Soutenance mémoire
Les astrocytes ont un rôle actif et primordial dans le fonctionnement cérébral
Les astrocytes
Les astrocytes : de la glue pour les neurones ?
Les astrocytes représentent 25 à 50% du volume cérébral (Pope, 1978) et le nombre d’astrocytes par neurone augmente avec la complexité et la taille du cerveau de l’espèce considérée (Nedergaard et al., 2003)(Fig. 1A). Malgré cette importance numérique, les astrocytes sont longtemps restés hors du champ d’investigation des neurobiologistes, principalement parce que les moyens d’étudier ces cellules non excitables étaient limités. La première référence à la glie remonte à 1846, quand le neuropathologiste Rudolf Virchow nomma la structure entourant les neurones d’après le nom grec qui signifie glue (Somjen, 1988). Il s’agissait pour lui d’un tissu conjonctif mais pas d’éléments cellulaires. C’est Ramón y Cajal qui le premier, définit clairement les astrocytes grâce à sa méthode d’imprégnation à l’or qui forme des dépôts sur les filaments intermédiaires et permet de révéler la structure d’astrocytes individuels (Somjen, 1988).
Quelques particularités anatomiques des astrocytes
Les astrocytes ont une morphologie étoilée caractéristique que l’on met en évidence avec un marquage immunohistologique de la glial fibrillary acidic protein (GFAP). Cependant, le remplissage des astrocytes de l’hippocampe par un composé fluorescent révèle que les astrocytes ont une structure ‘en éponge’ et forment des prolongements très fins qui s’étendent bien plus loin que ne le laissait supposer le marquage du ‘squelette’ formé par les faisceaux de GFAP (qui ne représente que 15% du volume total de l’astrocyte, Bushong et al., 2002). De plus, chaque astrocyte occupe un territoire spécifique qui ne chevauche quasiment pas celui de l’astrocyte voisin et qui se met en place au cours du développement (Bushong et al., 2004)(Fig. 1B).
Une autre particularité anatomique avait frappé les premier observateurs des astrocytes (Golgi en particulier) : ils établissent des contacts avec les capillaires sanguins par le biais de pieds astrocytaires (Somjen, 1988). Les astrocytes envoient des prolongements qui entourent les vaisseaux sanguins en formant des structures en rosette (Kacem et al., 1998)(Fig. 2A). En réalité, il semble que les pieds astrocytaires recouvrent la quasi totalité des capillaires sanguins par des prolongements plus fins dépourvus de GFAP (Simard et al., 2003). Cette organisation spatiale impose à la majorité des solutés présents dans le sang de traverser les astrocytes (en plus des cellules endothéliales) avant d’atteindre les neurones. Les astrocytes sont aussi en contact avec les synapses qu’ils entourent de leurs prolongements (Spacek, 1985).
Les astrocytes sont connectés entre eux par des jonctions GAP et forment un vaste syncytium. Les jonctions GAP sont constituées par l’apposition de deux connexons formés par 6 connexines. Différentes connexines existent, la connexine 43 étant l’isoforme astrocytaire majoritaire (Nagy et al., 2004). Les jonctions GAP laissent passer des molécules de taille inférieure à 1 kDa comme des ions (Ca2+, K+ …), des seconds messagers (ATP, IP3 …) et même des métabolites comme le glucose ou le glutamate (Bennett et al., 1991). Les astrocytes peuvent donc participer au transfert de substrats énergétiques et à la régulation du K+ et du glutamate à l’échelle du réseau (Theis et al., 2005). Le niveau d’expression et la perméabilité des jonctions GAP sont variables et peuvent être modulées par différents agents (neurotransmetteurs, Ca2+, phosphorylases…) ce qui change les propriétés du réseau astrocytaire (Giaume et McCarthy, 1996). Ainsi, les particularités anatomiques et le positionnement stratégique des astrocytes à l’interface entre les synapses et les capillaires sanguins laissent supposer que les astrocytes sont bien plus que des simples éléments structuraux pour le cerveau.
Les astrocytes interagissent avec les neurones
De nombreuses études sur les astrocytes ont permis de mettre en évidence des interactions fonctionnelles variées et complexes entre les neurones et les astrocytes et de clarifier leur rôle dans le fonctionnement cérébral. L’ensemble des fonctions potentiellement remplies par les astrocytes a été listé en 2003 par Ransom et al. .
