L’embryon d’oursin, un modèle biologique incontournable

Le développement embryonnaire de l’oursin constitue un des modèles embryologiques les plus étudiés depuis plus d’un siècle (Derbès, 1847; Beetschen et Fischer, 2004). Ce modèle expérimental permet aux chercheurs de répondre à des questions qui peuvent aller de la polarisation embryonnaire ou larvaire aux problématiques du cycle cellulaire, en passant par les mécanismes moléculaires liés à la fécondation. Malgré le grand nombre d’études publiées, de multiples interrogations restent sans réponse ou sont reconsidérées grâce à de nouvelles approches conceptuelles et technologiques (par exemple : l’essor de la biologie moléculaire, les omics, la biologie systémique).

Les principales espèces « modèles »

Les oursins font partie du groupe des Echinodermes où se retrouvent également les étoiles de mer, les ophiures, les holothuries et les crinoïdes. Ce sont des invertébrés Deutérostomiens exclusivement marins, qui développent en 3 – 4 jours après fécondation, une larve pélagique appelée pluteus caractérisée par une symétrie bilatérale. Les plutei se métamorphosent après quelques semaines, en formant un rudiment à partir de la poche cœlomique gauche uniquement. Les adultes ont une symétrie penta-radiaire, sont benthiques et se nourrissent en broutant des algues ou du biofilm. La maturité sexuelle est atteinte après 6 mois environ. La capacité de produire des gamètes ne diminue pas jusqu’à la fin de la vie, qui peut atteindre une centaine d’années chez certaines espèces (Giudice, 1973; Ebert, 2008).

Giudice (1973) a recensé 26 espèces d’oursin au niveau mondial, qu’on peut retrouver dans l’océan Pacifique, Atlantique ou la Mer Méditerranée et qui ont été décrites au niveau de leur développement ainsi que leur saison de ponte. En France, les deux espèces auxquelles s’intéresse la majorité des laboratoires de recherche sont Paracentrotus lividus (« châtaigne de mer ») qui est l’oursin commun en Méditerranée et Atlantique et Sphaerechinus granularis (Figure 1.1.) qu’on retrouve également dans la Méditerranée et Atlantique, mais avec une distribution plus limitée, qui inclus notamment la pointe bretonne. A la Station Biologique de Roscoff, nous utilisons couramment les oursins S. granularis qui sont collectés en plongée au niveau de la Rade de Brest ou de l’Archipel des Glénans et maintenus en stabulation pendant plusieurs mois. L’induction expérimentale de la ponte chez S. granularis peut être effectuée tout au long de l’année, mais avec un optimum pendant le printemps et l’été, en contraste avec P. lividus qui présente une saisonnalité bien marquée au niveau de la production de gamètes : de janvier à juin en Méditerranée et de mars à septembre en Atlantique. La taille des adultes de S. granularis est de 2 à 3 fois supérieure par rapport à P. lividus. La quantité de ponte de S. granularis peut être de 20 à 50 mL d’ovules non fécondés (>10⁸ ovules d’un diamètre de 100µm). Ces aspects sont importants pour les approches biochimiques qui nécessitent une quantité importante de matériel biologique.

Données génomiques des échinodermes. Ressources disponibles en 2011 

La communauté internationale a publié le premier génome d’échinoderme en 2006 (Sodergren et al., 2006). Il s’agit du génome de Strongylocentrotus purpuratus (l’oursin commun californien) présent dans l’océan Pacifique, au long de la côte Nord-Américaine. Le séquençage du génome de 814 megabases de l’oursin a permis de mettre en évidence sa position clé dans l’arbre phylogénétique : les échinodermes sont les invertébrés les plus proches de la branche des Chordés. Les 29 144 gènes annotés (Cameron et al., 2009) incluent des représentants de presque toutes les familles de gènes des vertébrés. Certains de ces gènes qui étaient considérés spécifiques des vertébrés, ont été attribués plus largement aux deutérostomes. D’autres gènes identifiés chez l’oursin sont manquants de la lignée des chordés, indiquant une perte de ces gènes chez les vertébrés. L’étude de l’expression des gènes au niveau transcriptomique montre qu’entre 11 000 et 12 000 gènes sont employés pour l’embryogenèse chez l’oursin. Ces gènes codent majoritairement pour des facteurs de transcription et protéines de signalisation, ainsi que pour quelques familles de protéines impliquées dans le métabolisme et le cytosquelette (Samanta et al., 2006).

