Soutenance mémoire
Les bactéries lactiques
Isolement, confirmation de la pureté des souches et leur appartenance au groupe lactique
Le lait cru représente une source de nouvelles souches de bactéries lactiques pouvant présenter des potentialités fermentaires (Kacem et al., 2002, 2004 ; Zadi-Karam et Karam, 2006 ; Idoui et Karam, 2008) intéressantes pour les industries alimentaires et pharmaceutiques. Elles contribuent aussi à la conservation de la viande et d’autres produits sous certaines conditions contrôlées, essentiellement l’acidité (Rodriguez-Calleja et al., 2005 ; Ho, 2008).
Cinquante-deux souches de bactéries lactiques ont été isolées à partir de deux biotopes naturels riches en substances nutritives (protéines, matière grasse, etc.), le lait de chamelle et la viande rouge provenant de la région d’Oran. Quarante-trois coques lactiques et neufs lactobacilles ont été obtenus sur milieux GMRS et/ou LM17. Dans nos conditions expérimentales, nous avons obtenu une majorité de coques par rapport aux bâtonnets. La même constatation avait été observée par Kacem et al. (2002) et Franciosi et al. (2009).
Sur milieux MRSHS et/ou M17HS, huit coques lactiques ont été sélectionnés, trois isolats à partir du lait de chamelle (L4, L5 et L6) et cinq à partir de viande rouge fraiche (V1, V2, V3, V4 et V5).
Après revivification des souches de la collection du laboratoire LBMB par un double enrichissement dans les bouillons GMRS et/ou LM17, quatre bactéries lactiques (VO18, VO17, VO12 et VO4) provenant de la viande ovine de Relizane ont été choisies par rapport à leur caractère épaississant.
Lors de cette étude, toutes les souches retenues sont caractérisées par la production de biosubstances épaississantes. Elles se présentent sous forme de colonies de grosse taille, d’aspect gluant sur milieu M17HS alors que sur LM17 solide elles donnent des petites colonies blanchâtres, rondes à contour régulier, lisses et légèrement bombées.
L’observation microscopique des bactéries après coloration de Gram a révélé qu’elles sont toutes à Gram positif, de formes cellulaires lenticulaires ou coques, disposées en paires, en chainettes ou isolées. La forme lenticulaire oriente la pré-identification des différentes souches au genre Leuconostoc. Selon Garvie (1986), les corps cellulaires de leuconostocs peuvent être sphériques, mais souvent lenticulaires, surtout lorsqu’ils sont cultivés sur milieu gélosé. Quant à l’autre forme cocci retrouvée, il reste à déterminer à quel genre bactérien appartiennent ces souches.
L’absence de dégagement gazeux chez l’ensemble des bactéries étudiées montre qu’elles sont toutes dépourvues de l’activité catalasique.
Les résultats obtenus confirment la pureté des souches sélectionnées et leur appartenance au groupe des coques lactiques.
Caractérisation physiologique et biochimique des bactéries lactiques :
Au total, 7 coques lactiques ont été pré-identifiés à Leuconostoc en se basant sur leur morphologie. Les résultats de caractérisation des bactéries par des méthodes phénotypiques sont regroupés dans le tableau 10 et le tableau 11. La figure 12 illustre des exemples de ces résultats.A partir de ces résultats, plusieurs observations peuvent être faites :
A10°C, 37°C et à 45°C : l’ensemble des bactéries testées sont incapables de se développer à 10°C et à 45°C mais poussent faiblement à 37°C, à l’exception de la souche L6. Ceci montre qu’elles sont mésophiles.
A 30°C : toutes les bactéries croissent à 30°C.
Aux pH 5 et 9.6 : la majorité des souches poussent légèrement dans un milieu acide. Par ailleurs, aucune croissance n’est constatée en milieu alcalin, excepté pour la souche VO18.
A 6.5, 10 et à 15% de NaCl : la majorité des bactéries résistent faiblement à 6.5% NaCl. Les isolats L6 et VO4 sont les plus résistants. D’après Zadi-Karam et Karam (2006), les bactéries qui croissent dans le lait camelin sont adaptées à sa salinité et peuvent par conséquent être exploitées dans les transformations technologiques et dans la fermentation des produits salés tels les fromages salés, les olives et les concombres.VO4 et L6 croissent en présence de 10% NaCl. Aucune croissance n’est observée à 15% NaCl.
Nous pouvons noter que les souches V1, V5, VO18 et VO17 isolées de la viande sont sensibles à toutes les concentrations de NaCl testées.
L’incubation des cultures à 60°C pendant 30 minutes a permis de révéler que la souche VO12 est thermorésistante.
Caractérisation du profil de fermentation des carbohydrates :
Selon leur potentiel de production d’EPS, cinq souches ont été choisies pour inoculer des galeries biochimiques API 50 CH en vue d’étudier leur profil fermentaire. Les tableaux 12 et 13 montrent les résultats obtenus. Ces profils ont été traités à l’aide du logiciel d’identification apiwebTM qui permet l’identification des bactéries.
Plusieurs remarques peuvent être faites :
L’étude comparative de la fermentation des hydrates de carbone par certains coques lactiques a révélé des profils fermentaires plus ou moins différents au sein de la même espèce. C’est par exemple le cas de la souche V3 qui dégrade le galactose alors que L6 ne le fermente plus. Cette observation a été notée par Karam (1995) ; ZadiKaram (1998) et Kacem et al. (2002) qui ont rapporté que les bactéries lactiques appartenant à la même espèce peuvent présenter des profils fermentaires différents.
