Soutenance mémoire
Les biofilms d’eau douce ou périphyton
Définition et caractéristiques
Définition du terme périphyton
Le terme périphyton désigne littéralement les communautés microflorales se développant sur des surfaces solides immergées. Certains auteurs (Aloi 1990; Lucey et al. 1987) ont utilisé cette définition en choisissant délibérément de ne pas considérer les champignons, bactéries, protozoaires et autres animaux se développant avec la microflore. En revanche, le terme allemand Aufwuchs permet de prendre en compte l’ensemble des micro-organismes sans distinction et rejoint en ce sens la définition du terme périphyton introduite par Cooke en 1956 (Austin et al. 1981; Cooke 1956; Lucey et al. 1987) : ces organismes (plantes et animaux) attachés ou accrochés aux tiges, feuilles ou plantes enracinées dans l’eau, ou aux autres surfaces présentes au-dessus du fond de la rivière .
Il est aussi possible de distinguer les organismes immobiles (attachés au substrat), parfois désignés par le terme « eupériphyton », du « pseudopériphyton » ou « métapériphyton » constitué des organismes motiles qui se déplacent à l’intérieur ou sur le périphyton (Azim et al. 2005).
Dans cette étude, nous désignerons par « périphyton » ou indifféremment par «biofilm » l’ensemble des organismes se développant sur les supports immergés, qu’ils soient ou non fixés sur le substrat, ce qui correspond d’ailleurs à la définition du terme « périphyton » par l’APHA (1989). Ainsi, le périphyton sera composé d’algues, de bactéries, de Fungi, de protozoaires, de zooplancton, d’invertébrés et de leurs larves, et autres organismes benthiques.
Les biofilms
Le périphyton constitue ce que l’on appelle un biofilm, c’est-à-dire une structure biologique organisée se développant sur une surface, constituée de micro organismes et d’une matrice d’exopolymères sécrétés par ces derniers (Sabater et al. 2007). Le terme « biofilm » peut être utilisé dans des situations extrêmement différentes, allant d’un biofilm fin formé par quelques bactéries issues d’une souche pure cultivée en microplaque à un biofilm épais, prélevé en milieu naturel de composition taxonomique variée. D’après Wimpenny (2000), le terme « biofilm » doit toujours faire intervenir trois points :
– la présence d’une surface ou d’une interface sur laquelle se développent les microorganismes
– la présence d’une matrice de polymères extracellulaires sécrétés par les microorganismes qui unifie l’ensemble de la communauté
– l’émergence d’une communauté de micro-organismes avec, en général, l’idée que cette communauté possède ses propriétés propres.
Grâce au développement de méthodes appropriées à la quantification ou à l’observation des biofilms , on sait aujourd’hui que la très grande majorité des micro organismes aquatiques se développent naturellement sous forme de biofilms (Watkins & Costerton 1984). Ainsi, les populations bactériennes planctoniques représentent une très faible part de la biomasse bactérienne totale : 95 à 99% de la biomasse totale est en général considérée comme existant sous forme de biofilms (Nikolaev & Plakunov 2007), et jusqu’à 99.9% dans certains milieux aquatiques (Costerton et al. 1995).
Une structure microbienne organisée
Par définition, les organismes constituant un biofilm sont en contact rapproché les uns avec les autres. Un biofilm est donc avant tout une communauté d’organismes qui interagissent entre eux. Les micro-organismes présents dans la matrice des biofilms peuvent s’organiser en consortium et coopérer les uns avec les autres, par exemple pour co-métaboliser des substrats complexes (Davey & O’Toole 2000; Wimpenny 2000). Ils dépendent les uns des autres pour se procurer des nutriments, se protéger de composés toxiques ou maintenir des conditions optimales de développement (pH, potentiel rédox au sein du biofilm, etc.).
Les biofilms sont bien des « communautés » de micro-organismes, au sens où les propriétés de la communauté sont plus importantes (par exemple une activité plus importante) et/ou plus variées (par exemple une forte résistance aux antibiotiques (Geesey et al. 1992)) que la somme des propriétés de chacun des micro-organismes (Sutherland 2001a; Wimpenny 2000). Un biofilm ne peut donc pas être considéré comme une simple somme des micro-organismes qui le composent (Nikolaev & Plakunov 2007). En effet, ceux-ci ne sont pas tout à fait comparables à leurs homologues planctoniques, puisqu’un changement phénotypique s’opère à partir de l’adhésion à une surface (Donlan 2002). Par exemple, l’adhésion à une surface provoque l’activation de gènes impliqués dans la synthèse de l’alginate chez P. aeruginosa, et la synthèse d’enzymes permettant de produire des exo polysaccharides nécessaires à la formation et la cohésion des biofilms chez certaines bactéries Gram-positives (Costerton et al. 1995). Certains auteurs affirment même que les micro-organismes des biofilms peuvent subir un phénomène de spécialisation analogue à la différenciation des cellules dans un organisme multicellulaire (Nikolaev & Plakunov 2007). Les différences observées dans l’expression génétique, et donc dans l’activité physiologique, entre les micro organismes planctoniques et leurs homologues se développant dans un biofilm s’expliquent notamment par des phénomènes de quorum sensing, c’est-à-dire l’utilisation de signaux moléculaires appelés auto-inducteurs (Decho 2000; Sigee 2005), qui déclenchent l’activation de certains gènes. Ceci pourrait, entre autres, être à l’origine des propriétés particulières de ces communautés, par exemple une résistance accrue à des antibiotiques ou des métaux (Harrison et al. 2007).
