. Elle est composée de 7,5 répétitions (A à G + P) appelées granulines, qui sont chacune composées de 12 Cys. Les répétitions B et F interagissent avec le perlecan. Cette interaction stimule la croissance cellulaire in vitro. Ces deux protéines sont exprimées dans les tumeurs ovariennes et dans les vaisseaux sanguins, suggérant un rôle de cette interaction dans le développement des tumeurs et dans l’angiogénèse in vivo.
L’angiopoïétine existe sous trois formes : incorporée dans la matrice extracellulaire (Ang1), secrétée (Ang 2) et présente à la surface cellulaire (Ang3). L’angiopoïétine 3 inhibe l’angiogenèse et la progression des métastases, alors que l’angiopoïétine 1 a un rôle inverse.
Le perlecan interagit avec le domaine coiled-coil de l’angiopoïétine 3 via ses chaînes HS, potentialisant son action (Xu et al. 2004).

Fonctions du perlecan

Grâce à son expression ubiquitaire et précoce au cours du développement, et de ces multiples interactions, le perlecan assure de multiples fonctions. Cependant, je ne détaillerai ici que ses fonctions dans le cartilage et le muscle, les deux tissus les plus sévèrement affectés dans le SJS.

Dans le cartilage

La chondrogenèse

Deux mécanismes de formation des os existent : l’ossification intramembranaire (crâne et clavicules) et l’ossification endochondrale (tous les os longs). L’ossification endochondrale (figure 12) utilise une matrice de cartilage pour la formation des os (Erlebacher et al. 1995). Ce processus commence avec le regroupement de cellules mésenchymateuses dans la région du futur os (Kronenberg 2003). Ces cellules se différencient en chondroblastes qui synthétisent une matrice cartilagineuse, puis en chondrocytes qui synthétisent notamment le collagène II, marqueur précoce de la chondrogenèse, formant le centre d’ossification primaire. Les cellules de la bordure de ce cartilage forment le perichondrium. Puis, les chondrocytes arrêtent de proliférer, deviennent hypertrophiques et forment une matrice riche en collagène X, minéralisée ensuite avec du calcium. Ces chondrocytes pris au piège de leur matrice meurent par apoptose, laissant derrière eux une matrice vide qui est alors envahie par les vaisseaux sanguins. Les cellules du perichondrium se différencient en ostéoclastes et ostéoblastes, qui atteignent la matrice cartilagineuse via les vaisseaux sanguins, et la transforment en réelle structure osseuse. Alors que l’os grandit, des centres d’ossification secondaires se développent au niveau des épiphyses. De part et d’autre de la diaphyse, les chondrocytes continuent à proliférer dans une région appelée plaque de croissance (figure 13). Cette plaque de croissance est organisée en différentes zones, selon l’état de développement des chondrocytes : une zone de réserve où les chondrocytes sont latents et désorganisés, une zone de prolifération où les chondrocytes sont organisés en colonnes, une zone d’hypertrophie où les chondrocytes deviennent matures et s’hypertrophient, puis les zones de calcification et enfin d’ossification, qui rejoignent la diaphyse. Cette plaque de croissance se réduit avec l’âge et disparaît à l’adolescence.

Composition du cartilage

Le cartilage est principalement composé de fibres de collagène, qui lui confèrent son élasticité (Knudson and Knudson 2001). Bien que le cartilage ne possède pas de réelle matrice extracellulaire, les chondrocytes secrètent de nombreux protéoglycanes (versican, decorin, biglycan, fibromodulin, syndecan) (Schwartz and Domowicz 2002). Le protéoglycane majeur du cartilage est l’aggrecan, composé de 3 domaines globulaires, deux régions hydrophiles et de plus d’une centaine de sites d’attachement de chaînes GAG, qui sont pour 99,9% des chaînes chondroïtine sulfate (Govindraj et al. 2002). Il retient les molécules d’eau et joue un rôle de résistance à la compression (Melrose et al. 2005). Le perlecan est le principal héparane sulfate protéoglycane du cartilage, présent sous une forme particulière substituée avec 25% de chaînes héparane sulfate et 75% de chaînes chondroïtine sulfate (Govindraj et al. 2002).