Les coques (L4, L5, L6 et V3) pré-identifiés préalablement comme Leuconostoc ont la capacité de dégrader le glucose, le fructose, le lactose, le saccharose, le raffinose, le L-arabinose et les autres carbohydrates (Tableau 12). Idoui et al. (2009) ont remarqué que les souches SB20 et SB25 de Ln. mesenteroides étaient capables de fermenter le raffinose, le lactose ou le saccharose mais pas l’arabinose. Belkheir (2017) a constaté que des espèces de Ln. mesenteroides étaient incapables de fermenter le L-arabinose et le raffinose.
La souche V5 est capable d’hydrolyser les sucres cités auparavant sauf le L-arabinose.
Les isolats lactiques codés L4, L5, L6 et V3 sont identifiés phénotypiquement à l’aide du logiciel apiwebTM en tant que Ln. mesenteroides avec un pourcentage de ressemblance supérieur à 99% et la souche V5 comme étant Lc. raffinolactis avec 96.7% de similitude.
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Table des matières
Liste des figures
Liste des tableaux
Liste des abréviations
Introduction
1. Synthèse bibliographique
1.1 Les bactéries lactiques
1.1.1 Propriétés des bactéries lactiques
1.1.2 Taxonomie et classification des bactéries lactiques
1.1.2.1 Le genre Lactobacillus
1.1.2.2 Le genre Enterococcus
1.1.2.3 Le genre Streptococcus
1.1.2.4 Le genre Lactococcus
1.1.2.5 Le genre Leuconostoc
1.1.2 Intérêts et applications des bactéries lactiques
1.2 Les exopolysaccharides
1.2.1 Généralités sur les EPS des bactéries lactiques
1.2.2 Diversité structurale
1.2.3 Relation structure-fonction des EPS
1.2.3.1 Effet du poids moléculaire
1.2.3.2 Effet de la conformation de la chaîne
1.2.3.3Effet de la charge
1.2.4 Rôles et utilisations des EPS
1.2.5 Classification des EPS
1.2.6 Facteurs essentiels affectant la biosynthèse des EPS
1.2.6.1 Effet de la souche bactérienne et du stade de croissance
1.2.6.2 Effet du milieu de culture
1.2.6.3 Effet de la température d’incubation
1.2.6.4 Effet de la vitesse d’acidification
1.2.6.5 Effet du pH
1.2.6.6 Effet de la quantité d’oxygène
1.2.7 Biosynthèse des EPS des bactéries lactiques
1.2.8 Génétique de la production des EPS
2. Matériel et Méthodes
2.1. Matériel biologique
2.2. Milieux de culture
2.3. Méthodes
2.3.1 Isolement des souches lactiques
2.3.2 Vérification de la pureté des souches et leur appartenance au groupe lactique
2.3.2.1 Observation macroscopique et microscopique
2.3.2.2 Recherche de la catalase
2.3.2.3 Conservation des souches
2.3.3 Caractérisation physiologique et biochimique des bactéries lactiques
2.3.3.1 Caractérisation physiologique
2.3.3.2 Caractérisation biochimique
2.3.4 Screening des souches productrices d’EPS
2.3.4.1 Etude qualitative
2.3.4.1.1 Examen macroscopique sur milieux gélosés
2.3.4.1.2 Utilisation du colorant cationique
2.3.4.2.1 Viscosité apparente
2.3.4.2.2 Viscosité intrinsèque
2.3.4.2.3 Dosage colorimétrique des EPS
2.3.4.2.3.1 Préparation des échantillons
2.3.4.2.3.2 Extraction et purification des EPS
2.3.4.2.3.3 Concentration des EPS
2.3.5.2.3.4 Dosage des EPS
2.3.4.2.3.4.1 Dosage des protéines
2.3.4.2.3.4.2 Dosage des oses totaux
2.3.5 Optimisation de la production d’EPS
2.3.5.1 Effet du pH et de la température
2.3.5.1.1 pH et température optimums de croissance
2.3.5.1.2 pH et température optimums de production d’EPS
2.3.5.2 Effet du milieu de culture
2.3.5.2.1 Effet des substrats carbonés
2.3.5.2.2 Effet des substrats azotés
2.3.5.2.3 Effet des substrats phosphatés
2.3.5.3 Effet du temps d’incubation
2.3.5.3.1 Cinétique de croissance
2.3.5.3.2 Cinétique d’acidification
2.3.5.3.3 Cinétique de production d’EPS
2.3.6 Caractérisation des monosaccharides
2.3.6.1 Hydrolyse des EPS
2.3.6.2 Vérification de l’efficacité de méthodes d’hydrolyse et identification des monosaccharides par CCM 62 2.3.6.3 Identification des monosaccharides par HPLC
2.3.7 Activité rhéologique sur lait
3. Résultats et discussion
3.1 Isolement, confirmation de la pureté des souches et leur appartenance au groupe lactique
3.2 Caractérisation physiologique et biochimique des bactéries lactiques
3.3 Caractérisation du profil de fermentation des carbohydrates
3.4 Recherche des souches productrices d’EPS
3.4.1 Etude qualitative
3.4.1.1 Examen visuel
3.4.1.2 Coloration au Rouge de Ruthénium
3.4.2 Etude quantitative
3.4.2.1 Mesure des viscosités
3.4.2.2 Rendement en EPS
3.5 Optimisation de la production d’EPS
3.5.1 Effet du pH et de la température
3.5.2 Effet du milieu de culture
3.5.2.1 Effet des substrats carbonés
3.5.2.2 Effet des substrats azotés
3.5.2.3 Effet des substrats phosphatés
3.5.3 Effet de la durée d’incubation
3.6 Identification des monosaccharides
3.7 Activité rhéologique sur lait
4. Conclusion et perspectives
5. Références bibliographiques
6. Annexe
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