La matrice d’EPS
S’agréger en biofilm constitue une stratégie de développement pour les microorganismes : l’adhésion à une surface provoque un changement phénotypique peut-être à l’origine d’une résistance accrue à d’éventuelles substances toxiques, comme nous l’avons vu ci-dessus. Ils sont aussi et avant tout protégés, par exemple de certains prédateurs ou de variations trop brusques de paramètres environnementaux. Cette stratégie de défense est observée assez couramment dans la nature : par exemple, certains germes pathogènes d’eau douce, évacués par ruissellement ou par rejet d’eaux usées dans les rivières, constituent des flocs pour se protéger des conditions physico-chimiques stressantes – salinité élevée et radiations UV – en milieu marin (Decho 2000). Cette stratégie de défense n’est d’ailleurs pas réservée aux seules bactéries car les algues sécrètent aussi des carbohydrates en présence de composés toxiques comme des métaux (Kučera et al. 2008; Pistocchi et al. 2000).
D’après Sutherland (2001a), la matrice (Figure 1) des biofilms est constituée de 97 % d’eau, le reste étant composé de cellules microbiennes (2 à 5 % de la matrice), exopolysaccharides, protéines, acides nucléiques et composés ioniques, sans oublier des produits de lyse cellulaire, nutriments adsorbés, acides humiques, particules et autres détritus provenant de l’environnement du biofilm. Les exo polysaccharides sécrétés sont aussi appelés polymères extracellulaires bactériens (EPS ou Extracellular Polymers ou encore Extracellular PolySaccharides). Ils peuvent être dans des états physiques variés allant du gel poreux à l’état colloïdal ou dissous en passant par des gels visqueux ou presque liquides aussi appelés slime (Decho 2000; Lester 1983). Ce sont les EPS qui structurent la matrice des biofilms, leur rôle semble d’ailleurs tout particulièrement important au moment de l’adhésion à la surface des premières cellules et lors des premières phases de développement d’un biofilm (Gilbert et al. 1997). Ils permettent aussi aux micro-organismes de contrôler le maintien de conditions physico-chimiques adaptées au sein du biofilm.
|
Table des matières
INTRODUCTION
CHAPITRE 1. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
I. LES BIOFILMS D’EAU DOUCE OU PERIPHYTON
1. Définition et caractéristiques
1.1 Définition du terme périphyton
1.2 Les biofilms
1.2.1 Une structure microbienne organisée
1.2.2 La matrice d’EPS
1.3 Développement de biofilms périphytiques en milieu naturel
1.3.1 Le périphyton dans le continuum fluvial
1.3.2 Etapes de développement des biofilms
1.3.3 Facteurs structurants pour le périphyton
1.4 Rôle du périphyton dans la dégradation de la MO
1.4.1 Dégradation enzymatique de la MO
1.4.2 L’activité β-glucosidase
2. Le périphyton comme marqueur d’une contamination
2.1 Un matériel biologique de choix pour le scientifique
2.2 Biodescripteurs du périphyton
2.2.1 Modifications de structure
2.2.2 Approches métaboliques et physiologiques
2.3 Conclusion sur l’utilisation des biofilms pour évaluer l’impact des contaminations
II. L’APPROCHE PICT
1. Phase de sélection
1.1 Complexité du phénomène de succession
1.2 Durée de l’exposition et succession
1.3 Méthodes d’évaluation de la sélection
2. Phase de détection : mise en évidence de la tolérance acquise
2.1 Evaluation de la tolérance
2.2 Notion de tolérance de base (baseline tolerance)
3. Validation d’un effet PICT
4. Exemples d’application de l’approche PICT
5. Facteurs de variation de l’induction de tolérance des communautés
5.1 Interactions de paramètres environnementaux
5.2 Phénomènes de co-tolérance
5.3 Biodisponibilité des contaminants
6. Conclusion sur l’utilisation de l’approche PICT
III. L’ARISA POUR EXPLORER LA DIVERSITE GENETIQUE DES BIOFILMS
1. Explorer la diversité biologique
1. 1 Intérêt de l’approche moléculaire
1. 2 Utilisation de l’opéron ribosomique comme outil d’identification
2. Les techniques d’empreinte génétique
2.1 Principe général
2.2 Les différentes techniques d’empreinte génétique
3. Principe et utilisation de l’ARISA
