Les caractères morphologiques et culturaux

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Les caractères biochimiques

Escherichia coli exprime les caractères généraux des entérobactéries. C’est des bacilles à Gram négatif (2 à 4 microns de long sur 0,4 à 0,6 microns de large), mobiles avec une ciliature péritriche ou immobiles, poussent sur milieux de culture ordinaires, aérobies-anaérobies facultatifs, fermentent le glucose avec ou sans production de gaz, réduisent les nitrates en nitrites, oxydase négatif.
Escherichia coli fermente les sucres (lactose et glucose), réduit les nitrates en nitrites, métabolise le tryptophane en indole [10].

Caractères antigéniques

L’antigène somatique O, définissant le sérogroupe, est contenu dans les LPS (lipopolysaccharides) présents sur la paroi bactérienne des bactéries à Gram négatif. L’antigène flagellaire H est de nature protéique entrant dans la structure du flagelle (ciliature péritriche) permettant la mobilité de la bactérie. L’antigène K de surface n’est pas toujours présent mais s’il est présent, il bloque l’agglutinabilité de l’antigène O [3, 10].

Les différents pathovars d’E. coli

La présence de facteurs de virulence spécifiques (facteurs de colonisation, toxines, etc.) permet de regrouper les souches d’E.coli en pathovars. Chaque pathovar est associé à un syndrome infectieux caractéristique. L’identification d’une souche à l’espèce E. coli par les techniques classiques n’est pas suffisante pour apprécier la responsabilité de celle-ci dans l’infection intestinale, il est nécessaire d’identifier le pathovar auquel appartient la souche par la caractérisation des facteurs de virulence [10].
Les souches d’E. coli responsables d’infections intestinales sont actuellement classées dans 6 pathovars définis sur la base des facteurs de pathogénicité et des signes cliniques engendrés. Ils sont désignés par ECEP (E. coli Entéropathogéne) ou EPEC (Enteropathogenic E. coli) et leurs caractéristiques sont résumées dans le tableau I et II [10].

La sensibilité aux antibiotiques de E.coli

E. coli est naturellement sensible aux antibiotiques actifs sur les bacilles à Gram négatif. Cependant, des souches résistantes aux antibiotiques sont de plus en plus fréquentes. Ces résistances acquises sont marquées par une grande diversité [16].
Des souches d’E. coli résistantes aux carbapénèmes sont décrites aussi bien en ville qu’a l’hôpital avec une prévalence faible.
Ces résistances sont, en grande majorité d’origine plasmidique car E.coli peut aisément acquérir des réplicons par transfert horizontal (conjugaison). Il peut s’agir parfois de plasmides épidémiques conférant une multi résistance [10, 16].

Taxonomie

Le genre Pseudomonas est depuis toujours un genre pléthorique avec 160 espèces répertoriées en 1957. L’édition 1974 du Bergey’s Manual retenait 29 espèces dont 13 d’intérêt médical ; en1984, il conservait 30 espèces principales [1, 8].

Caractères bactériologiques

Caractères morphologiques et culturaux

C’est un bacille à Gram négatif 1 à 3 μm de long et 0,5 à 1μm de large. Il est parfois recouvert d’un pseudo capsule appelée «slime» qui peut jouer un rôle important dans la pathogénicité de cette bactérie [1, 8].
Il peut être cultivé facilement sur beaucoup de milieux en atmosphère anaérobiose en présence de nitrates. Il dégage une odeur aromatique caractéristique de seringat due à la production d’ortho-amino-acéto-phénone, intermédiaire du métabolisme du tryptophane et non lié à la production de pigment. Un milieu sélectif comme le milieu de Drigalski convient pour leur culture.
Des milieux sélectifs à base de cétrimide additionnés d’antibiotiques (exemple : acide nalidixique) sont proposés pour la recherche de Pseudomonas aeruginosa dans des produits très contaminés ou dans les eaux (hydrologie) [8].