L’analyse génomique des éléments des voies de signalisation indique une forte ressemblance avec les voies de signalisation des vertébrés, mais souvent sans la complexité de la redondance génétique qui caractérise ces derniers. L’oursin n’a perdu aucune des 158 sous-familles de kinases primordiales des métazoaires, comme c’est le cas chez les insectes et les nématodes (Bradham et al., 2006). Les échinodermes possèdent également un système immunitaire inné très sophistiqué, et des gènes orthologues associés à la vision, l’ouïe, l’équilibre et la chemoreception des vertébrés, ce qui suggère des capacités sensorielles inconnues jusqu’à présent. De plus, il a été montré que 70% des gènes sont communs entre l’oursin et l’homme et beaucoup de voies de signalisation sont conservées. Les gènes associés à de nombreuses maladies humaines sont présents chez l’oursin (Sodergren et al., 2006).

Le génome de S. purpuratus constitue ainsi un outil très important. De plus, aujourd’hui, grâce aux techniques de séquençage à haut débit, plusieurs projets de séquençage des génomes et transcriptomes d’autres espèces d’échinodermes sont en cours. Au niveau européen, une banque EST est disponible pour P. lividus et son génome est en cours de séquençage et annotation. Pour S. granularis, à ce jour, seulement 47 séquences de protéines sont connues (selon NCBI).

L’ovogénèse et les principales étapes du développement chez l’oursin 

Les oursins sont gonochoriques et pour la plupart des espèces, les adultes ne présentent pas de dimorphisme sexuel. C’est le cas également de P. lividus et S. granularis. Les gamètes sont obtenus lorsqu’on induit la ponte en injectant dans la cavité générale de l’oursin de l’acétylcholine à 100mM. Une femelle pond jusqu’à 10⁸ ovules qui mesurent 100 µm de diamètre et qui sont entourés d’une enveloppe de polysaccharides appelée gangue. Ils contiennent des pigments caroténoïdes qui leur donnent une couleur orange. Les embryons et les plutei sont parfaitement transparents, adaptés à l’observation par microscopie optique.

En conditions naturelles, la maturation méiotique de l’ovocyte d’oursin a lieu avant la ponte, au niveau des ovaires. Le temps nécessaire pour la différentiation et la croissance d’une population d’ovocytes varie entre 1 et 3 mois, en fonction de l’espèce (Harvey, 1956; Walker et al., 2005; Song et al., 2006). Ce processus comporte des modifications majeures au niveau du gamète femelle (Figure 1.4), initialement une cellule souche de 10-15µm caractérisée par des multiplications mitotiques actives. Ces modifications incluent (1) l’entrée en méiose, (2) la vitellogenèse qui se déroule en deux phases : une de croissance lente et de réplication des organelles, et une deuxième phase d’incorporation rapide de nutriments, glycogène, lipides et vitellus, ensuite (3) la fin des divisions méiotiques marquée par l’expulsion successive des deux globules polaires qui mène à la formation du gamète femelle haploïde, concomitant à un changement global du pattern d’expression des ARNm de l’ovule (Song et al., 2006).  Au laboratoire, en conditions expérimentales un ovule d’oursin est viable pendant 2 à 3 jours (Meidel et Yund, 2001) et jusqu’à 7 jours selon d’autres auteurs (Spiegler et Oppenheimer, 1995). Chez un autre échinoderme, l’étoile de mer, la viabilité des ovocytes est plus courte, moins d’une journée. Ces ovocytes sont arrêtés en Prophase I, la reprise de la méiose est stimulée par la 1- méthyle-adénine sous contrôle hormonale (Guerrier et Doree, 1975), et la fécondation peut intervenir ensuite, pendant la méiose. Il a été montré qu’en absence de fécondation, l’ovocyte de l’étoile de mer entre en apoptose 10 heures après la rupture de l’enveloppe germinale (Sasaki et Chiba, 2004). Chez l’oursin, la mort des ovules par mort cellulaire programmée n’a pas été encore observée, même si les mécanismes moléculaires d’induction de l’apoptose sont présents dans l’ovule d’oursin (Voronina et Wessel, 2001; Le Bouffant et al., 2008a).

Après la maturation méiotique, les ovules d’oursin sont bloqués en phase G1 du cycle cellulaire et la fécondation provoque la reprise du cycle cellulaire (section 1.4). La fécondation est externe et déclenche la levée d’une enveloppe qui joue un rôle important contre la polyspermie (Vacquier, 2011). Cependant, en milieu naturel cette fonction de l’enveloppe de fécondation ne serait jamais exercée puisque la présence des conditions de polyspermie chez l’oursin en milieu marin semble impossible à cause de la dilution et du brassage important de l’eau (Dale et Defelice, 2011).