Rôles du perlecan

Le perlecan est un acteur crucial de la chondrogenèse. In vitro, le perlecan, via son domaine I et ses chaînes HS ou CS, est suffisant pour induire l’agrégation des cellules mésenchymateuses et leur différenciation en chondrocytes (French et al. 2002). Néanmoins, in vivo, il apparaît après le collagène II et ne semble donc pas nécessaire à l’initiation de la chondrogenèse (French et al. 1999). Seul, il ne peut pas non plus induire la maturation des chondrocytes en chondrocytes hypertrophiques, ni leur différenciation finale menant à leur apoptose (Gomes et al. 2002). Son rôle serait donc de favoriser la prolifération, la différenciation et la maturation des cellules mésenchymateuses en chondrocytes (Melrose et al. 2002; Melrose et al. 2003; Gomes et al. 2006), probablement grâce à sa fonction de co-recepteur de facteurs de croissance (Hassell et al. 2002; Ornitz and Marie 2002). Le perlecan contrôle la biodisponibilité des FGFs : les chaînes HS vont plutôt agir comme un réservoir de FGF2, le séquestrant loin de son récepteur (Govindraj et al. 2006) alors que les chaînes CS vont inhiber l’interaction FGF-perlecan (Smith et al. 2007). Le récepteur principal des FGFs dans le cartilage est le FGFR3, présent dans les chondrocytes en prolifération, bien que les récepteurs FGFR1 et FGFR2 soient également présents dans les chondrocytes hypertrophiques et les cellules mésenchymateuses, respectivement. Le FGFR3 est un régulateur négatif de la prolifération cellulaire (Deng et al. 1996) en stimulant les voies STAT1 (inhibition de la prolifération) et les voies MAPK (différenciation) (Barnard et al. 2005). Le perlecan permettrait donc la prolifération cellulaire des chondrocytes en séquestrant le FGF-2, empêchant ainsi son interaction avec le FGFR3 et l’inhibition de la prolifération.
In vitro, l’interaction du perlecan avec le facteur de croissance BMP-2 permettrait d’induire la maturation et la différenciation terminale des chondrocytes (Gomes et al. 2003). Le perlecan joue un rôle dans l’adhésion des chondrocytes et l’agrégation des cellules mésenchymateuses en régulant les interactions cellules-matrice (DeLise et al. 2000) via les intégrines et leurs voies de signalisation (Terpstra et al. 2003). Le collagène est un élément essentiel à la croissance et au développement du cartilage (Talts et al. 1998). Le perlecan, en stabilisant les fibres de collagène, jouerait également un rôle important dans l’organisation du cartilage. In vitro, il aide à la formation des fibres de collagène (Kvist et al. 2006), et interagit in vivo avec les fibres de collagène type I et II (Yang et al. 2005; Yang et al. 2006). Enfin, le perlecan est exprimé au niveau des vaisseaux qui envahissent le cartilage, et joue un rôle important dans cette vascularisation (Melrose et al. 2004), qui est essentielle pour la nutrition et le développement des os, des articulations et du centre d’ossification secondaire. Dans le SJS, le perlecan ne pourrait donc pas jouer son rôle d’organisation et de maintien du cartilage, menant à une désorganisation des chondrocytes et de la plaque de croissance et à une croissance défectueuse des os longs.