Homéostasie ionique
Une des fonctions astrocytaires la mieux établie est la régulation de la concentration extracellulaire des ions K+ qui augmente avec l’activité neuronale. Les astrocytes ont une forte capacité à tamponner le potassium, en partie grâce au vaste syncytium qui permet une redistribution spatiale des ions excédentaires. Les astrocytes capturent le potassium extracellulaire par des canaux potassiques entrants, des pompes Na/K/ATPases et des cotransporteurs Na+ /K+ /Cl- . L’excès d’ion potassium est évacué dans la circulation sanguine par des canaux potassiques sortants au niveau des pieds astrocytaires (Walz, 2000; Simard et Nedergaard, 2004). Les astrocytes participent aussi à la régulation des ions H+ et HCO3- et par conséquence du pH (Chesler, 2003). De nombreux transporteurs tels que l’antiport Na+/H+ , les cotransporteurs Na+/HCO3- et Cl-/HCO3- sont exprimés par les astrocytes et participent au maintien d’un pH extracellulaire autour de 7. Enfin, les astrocytes participent à la régulation du niveau extracellulaire du Na+ et du Cl- (Simard et Nedergaard, 2004). Le contrôle des ions Cl- par les astrocytes est aussi impliqué dans la régulation du volume cellulaire et de l’osmolarité (Walz, 2002). L’aquaporine 4, qui est exprimée spécifiquement par les astrocytes et forme des canaux aqueux, participe aussi aux flux d’eau (Simard et Nedergaard, 2004).
Recapture des neurotransmetteurs
Les synapses sont entourées par des éléments astrocytaires qui délimitent la fente synaptique et empêchent la diffusion des neurotransmetteurs (Araque et al., 1999). Cette organisation en synapse ’tripartite’ permet une recapture efficace des neurotransmetteurs par les prolongements astrocytaires qui expriment des transporteurs à haute affinité pour le glutamate, le GABA ou la glycine (Masson et al., 1999). Ce mécanisme de recapture permet d’optimiser la neurotransmission (amélioration du rapport signal sur bruit, réduction du temps de stimulation de l’élément post-synaptique, restriction spatiale de la stimulation), de recycler les neurotransmetteurs et d’éviter leur accumulation, qui dans le cas du glutamate, peut être neurotoxique (Huang et Bergles, 2004, voir § E). De plus, les prolongements astrocytaires autour des synapses sont mobiles et dynamiques (Hirrlinger et al., 2004) ce qui peut induire des changements dans les propriétés de la neurotransmission. Par exemple, la réduction de la couverture astrocytaire des synapses dans l’hypothalamus en période de lactation entraîne une inhibition rétrograde de la libération de glutamate via la stimulation des récepteurs présynaptiques au glutamate mGluR (Oliet et al., 2001).
Régulation de la synaptogenèse
En plus de participer au fonctionnement des synapses, les astrocytes peuvent réguler leur mise en place au cours du développement et favoriser leur maintien (Slezak et Pfrieger, 2003). Ainsi, le nombre de synapses fonctionnelles formées par des neurones en culture augmente en présence d’astrocytes (Pfrieger et Barres, 1997). La production par les astrocytes de cholestérol associé à l’apolipoprotéine E (Mauch et al., 2001) et de thrombospondines (Christopherson et al., 2005) est impliquée dans le contrôle la synaptogénèse.
Régulation des espèces réactives oxydantes (ROS)
L’accumulation de ROS dans le cerveau a des effets délétères majeurs (péroxydation des lipides, nitrosylation des protéines, oxydation de l’ADN et formation de bases anormales…) et provoque une dégénérescence cellulaire (Halliwell, 1992; Fridovich, 1999). Les astrocytes résistent mieux que les neurones au stress oxydatif car ils expriment plus fortement des molécules à fort potentiel antioxydant comme le glutathion ou l’ascorbate ainsi que des enzymes détoxifiantes comme la catalase et la superoxyde dismutase (Pentreath et Slamon, 2000). Les astrocytes alimentent les neurones avec le glutathion réduit et participent à la détoxification des ROS extracellulaire, ce qui favorise la survie neuronale (Dringen et al., 2000).
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Table des matières
I. INTRODUCTION GÉNÉRALE
II. INTRODUCTION
A. Les astrocytes ont un rôle actif et primordial dans le fonctionnement cérébral
1. Les astrocytes
a. Les astrocytes : de la glue pour les neurones ?
b. Quelques particularités anatomiques des astrocytes
2. Les astrocytes interagissent avec les neurones
a. Homéostasie ionique
b. Recapture des neurotransmetteurs
c. Régulation de la synaptogenèse
d. Régulation des espèces réactives oxydantes (ROS)
e. Formation de la barrière hématoencéphalique (BHE)
f. Support trophique
3. Des fonctions ‘révolutionnaires’ pour les astrocytes
a. Les astrocytes participent à la neurogénèse
b. Les astrocytes modulent activement la neurotransmission
B. Les astrocytes deviennent activés en réponse à différentes atteintes cérébrales
1. Quelques caractéristiques de la réaction gliale
2. Les cascades moléculaires impliquées dans l’activation des astrocytes
3. L’activation astrocytaire : délétère ou bénéfique ?
a. Les astrocytes réactifs peuvent former une cicatrice gliale
b. Les astrocytes réactifs libèrent des molécules bénéfiques pour les neurones : facteurs neurotrophiques et molécules antioxydantes
c. Les astrocytes réactifs produisent des cytokines et peuvent participer à l’inflammation et à la réponse immunitaire .
d. D’autres caractéristiques des astrocytes réactifs
C. Le CNTF : un facteur neurotrophique activateur des astrocytes
1. Le CNTF : découverte et caractéristiques
a. Identification du CNTF
b. Profil d’expression du CNTF
c. La voie de signalisation du CNTF
d. Les expériences de knock-out: un autre ligand endogène pour le CNTFR-α?