Pigments élaborés

Pseudomonas aeruginosa produit deux pigments qui diffusent dans le milieu de culture : la pyocyanine, bleue vert, soluble dans le chloroforme et la pyoverdine, jaune vert fluorescent et soluble dans l’eau. Il existe de rares souches produisant d’autres pigments (noir ou rouge). Certaines souches sont non pigmentées [8].
La production de pigments est favorisée sur les milieux de King “A” pour la pyocyanine et “B” pour la pyoverdine [8].

Caractères biochimiques

Pseudomonas aeruginosa n’est pas capable de fermenter les sucres mais peut les attaquer (le glucose en particulier) par voie oxydative, entraînant une acidification du milieu. Les milieux MEVAG (Milieu pour l’Etude de la Voie d’Attaque des Glucides) ou de Hugh et Leifson permettent de mettre en évidence cette propriété
Comme la plupart des Pseudomonas, Pseudomonas aeruginosa possède une oxydase. D’autres caractères sont utiles pour le diagnostic de l’espèce. Pseudomonas aeruginosa ne produit pas l’Indole, n’hydrolyse pas l’urée, ne produit pas H2S et réduit les nitrates en nitrites [8].

Habitat

Les bactéries du genre Pseudomonas sont caractérisées par leur caractère ubiquiste ; elles sont retrouvées dans les eaux (eaux douces polluées et non polluées, stagnantes ou courantes, eaux de mer), sol, végétaux, etc.
Elles peuvent être présentes dans les poussières en suspension dans l’air. La contamination des aliments ou des denrées alimentaires (végétaux crûs) par ces bactéries n’est pas exceptionnelle et peut constituer un mode de contamination. Leurs exigences nutritives modestes leur permettent de survivre et de se multiplier sur des surfaces humides. De ce fait, elles sont fréquemment rencontrées en milieu hospitalier aussi bien dans l’environnement humide proche du malade (éviers, siphons, objets et linges de toilettes, etc.) que dans de nombreux liquides parmi lesquels les solutions d’antiseptiques [1, 8].
P. aeruginosa est une espèce fréquemment isolée en pathologie infectieuse. Elle peut être rencontrée au niveau du tube digestif, de la gorge, du nez ou de la peau. Ce portage augmente de façon significative avec le temps d’hospitalisation [8].

La sensibilité de Pseudomonas aeruginosa aux antibiotiques

Pseudomonas aeruginosa est réputé pour sa résistance aux antibiotiques qui pose de sérieux problèmes thérapeutiques et favorise sa dissémination en milieu hospitalier. La résistance naturelle du bacille pyocyanique relève d’une mauvaise perméabilité de la membrane externe et de la production constante d’une bêta-lactamase inductible.
Les résistances acquises sont dues à une imperméabilité accrue de la membrane externe (modification des porines) ou à la production d’enzymes inactivantes. Ces deux mécanismes peuvent coexister et associer ainsi leurs effets [14].
Pseudomonas aeruginosa est résistante aux aminopénicillines, aux céphalosporines de 1ère et 2éme génération, aux tétracyclines, aux macrolides, au chloramphénicol, à la rifampicine, au triméthoprime-sulfaméthoxazole [14].
La résistance acquise aux bêtalactamines est fréquente par production de pénicillinase inactivant la ticarcilline, les acyluréidopénicillines, la cefsulodine et le céfopérazone ou par dérépression de la céphalosporinase naturelle [14].
La résistance acquise aux quinolones peut être due à une imperméabilité observée dans 15% des cas.
La résistance acquise à la fosfomycine est due à une diminution de la perméabilité [14].

Classification des antibiotiques

La classification des antibiotiques peut se faire selon leur origine (naturelle, synthétique ou semi-synthétique), leur mode d’action, leur spectre d’activité et leur nature chimique [2, 6].
Il existe plusieurs familles d’antibiotiques.

Les Bêta-lactamines

Les bêta-lactamines représentent une vaste famille d’antibiotiques bactéricides qui possèdent comme structure de base le cycle bêta-lactame (figure 2). Nous distinguons 4 sous-familles : les pénames (pénicillines), les pénèmes, les monobactams et les céphèmes. Les spectres d’activité de chaque sous-famille sont très différents en fonction de leurs particularités structurales. La résistance par production de bêta-lactamases a conduit au développement d’inhibiteurs (Acide clavulanique, EDTA, cloxacilline, ions chlorures) de ces enzymes, qui associés à certaines bêta-lactamines en restaurent l’activité antibactérienne. Les bêta-lactamines sont en général bien tolérées exceptées des manifestations immuno-allergiques diverses et éventuellement croisées qui sont rencontrées avec la grande majorité des bêta-lactamines [2, 6, 9, 11, 12].