L’organisation d’une fibre musculaire

Les fibres musculaires possèdent un cytoplasme appelé sarcoplasme et une membrane appelée sarcolemme, qui présente des invaginations profondes appelées tubules T, associés avec deux citernes de réticulum sarcoplasmique, ce qui forme la triade. Le cytosquelette contient des myofibrilles, composées de fins filaments d’actine et de filaments plus épais de myosine, organisées en unités sarcomériques. Chaque sarcomère est limité par une strie Z de chaque côté, qui ancre les filaments d’actine. L’actine est produite sous forme monomérique globulaire, qui peut se polymériser pour former des chaînes linéaires. Chaque filament fin est composé de 2 chaînes d’actine en double hélice, associées à des molécules de tropomyosine (protéine allongée, logée au creux des sillons de la double hélice) et de troponine (aux extrémités de chaque molécule de tropomyosine) (figure 15A). Les molécules de myosine sont composées de 4 chaînes légères et de 2 chaînes lourdes (MyHC). Une chaîne lourde possède une queue C-terminale, qui permet l’association des molécules de myosine entre elles, et d’une tête globulaire N-terminale qui se lie aux filaments d’actine. Plusieurs centaines de molécules de myosine s’associent pour former un filament épais (figure 15B). La partie centrale de ces filaments, dépourvue de têtes globulaires, délimite la bande M. Il existe différents types de fibres selon le type MyHC qu’elles expriment : les fibres de type I expriment la MyHC1 et les fibres de type II les MyHC2. Les fibres de type I, dites fibres lentes, sont stables et résistantes à la fatigue, utilisées pour les exercices de longue durée et ont un métabolisme oxydatif. Les fibres de type II, dites fibres rapides, très puissantes mais fatigables et utilisées pour les efforts brefs et intenses, ont un métabolisme glycolytique. La composition en type de fibres dépend du muscle (le soléaire contient une majorité de fibres de type I, alors que le tibialis anterior (TA) et l’extensor digitorum longus (EDL) contiennent une majorité de fibres de type II) et de son état (en cas de dénervation par exemple, ni l’EDL, ni le soléaire ne contiennent de fibres de type I, alors qu’en cas de réinervation, le soléaire n’exprime pratiquement que des fibres de type I) (Jin et al. 2004; Kalhovde et al. 2005).

Rappel sur le mécanisme de contraction

Lors de l’arrivée d’un message nerveux, les récepteurs nicotiniques à l’acétylcholine (voir chapitre III. La jonction neuromusculaire), qui sont des canaux cationiques non sélectifs, vont provoquer l’entrée d’ions et la dépolarisation locale de la membrane musculaire. Cette dépolarisation locale active les canaux sodiques sensibles au voltage, générant ainsi un potentiel d’action qui se propage le long du muscle et atteint notamment les triades. Cette dépolarisation est à l’origine du couplage excitation-contraction, via l’ouverture des canaux calciques récepteurs à la ryanodine (RyR) situés dans la membrane du réticulum sarcoplasmique. Les ions calcium stockés dans ce réticulum sont libérés massivement dans le sarcoplasme, entraînant une augmentation très importante de calcium intracellulaire à proximité des myofibrilles. La liaison de ce calcium sur la troponine entraine un changement de conformation de cette molécule et un déplacement de la tropomyosine qui libère ainsi les sites de liaison de la myosine sur l’actine. Le glissement des filaments de myosine et d’actine entre eux provoque le rapprochement des stries Z de toute la cellule, et donc un raccourcissement global de sa taille : c’est la contraction (figure 15C).

Rôle du perlecan

Le profil d’expression du perlecan dans le muscle, exprimé dans le myoblaste, mais plus dans le myotube, peut suggérer un rôle du perlecan dans la myogenèse (Larrain et al. 1997). Le perlecan interagit avec et concentre les facteurs de croissance tels que le TGF et les FGF, qui sont des facteurs clefs pour la myogenèse (Pirskanen et al. 2000), stimulant la division, mais inhibant la différenciation (Brunetti and Goldfine 1990). Le perlecan pourrait donc jouer un rôle dans la prolifération des myoblastes (Sanes 2003). L’adhesion des myoblastes en culture sur un substrat de collagène IV est inhibée par un traitement avec du perlecan (Villar et al. 1999). Le perlecan, via ses interactions avec le collagène IV, joue donc également un rôle dans l’adhésion des myoblastes en culture.
Dans le muscle squelettique adulte, chaque fibre est entourée d’une membrane basale, l’endomysium, qui englobe également les quelques cellules musculaires souches appelées cellules satellites, présentes et nécessaires à la régénération musculaire. Les fibres sont regroupées par faisceau, recouvert d’une autre membrane basale, le périmysium (figure 16).
Les composants principaux de l’endomysium sont le collagène IV et la laminine 2, qui jouent un rôle important dans l’élasticité de la fibre nécessaire au mécanisme de contraction-relâchement. La membrane musculaire contient un complexe glycoprotéique particulier, le DGC (dystrophin-glycoprotéine complex) (figure 17), est notamment composé du dystroglycan, qui joue un rôle de pont entre la membrane basale (DG se lie à la laminine 2) et le cytosquelette (DG se lie à la dystrophine) pour stabiliser le sarcolemme (Sanes 2003). Le perlecan interagit avec l’-DG, et de par ses multiples interactions avec les composants de la matrice (Iozzo et al. 1994), notamment laminine 2 et collagène IV, il pourrait jouer un rôle dans l’organisation de la membrane basale musculaire (Timpl 1993).