3.1 L’ARISA : exploitation du polymorphisme de taille des intergènes
3.1.1 ARISA Bactérie
3.1.2 ARISA Eucaryote
3.2 Applications
4. Biais et limites des techniques d’empreinte génétique
4.1 Biais liés à l’extraction d’ADN
4.2 Biais liés à l’amplification de l’ADN par PCR
4.3 Seuils de détection des techniques d’empreinte génétique
4.4 Conclusion sur l’utilisation des techniques d’empreinte génétique
5. Interprétation des profils ARISA
5.1 Signification d’un pic ou d’une bande sur le gel
5.2 Quantifier les abondances relatives
5.3 Méthodes d’analyse des profils ARISA
5.3.1 Calcul d’indices
5.3.2 Analyses multivariées
5.4 Conclusion sur l’utilisation de la technique ARISA
PROBLEMATIQUE
OBJECTIFS DE L’ETUDE
DEMARCHE GLOBALE
CHAPITRE 2. MESURE DE LA TOLERANCE DES COMMUNAUTES PERIPHYTIQUES EXPOSEES EN MILIEU URBAIN
I. COLLECTE DE BIOFILMS EN MILIEU NATUREL ET DESCRIPTEURS CLASSIQUES DE LEUR COMPOSITION
1. Dispositif de collecte in situ
2. Descripteurs de la composition des biofilms
2.1 Estimation de la biomasse totale
2.2 Estimation de la composition élémentaire du biofilm
2.3 Estimation de la biomasse algale
3. Suivi de biofilms prélevés in situ
II. DEVELOPPEMENT METHODOLOGIQUE DU TEST DE TOXICITE AIGUË Β-GLUCOSIDASE SUR LES METAUX
1. Choix du test de toxicité hétérotrophe
2. Protocole de mesure de l’activité β-glucosidase
3. Protocole du test de toxicité β-glucosidase
3.1 Choix du médium pour fabriquer les suspensions de biofilm
3.2 Test de toxicité
4. Tolérance et normalisation par les MES
4.1 Inhibition de l’activité β-glucosidase par les métaux
4.2 Normalisation par les MES pour obtenir une mesure fiable de la tolérance
4.3 Le cas du plomb
5. Paliers d’inhibition
6. Conclusion sur l’utilisation du test β-glucosidase pour évaluer des niveaux de tolérance aux métaux
III. DEVELOPPEMENT DU TEST DE TOXICITE AIGUË Β-GLUCOSIDASE MIS EN ŒUVRE AVEC DES CONTAMINANTS HYDROPHOBES
1. Utilisation des échantillonneurs passifs pour la contamination hydrophobe
2. Protocole des tests de toxicité avec extraits de membranes LDPE et extraits de cartouches SPE
2.1 Support de colonisation des biofilms
2.2 Exposition de LDPE in situ après purification des membranes
2.3 Extraction des contaminants au laboratoire
2.4 Choix du solvant de reprise
2.5 Test de toxicité β-glucosidase avec extraits de membranes LDPE
3. Inhibition de l’activité β-glucosidase par les contaminants hydrophobes
IV. DEVELOPPEMENT METHODOLOGIQUE DU TEST DE TOXICITE AIGUË PHOTOSYNTHETIQUE
1. Mise au point du protocole de mesure de l’activité photosynthétique de biofilms naturels
2. Tests de toxicité
CHAPITRE 3. UTILISATION DE LA TECHNIQUE ARISA : MISE EN EVIDENCE DE CHANGEMENTS DE STRUCTURE DANS LES BIOFILMS
I. UTILISATION DE L’ARISA BACTERIE SUR LES BIOFILMS
1. Mises au point méthodologiques et protocoles
1.1 Cryoconservation des échantillons
1.2 Extraction de l’ADN
1.3 Amplification des intergènes par PCR
1.4 ARISA Bactérie
2. Modifications saisonnières des populations bactériennes de biofilms prélevés à SaintMaurice en 2008
II. DEVELOPPEMENTS METHODOLOGIQUES LIES A L’UTILISATION DE L’ARISA EUCARYOTE SUR LES BIOFILMS
1. Conception d’un couple d’amorces ciblant la région ITS1-5.8S-ITS2 chez les diatomées des biofilms
2. Mises au point méthodologiques et protocoles
3. Clonage et analyse phylogénétique sur un échantillon de biofilm de Saint-Maurice
4. Modifications saisonnières des populations eucaryotes de biofilms prélevés à SaintMaurice en 2008
III. CONCLUSION SUR L’UTILISATION DE L’ARISA SUR BIOFILMS
CHAPITRE 4. VALIDATION DE LA METHODOLOGIE PICT EN CONDITIONS CONTROLEES : EXPOSITIONS EN MICROCOSMES
I. OBJECTIFS
II. DISPOSITIF EXPERIMENTAL
III. RESULTATS
1. Paramètres d’exposition
2. Caractérisation des biofilms
2.1 Accumulation des métaux dans les biofilms
2.2 Descripteurs de biomasse
2.3 ARISA
3. Test β-glucosidase
IV. INTERPRETATION
1. Effet PICT sur biofilms exposés en microcosmes
2. Descripteurs de biomasse : paramètres classiques et ARISA
V. CONCLUSION
CONCLUSION
Télécharger le rapport complet