Macrolides, Lincosamides, Streptogramines (MLS)

Ce sont des antibiotiques répartis en 4 groupes: macrolides ; synergistines ; lincosamides ; et kétolides.
Ce sont des classes différentes mais ils ont les mêmes mécanismes d’action et de résistance ainsi que la même pharmacocinétique. Ce sont des antibiotiques très répandus sont très utilisés dans les infections courantes.
Ils ont un spectre d’activité limité sur les bactéries à Gram positif, les cocci à Gram négatif, les mycoplasmes et les bacilles à Gram négatif anaérobies [9 ,12]. Ces molécules, bien que structurellement distinctes, possèdent de nombreuses propriétés communes justifiant leur regroupement. En effet, ce sont des antibiotiques bactéricides ou bactériostatiques selon la dose, agissant au niveau de la sous-unité 50 S ribosomale, caractérisés par une forte liposolubilité et une très bonne distribution tissulaire et intracellulaire [9,16] (Figure 6).

Les cyclines

Les cyclines ou tétracyclines constituent une famille d’antibiotiques dérivés de la tétracycline.
Ces molécules ont pour caractéristique de posséder quatre cycles accolés (d’où leur nom) (figure 4). Elles sont capables de pénétrer les cellules eucaryotes. On les utilise donc en particulier pour cibler les bactéries parasites intracellulaires. Ces molécules sont bactériostatiques [11-12, 16]. Les cyclines sont des inhibiteurs de la traduction des protéines. Ils se lient à la sous-unité 30S du ribosome où se situe le centre de décodage de l’ARN messager. Cette liaison empêche la fixation des ARNt sur le ribosome et donc la formation de l’interaction entre le codon et l’anticodon. Ceci empêche la lecture du message génétique [14-15] (Figure 6).

Généralités sur l’antibiogramme

Définition

Un antibiogramme est un test qui permet de définir le profil de sensibilité aux antibiotiques d’une souche bactérienne donnée [2].

Intérêts de l’antibiogramme

Les intérêts de l’antibiogramme sont :
– Thérapeutique : l’antibiogramme favorise un choix judicieux des antibiotiques.
– Epidémiologique : il contribue à la surveillance de la résistance bactérienne dans le temps, ce qui permet une adaptation de l’antibiothérapie probaliste. Il permet également la comparaison des phénotypes de résistance [9].
– Diagnostique : il contribue à l’identification bactérienne par la mise en évidence de résistance naturelle [9].

Antibiogramme par diffusion en milieu gélosé

Des disques de papier buvard, imprégnés de l’antibiotique à tester, sont déposés à la surface d’un milieu gélosé, préalablement ensemencé avec une culture pure de la souche à étudier. Dès l’application des disques, les antibiotiques diffusent de manière uniforme si bien que leurs concentrations sont inversement proportionnelles à la distance du disque. Après incubation, les disques sont entourés d’une zone d’inhibition circulaire correspondant à une absence de culture. Les diamètres d’inhibition correspondent à la concentration minimale inhibitrice [2, 9, 14, 15] (Figure 7).

Contrôle de qualité des tests effectués

Chaque lot de milieu préparé était soumis à un contrôle de stérilité et d’efficacité avant d’être utilisé pour la détermination de la sensibilité aux antibiotiques.

Contrôle de stérilité des milieux

Un millilitre du bouillon MH préparé était mis dans un tube à hémolyse stérile incubé à l’étuve à 37° C pendant 24h à 48h. Le bouillon était considéré stérile à l’absence de trouble.
Chaque boîte contenant de la gélose MH préparée était placée à l’étuve à 37° C pendant 24h à 48h. Les boites étaient considérés stériles en l’absence d’apparition de colonies.