Fonctions de Trol

Trol semble requis dans l’activation de la prolifération des neuroblastes quiescents bloqués en G0, en stimulant la transition G1-S. La façon dont Trol régule cette transition a été étudiée et plusieurs protéines dans différentes voies de signalisation semblent impliquées. Evenskipped (eve), un gène à homéodomaine, régulateur de transcription, semble être inclus dans la même voie de signalisation que trol (Park et al. 1998). Trol semble également initier la division des neuroblastes en relevant l’arrêt du cycle cellulaire causé par Anachronism (Ana) (Datta 1995). Une voie de signalisation menant à la transition G1-S semble particulièrement impliquée car trois protéines présentes dans cette voie sauvent le phénotype des mutants trol : la phosphatase String (cdc25), la cycline E et le facteur E2F (figure 19) (Caldwell and Datta 1998; Park et al. 2003). Enfin, Trol interagit avec brancheless (orthologue de FGF2) et hedgehog (Park et al. 2003). Le nombre élevé de différents allèles et phénotypes liés à Trol et ses nombreuses interactions et implications dans différentes voies de signalisation, font de Trol une protéine complexe en terme de structure et de régulation, et semblent indiquer qu’il fait partie d’un mécanisme beaucoup plus général dans le contrôle de la prolifération cellulaire au cours du développement, et non restreint aux lobes optiques. L’invalidation de l’orthologue du perlecan dans ce modèle souligne donc le rôle du perlecan dans les voies de signalisation cellulaire.

Le nématode Caenhorabditis elegans

Structure et régulation de Unc-52

Le nématode a été le premier modèle animal chez lequel un mutant du perlecan a été décrit. L’orthologue du gène HSPG2 est le gène uncoordinated-52 (unc-52), ainsi nommé à cause du phénotype paralysé des mutants (Rogalski et al. 1993). Le gène unc-52 est compose de 37 exons. La structure de la protéine UNC-52 est similaire à celle du perlecan, malgré quelques différences (figure 18). Le domaine I est très petit (28 acides aminés, riche en acide aspartique) et est unique à UNC-52. Le domaine II consiste en 3 motifs LDL-R et 2 motifs IgG. Le domaine III montre 43% d’homologie avec le perlecan murin et consiste en une succession de modules LE et L4. Le domaine IV est composé d’une répétition de 15 motifs N-CAM et contient une séquence Arg-Gly-Asp d’adhésion cellulaire dans la répétition 12. Le domaine V contient trois modules LG et trois modules EG et une séquence supplémentaire de 180 acides aminés riches en sérines et thréonines non présentes chez les mammifères (Mullen et al. 1999). De façon intéressante, trois isoformes sont exprimées par épissage alternatif grâce à des sites de polyadénylation différents, situés après les exons 10, 26 et 37 : un petit (DI à DIII, 1160 acides aminés), un moyen (DI à DIV, 2482 acides aminés, 270kDa) et un long (DI à DV, codant pour une protéine totale de 3375 acides aminés et de 370kDa) (figure 20). Il existe également des épissages alternatifs de certains exons des domaines III et IV (exons 6, 16, 17, 18, 21, 22) (Rogalski et al. 1995), produisant des isoformes supplémentaires. Ces évènements d’épissages alternatifs du gène Unc-52 sont contrôlés par des protéines telles que MEC-8 et SMU-1 et 2. Le gène Mec-8 code pour une protéine de 312 acides aminés, contenant deux motifs de reconnaissance ARN de 80 acides aminés chacun (Lundquist et al. 1996). Elle est exprimée dans les noyaux des cellules de l’hypoderme (Spike et al. 2002). Elle régule l’épissage alternatif de certains isoformes d’unc-52, favorisant la production des ARNm contenant les exons 15-16-19 (excision des exons 17 et 18) ou 15-16-17-19 (excision de l’exon 18) (Lundquist and Herman 1994). Les protéines nucléaires SMU-1 (contenant 5 motifs WD impliqués dans les interactions protéiques) et SMU-2 sont des composants du spliceosome, où elles interagissent entre elles pour inhiber l’épissage de l’exon 17 (Spike et al. 2001; Spartz et al. 2004).