2. Le CNTF : activateur endogène des astrocytes
3. Le CNTF a des effets neuroprotecteurs variés
a. Le CNTF et les motoneurones : implication pour la SLA
b. Le CNTF et les neurones du striatum : implication pour la MH
c. Autres cibles neuronales pour le CNTF
4. Les autres effets du CNTF
a. Le CNTF et les autres cellules gliales : cellules myélinisantes et microglie
b. Le CNTF et la différenciation cellulaire
c. Le CNTF dans l’hypothalamus : des effets proches de ceux de la leptine
d. Les effets périphériques du CNTF
D. Le métabolisme énergétique cérébral
1. Quelques particularités du métabolisme énergétique cérébral
a. Des besoins énergétiques très importants
b. Le glycogène : une réserve énergétique limitée
c. Le cerveau utilise le glucose comme substrat énergétique quasi-obligatoire
2. Les corps cétoniques peuvent constituer des substrats énergétiques alternatifs
a. Les corps cétoniques et la cétogénèse
– description de la cétogenèse
– régulation de la cétogenèse
b. Les voies de dégradation des corps cétoniques
– voie cytoplasmique
– voie d’oxydation mitochondriale
c. Mise en évidence de l’utilisation des corps cétoniques par le cerveau
– utilisation des corps cétoniques chez l’adulte
– utilisation des corps cétoniques au cours du développement
d. Régulation de l’utilisation cérébrale des CC
– régulation de l’entrée des CC dans le parenchyme cérébral
– régulation des enzymes de la voie de cétolyse
3. Les astrocytes au cœur des régulations métaboliques cérébrales
a. couplage neuro-métabolique
b. couplage neuro-vasculaire
c. couplage neuro-barrière
4. Déficits métaboliques et pathologies
a. Atteinte énergétique aigue : conditions ischémiques
b. Atteinte énergétique chronique : les maladies neurodégénératives
E. Le glutamate et les transporteurs au glutamate
1. Le glutamate
a. Le glutamate est un intermédiaire métabolique
b. Le glutamate est le principal neurotransmetteur excitateur
2. Les transporteurs au glutamate
a. La famille des transporteurs au glutamate
b. Fonctionnement des transporteurs au glutamate
c. Structure des transporteurs au glutamate
– topologie des transporteurs
– les glycosylations des transporteurs
d. Localisation subcellulaire des transporteurs au glutamate
– les transporteurs ne sont pas répartis uniformément dans les cellules
– les transporteurs sont enrichis dans des microdomaines membranaires : les rafts
e. Les mécanismes de régulation de la recapture de glutamate
– régulation du niveau d’expression des transporteurs
– régulation post-transcriptionnelle de l’activité des transporteurs
– régulation par des interactions protéiques
– régulation de la localisation subcellulaire des transporteurs
3. Glutamate et phénomènes d’excitotoxicité
a. L’excitotoxicité
b. Excitotoxicité et transporteurs au glutamate dans les pathologies cérébrales
– L’AVC
– la SLA
– La MH
c. Un modèle d’excitotoxicité : l’injection intrastriatale d’acide quinolinique (QA)
– découvertes et caractéristiques du QA
– mécanismes d’action du QA
III. MATÉRIELS ET MÉTHODES
A. Production des lentivirus
B. Injections stéréotaxiques
1. Injection des lentivirus
2. Injection intrastriatale de quinolinate
C. RT- PCR en temps réel
1. Purification des ARNm
2. Reverse transcription
3. PCR en temps réel
D. Immunohistologie
1. Obtention des coupes
2. Protocole d’immunohistochimie par détection au VIP
3. Protocole d’immunofluorescence
E. Histochimie
1. Histochimie de la β-hydroxybutyrate déshydrogénase (BDH)
2. Histochimie de la cytochrome oxydase (COX)
3. Histochimie de la succinate déshydrogénase (SDH)
4. Histochimie de la lactate déshydrogénase (LDH)
F. Analyse des coupes
1. Etude en microscopie confocale
2. Quantification de volume
3. Mesure de densité optique (D.O.)
G. Immunoblots
1. Préparation des homogénats de cerveaux
2. Electrophorèse, transfert et immunoblot
3. Déglycosylation in vitro
H. Microsopie électronique
I. Purification des rafts
J. Mesure de la recapture de [3 H]-D-Aspartate par les synaptosomes
1. Préparation des synaptosomes
2. Mesure de la recapture d’aspartate tritié
K. Microdialyse et dosage du glutamate par chromatographie liquide à haute performance
1. Microdialyse
2. Chromatographie liquide à haute performance (HPLC)
IV. CONCLUSION
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