Les deux premiers clivages sont méridionaux selon l’axe AV (pôle animal-pôle végétatif) et aboutissent au stade 4 cellules, 3 heures après la fécondation. Le troisième clivage est équatorial, après lequel 8 blastomères symétriques sont formés. Les divisions suivantes sont asymétriques et forment une morula caractérisée par une succession spécifique de ses blastomères selon l’axe AV : mesomères, macromères et les micromères qui jouent un rôle essentiel dans la lignée des cellules germinales et la formation des gonades du futur adulte (Yajima et Wessel, 2011). Au stade blastula, l’embryon éclot de son enveloppe et peut nager dans la colonne d’eau grâce à la ciliature de l’ectoderme. La formation de l’archentéron (intestin primitif) se fait par invagination au niveau du pôle végétatif. Cette étape est spécifique du stade gastrula qui intervient à 30 heures après fécondation chez P. lividus et à 40 heures après fécondation chez S. granularis. L’archentéron de la gastrula s’allonge jusqu’à atteindre l’ectoderme latéral où se forme l’orifice buccal de la future larve, preuve de l’appartenance aux deutérostomiens. Le pluteus présente une symétrie bilatérale et se nourrit activement dans la colonne d’eau par filtration jusqu’à la formation d’un rudiment à partir de la poche cœlomique gauche (hydrocoele), qui donne naissance à un juvénile avec une symétrie pentaradiaire, lors de la métamorphose. Cette étape est simultanée avec sa sédimentation au fond de l’eau, où le futur adulte va mener toute sa vie, en broutant le biofilm et les algues benthiques. (Ebert et Southon, 2003).

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Table des matières

I. INTRODUCTION
1. L’embryon d’oursin, un modèle biologique incontournable
1.1. Les principales espèces « modèles »
1.2. Données génomiques des échinodermes. Ressources disponibles en 2011
1.3. L’ovogénèse et les principales étapes du développement chez l’oursin
1.4. L’étude du cycle cellulaire et le développement précoce de l’oursin
1.5. L’embryon d’oursin et la synthèse protéique
1.6. Exemples d’ARNm recrutés sélectivement dans les polysomes
2. Régulations post-transcriptionnelles de l’expression des gènes chez les eucaryotes
2.1. L’ARN messager : de la transcription à la traduction
2.2. La régulation de la synthèse protéique
2.2.1. L’initiation de la synthèse protéique
L’initiation dépendante de la coiffe
La traduction IRES (Internal Ribosome Entry Site) dépendante
Le modèle hybride d’initiation
2.3. Acteurs régulateurs clés au niveau de l’initiation
2.3.1. Régulation du complexe eIF4F
2.3.2. Le facteur eIF2
2.3.2.1. La structure d’eIF2
2.3.2.2. Le facteur eIF2B
2.3.2.3. Le facteur eIF5
2.3.2.4. Régulation de la phosphorylation d’eIF2
2.3.2.5. Conséquences de la phosphorylation d’eIF2 sur la traduction qualitative d’ARNm
2.3.2.6. Les kinases d’eIF2
2.4. Importance de la régulation traductionnelle dans différents contextes
2.4.1. Traduction et apoptose
2.4.1.1. Les acteurs de l’apoptose
2.4.1.2. L’implication des facteurs de traduction en apoptose
2.4.2. Traduction et cancer
3. Régulation traductionnelle dans l’embryon d’oursin
3.1. Les eIFs et la fécondation
3.2. Les eIFs et les conditions de stress/apoptose
4. Objectifs de la thèse
II. RESULTATS
1. Le rôle de la phosphorylation d’eIF2 dans les ovules et embryons d’oursin, en réponse à la fécondation
2. Le recrutement polysomal dans les embryons d’oursin
2.1. Matériel et Méthodes
2.2. Le traductome en conditions physiologiques chez l’oursin
2.2.1. La synthèse protéique est nécessaire pour le maintien de la phosphorylation d’eIF2 et la présence de 4E-BP avant fécondation
2.2.2. Modifications des facteurs de traduction en réponse à la fécondation chez P.lividus
2.2.3. Le profil de polysomes dans les ovules et embryons d’oursin
2.2.4. Ratio polysomes/monosomes au cours du développement
2.2.5. Vérification des ARN extraits à partir des fractions polysomales
2.2.6. Séquençage à haut débit et données du traductome
2.3. Le traductome et l’induction de l’apoptose dans les embryons d’oursin
2.3.1. La phosphorylation d’eIF2 et l’induction de l’apoptose dans les traitements au MMS n’est pas sous dépendance transcriptionnelle.
2.3.2. Activation de GCN2 en réponse au MMS
2.3.3. L’induction de l’apoptose dans les embryons de P. lividus
2.3.4. Profil des polysomes lors de l’induction de l’apoptose
2.3.5. Séquençage à haut-débit des transcrits traduits lors de l’induction de l’apoptose chez l’oursin
III. SYNTHESE, DISCUSSION, CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
Bibliographie
Annexe

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