Invalidation du gène Hspg2

De façon à étudier le rôle du perlecan in vivo chez les mammifères, différents modèles de souris déficientes pour le perlecan ont été générés depuis quelques années. Deux invalidations totales du perlecan ont été réalisées au même moment par deux laboratoires différents : un en insérant une cassette PGK-Néo dans l’exon 7 du perlecan (Arikawa-Hirasawa et al. 1999) et l’autre en insérant une cassette similaire mais flanquée de deux séquences loxP dans l’intron 5 et une séquence loxP supplémentaire dans l’intron 6 (Costell et al. 1999) (figure 22). Les séquences loxP sont des séquences palindromiques de 34 nucléotides, qui se recombinent en présence de Cre recombinase. La délétion d’une partie des introns 5 et 6 et de la totalité de l’exon 6 est donc obtenue, menant à une protéine tronquée et détruite. Dans les deux cas, une absence totale de perlecan secrété et une létalité embryonnaire des homozygotes mutants sont retrouvées, alors que les hétérozygotes sont normaux. Dans le premier modèle (Arikawa-Hirasawa et al. 1999), 40% des embryons meurent au stade embryonnaire E10.5 avec des anomalies du développement céphalique comprenant un sous-développement du prosencéphale et du rhombencéphale. Au stade E14.5, 6% des embryons montrent une exencéphalie. Les embryons survivants meurent au stade périnatal et montrent de nombreuses anomalies osseuses telles que des anomalies crâniofaciales, un thorax étroit et des membres arqués. L’ossification endochondrale est anormale et la plaque de croissance est désorganisée, avec une diminution de la prolifération des chondrocytes et de leur organisation en colonnes. Le second modèle (Costell et al. 1999) montre un développement normal des embryons jusqu’à E9.5, mais 70 à 80% des embryons meurent entre E10.5 et E12.5, à cause d’anomalies cardiaques (ruptures locales dans la couche de cardiomyocytes et membrane basale fine menant à des hémorragies) et d’anomalies céphaliques (ruptures de la membrane basale menant à une fuite des cellules neuroépithéliales dans l’ectoderme). Les 20 à 30% d’embryons survivants meurent entre E15.5 et la naissance, avec des microanévrismes dans plusieurs organes et une sévère ostéochondrodysplasie (nanisme, crâne vouté, membres et colonne vertébrale courts). La plaque de croissance est également anormale, avec une absence de minéralisation et une orientation transversale des zones d’ossification. Le cartilage montre une désorganisation du réseau de collagène, et des fibrilles plus courtes. Ces embryons souffrent également d’une transposition des gros vaisseaux (Gonzalez-Iriarte et al. 2003). En effet, l’aorte est normalement positionnée dorsalement par rapport à la veine pulmonaire. Chez les mutants, l’aorte et la veine pulmonaire sont côte à côte et les artères coronaires sont échangées, l’artère coronaire gauche provenant du sinus de Valsalva droit et inversement. Tous ces résultats confirment in vivo un rôle crucial du perlecan dans la maintenance, mais pas dans la formation, des membranes basales notamment celles soumises à un stress mécanique (cerveau et coeur), et un rôle important dans l’organisation et la maturation des chondrocytes lors de la chondrogenèse, mais pas dans ses premières étapes (condensation et différenciation du mésenchyme) (Olsen 1999).