Contrôle de qualité des microplaques CSB®

– Test de stérilité:
Avant leur utilisation, les plaques déshydratées contenant les concentrations critiques supérieures et inférieures étaient incubées sans inoculum pendant 24h à 37° C.
Le milieu contenu dans les plaques était considéré comme stérile en absence de virage de l’indicateur coloré (rouge de phénol).
– Test d’efficacité:
Le bouillon MH mis en présence de la souche de référence et de l’indicateur coloré est incubé à 37° C pendant 24 heures. Le milieu était considéré comme efficace en cas de changement de coloration du milieu MH.

Contrôle des paramètres dynamiques

Le pH de chaque milieu préparé était vérifié à l’aide d’un pH-mètre et devait être compris entre 7,4 ± 0,2.

Determination de la sensibilité (macro methode)

Pour les souches d’Escherichia coli (référence et clinique) ; 1ml du bouillon MH était mis dans des tubes additionné de glucose et de rouge de phénol (indicateur coloré), ensuite un volume de 100μl d’un inoculum de3 Mac Farland d’E. coli était ajouté à chaque tube.
Pour les souches de Pseudomonas aeruginosa (référence et clinique) ; 1 ml du bouillon MH était réparti dans des tubes. Ensuite un volume de 100 μl d’un inoculum de 3 Mac Farland de P. aeruginosa était ajouté.
Les tubes étaient ensuite incubés dans l’étuve à 37º C ; et une detection d’un changement de l’indicateur coloré ou la présence d’une turbidité correspondant à une croissance bacterienne était réalisée chaque 2 heures pendant une durée de 6 heures.

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Table des matières

I. Généralités sur Escherichia coli
I.1.Taxonomie
I.2. Historique
I.3. Caractères bactériologiques
I.3.1 Les caractères morphologiques et culturaux
I.3.2 Les caractères biochimiques.
I.4 Caractères antigéniques
I.5 Habitat
I.6 Les différents pathovars d’E. coli
I.7 La sensibilité aux antibiotiques de E.coli
II. Généralités sur Pseudomonas aeruginosa
II.1 Définition
II.2 Taxonomie
II.3 Caractères bactériologiques
II.3.1 Caractères morphologiques et culturaux
II.3.2 Pigments élaborés
II.3.3 Caractères biochimiques
II.4 Habitat
II.5 La sensibilité de Pseudomonas aeruginosa aux antibiotiques
III. Rappels sur les antibiotiques
III.1 Définition
III.2 Classification des antibiotiques
III.2.1 Les Bêta-lactamines
III.2.2 Les aminosides
III.2.3 Macrolides, Lincosamides, Streptogramines (MLS)
III.2.4 Les cyclines
III.2.5 Les phénicolés
III.2.6 Les quinolones
IV.2 Intérêts de l’antibiogramme
IV.3 Antibiogramme par diffusion en milieu gélosé
IV.4 Antibiogramme en milieu liquide
V. La résistance aux antibiotiques
V.1.Notion de résistance
V.2.2 La résistance acquise
I. Objectifs de l’étude
II. Cadre de l’étude
III. Souches utilisées
IV. Matériels
IV.1.Matériels pour la conservation
IV.2 Matériels pour la culture et l’identification
IV.3 Matériels pour la détermination de la sensibilité
V. Méthodologie
V.1 Mode opératoire
V.1.1 Protocole
V.1.2 Préparation des milieux
V.2 Contrôle de qualité des tests effectués
V.2.1 Contrôle de stérilité des milieux
V.2.2 Contrôle de qualité des microplaques CSB®
V.2.3 Contrôle des paramètres dynamiques
V.3 Determination de la sensibilité (macro methode)
V.4 Determination de la sensibilité (micro methode)
VI. Résultats
VI.1Contrôle des milieux
VI.2 Résultats macrométhode
VI.3 Profils de sensibilité sur antibiogramme standard des souches de référence
VI.4 Profil de sensibilité des 2 souches cliniques sur antibiogramme standard
VI.5 Profil de sensibilité des souches de référence sur les galeries Micro CSB®
VI.6 Profil de sensibilité des souches cliniques sur les galeries Micro CSB®
VI.7 Validation
VII. Discussion
Conclusion
Références bibliographiques

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