Modèles hypomorphes

Deux modèles viables de souris mutantes pour le perlecan ont été récemment générés (figure 22). Dans le premier modèle, l’exon 3 du gène Hspg2, qui contient les sites d’attachement des chaînes HS, a été remplacé par une cassette PGK-Néo (Rossi et al. 2003). Le perlecan produit ne possède donc pas de chaînes HS, mais tout le corps de la protéine est normal. Les mutants homozygotes montrent un développement normal, mais ils développent une cataracte et une microphtalmie avec des anomalies du cristallin. Les fibres composant le cristallin sont désorganisées, gonflent et se liquéfient, des vacuoles se forment et transforment le cristallin en une masse amorphe. Avec l’âge, la paroi du cristallin, membrane basale fine et spécialisée, se rompt et les fibres dégénèrent. Ce résultat est en accord avec le rôle du perlecan dans la maintenance des membranes basales. Ces mutants montrent également une cicatrisation difficile et un retard dans le développement de tumeurs, lié à un développement altéré des vaisseaux sanguins (Zhou et al. 2004). Enfin, le développement et la structure du rein des mutants sont normaux, mais en conditions pathologiques de surdose de protéine, on observe une protéinurie beaucoup plus élevée que chez les animaux sauvages (Morita et al. 2005). In vivo, le perlecan, via ses chaînes HS, joue donc un rôle important dans la stimulation de l’angiogenèse et la vascularisation et dans la formation de la barrière de filtration des glomérules rénaux.
Le second modèle a été généré par l’insertion de la mutation faux-sens c.4595G>A (p.Cys1532Tyr) décrite dans une famille SJS (Nicole et al. 2000) dans l’exon 36 du gène Hspg2 et d’une cassette de sélection PGK-Néo dans l’intron 36 (Rodgers et al. 2007). Les homozygotes mutants de cette lignée (C1532YNéo) sont viables, mais montrent des défauts locomoteurs avec des mouvements exagérés des hanches, ainsi que des anomalies faciales avec un museau plat et des petits yeux. Une étude détaillée du phénotype chondrodystrophique a été menée. Les os longs (fémur, humérus) sont épais et de forme irrégulière, les articulations sont irrégulières, les côtes et le sternum sont projetés en avant et la colonne vertébrale montre un défaut d’ossification. La plaque de croissance est désorganisée, surtout au niveau des zones de prolifération et d’hypertrophie, avec un nombre réduit de chondrocytes. Les zones d’ossification sont orientées transversalement à l’axe longitudinal de l’os. L’établissement du centre d’ossification secondaire est retardé. Ces résultats confirment un rôle du perlecan dans la chondrogenèse et l’organisation de la plaque de croissance. Ce phénotype chondrodystrophique est similaire à celui observé chez les patients SJS. Cependant, aucun phénotype neuromusculaire n’est observé. Une seconde lignée de mutants (C1532Y) a été générée à partir de la lignée C1532YNéo, dans laquelle la cassette de sélection Néo a été délétée. Les homozygotes mutants sont viables et ne sont que faiblement affectés : ils montrent une désorganisation mineure des différentes zones de la plaque de croissance et des chondrocytes hypertrophiques plus gros. La différence de phénotype entre ces deux lignées serait expliquée par la présence d’un taux normal de perlecan dans la lignée C1532Y, alors que la protéine est pratiquement absente dans la lignée C1532YNéo. Cette diminution du taux de protéine serait liée à une diminution du taux de transcrits perlecan, médiée par l’effet de la cassette PGK-Néo sur l’excision-épissage du gène. L’effet de dose est donc ici clairement démontré pour le perlecan murin.

La jonction neuromusculaire (JNM) et pathologies associées

La jonction neuromusculaire adulte est constituée de trois types cellulaires : le nerf terminal, qui correspond à l’extrémité du motoneurone, les cellules de Schwann terminales (CSTs), qui entourent le nerf terminal, et l’élément post-synaptique, correspondant à une partie spécialisée de la fibre musculaire (figure 23). De plus, la membrane basale présente dans la fente synaptique est spécialisée, faisant ainsi partie intégrante de la JNM.

Le développement de la JNM

La synaptogenèse est le processus durant lequel la JNM se construit, pour mener à l’élaboration de la structure organisée avec ses trois composants, responsable de la transmission synaptique. Les trois composants ont des origines tissulaires différentes : les cellules musculaires viennent du mésoderme, le nerf provient de la portion ventrale du tube neural et les CSTs sont dérivées des crêtes neurales provenant de la portion dorsale du tube neural. Ces composants doivent donc migrer et se différencier pour former la JNM.

La différenciation présynaptique

Avant même le contact avec le muscle, le nerf est capable de sécréter le neurotransmetteur acétylcholine (ACh) en réponse à une stimulation électrique. Le contact du nerf avec le muscle se fait immédiatement après la fusion des myoblastes pour générer les myotubes (vers E12 chez la souris). Le nerf terminal commence alors sa spécialisation chez l’embryon en prenant la forme d’un gros bouton terminal. Après la naissance, le bouton terminal se différencie : le nombre de vésicules synaptiques augmente et les éléments du cytosquelette axonal sont perdus. Des zones denses apparaissent au niveau de la membrane nerveuse qui fait face au muscle et où les vésicules synaptiques s’agrègent : ce sont les zones actives. Le nerf terminal grossit et devient polarisé (Sanes and Lichtman 1999; Fox et al. 2007) (figure 24A). Chaque fibre musculaire est tout d’abord polyinnervée, mais au cours du développement post-natal, toutes les branches terminales sauf une se rétractent pour laisser une innervation unique à chaque fibre musculaire. Cette perte n’est pas due à une mort neuronale, mais le processus exact n’est pas connu et plusieurs hypothèses sont avancées pour expliquer ce retrait axonal : une dégénerescence Walérienne de l’axone, une rétraction de la branche axonale avec réabsorption par l’axone original, ou une élimination de l’axone par la cellule de Schwann (Bishop et al. 2004; Koirala and Ko 2004) (figure 24B).
Les cellules de Schwann (CS) semblent en effet être des acteurs importants lors de la synaptogenèse. Leur nombre est finement régulé : à la naissance, 30 à 50% des JNMs ne possèdent pas de cellules de Schwann terminales (CSTs), mais seuls des prolongements des CS pré-terminales sont présents. Au cours du développement post-natal, le nombre de CSTs par JNM augmente grâce à la migration des CSs du nerf préterminal et à la division des CSTs déjà présentes (Love and Thompson 1998). Chez l’adulte, le nombre de CSTs est fonction de la taille de la JNM. Ce nombre reste dynamique tout au long de la vie, selon que les JNMs s’élargissent ou se rétrécissent (Lubischer and Bebinger 1999).

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Table des matières

I. Le syndrome de Schwartz-Jampel
IA. Clinique
IA1. Les anomalies musculaires
IA1a. La raideur musculaire
IA1b. L’électromyogramme (EMG)
IA1c. L’histologie musculaire
IA2. Les déformations ostéoarticulaires
IB. Génétique
IC. La dysplasie dissegmentaire de type Silverman-Handmaker
IC1. Clinique
IC2. Génétique
ID. Différence SJS / DDSH
II. Le perlecan
IIA. Structure du perlecan
IIA1. Le domaine I
IIA2. Le domaine II
IIA3. Le domaine III
IIA4. Le domaine IV
IIA5. Le domaine V
IIA6. Les modifications post-traductionnelles
IIA6a. Chaînes glycosaminoglycanes (GAG)
IIA6b. Glycosylations
IIB. Expression
IIC. Interactions
IIC1. Les composants des membranes basales
IIC1a. Les collagènes
IIC1b. Les laminines et les nidogènes
IIC1c. Fibronectine – Fibuline – Fibrilline
IIC1d. Les protéines spécifiques de la matrice cartilagineuse
IIC1e. Les autres protéines des membranes basales et matrices extracellulaires
IIC2. Les récepteurs cellulaires
IIC2a. Le dystroglycan
IIC2b. Les intégrines
IIC3. Les facteurs de croissance
IIC3a. Les FGFs
IIC3b. TGF – INF – PDGF – PF4
IIC3c. Les facteurs de croissance chondrogéniques
IIC3d. Les facteurs de croissance tumorigéniques
IID. Fonctions du perlecan
IID1. Dans le cartilage
IID1a. La chondrogenèse
IID1b. Composition du cartilage
IID1c. Rôles du perlecan
IID2. Dans le muscle
IID2a. La myogenèse
IID2b. L’organisation d’une fibre musculaire
IID2c. Rappel sur le mécanisme de contraction
IID2d. Rôle du perlecan
IIE. Modèles animaux
IIE1. La drosophile Drosophila melanogaster
IIE1a. La structure de Trol
IIE1b. Expression
IIE1c. Phénotype des mutants
IIE1d. Fonctions de Trol
IIE2. Le nématode Caenhorabditis elegans
IIE2a. Structure et régulation de Unc-52
IIE2b. Expression
IIE2c. Phénotype des mutants
IIE2d. Fonctions de UNC-52
IIE3. La souris Mus musculus
IIE3a. Structure du perlecan murin
IIE3b. Invalidation du gène Hspg2
IIE3c. Modèles hypomorphes
III. La jonction neuromusculaire (JNM) et pathologies associées
IIIA. Le développement de la JNM
IIIA1. La différenciation présynaptique
IIIA2. La différenciation post synaptique
IIIB. La transmission du potentiel d’action synaptique
IIIC. Les composants de la JNM adulte
IIIC1. Le nerf terminal
IIIC2. La cellule de Schwann terminale (CST)
IIIC3. La membrane basale synaptique
IIIC3a. Agrine
IIIC3b. Collagènes
IIIC3c. Laminines
IIIC3d. Nidogène
IIIC3e. Les neurégulines et leurs récepteurs ErbB
IIIC4. La fibre musculaire
IIIC4a. Structure de l’élément post-synaptique
IIIC4b. Protéines du complexe post-synaptique
IIID. Le complexe acétylcholinestérase-ColQ
IIID1. L’acétylcholinestérase (AChE)
IIID1a. Les différents isoformes
IIID1b. Rôles de l’AChE
IIID1c. Phénotype des mutants AChE
IIID2. ColQ
IIID2a. Structure
IIID2b. Phénotype des mutants ColQ
IIID2c. Le complexe perlecan-ColQ-MuSK
IIIE. Hypothèse perlecan et SJS
IIIF. Les syndromes myasthéniques congénitaux (SMC)
IIIF1. Syndrome myasthénique pré-synaptique
IIIF2. Syndrome myasthénique synaptique
IIIF3. Syndromes myasthéniques post-synaptiques
IIIF3a. Altérations des RAChs
IIIF3b. Altérations des canaux sodiques
IIIF3c. Altérations de MuSK et Rapsyne
IIIF3d. Altérations de DOK-7
OBJECTIFS DE LA THESE
RESULTATS ET DISCUSSION
I. Article I publié
IA. Article
IB. Résultats complémentaires
IC. Mécanismes responsables du déficit en perlecan
IC1. Contrôle qualité pour les mutations faux-sens
IC2. NMD pour les mutations tronquantes
II. Article II en préparation
IIA. Article
IIB. Résultats complémentaires: lignée Hspg2C1532Y
IIB1. Phénotype et génétique
IIB2. Expression du perlecan
IIB3. Phénotype musculaire
IIC. Perspectives
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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