Soutenance mémoire
Lecture des étalements de sperme
MATERIEL ET METHODE
Organisation de l’étude
La récolte des échantillons et des données s’est déroulée du 9 au 12 septembre 2013 au Centre de monte mulassier et équin de Seyne-les-Alpes, dans le département des Alpes-de-Haute-Provence (04). Les participants de l’étude sont la Fédération Régionale des Groupements de Défense Sanitaire de la région ProvenceAlpes-Côte d’Azur (FRGDS PACA), l’École Nationale Vétérinaire de Toulouse (ENVT) et les éleveurs de la région PACA.
Au total, 43 taureaux de races allaitantes âgés de 1,5 à 8,5 ans (moyenne ± écarttype : 3,8 ± 1,9 ans) pratiquant la monte naturelle ont été présentés par des éleveurs volontaires (Tableau 1). Sur ces 43 taureaux, 2 taureaux limousins n’ont pas été prélevés pour raison de sécurité et un éleveur a refusé le prélèvement de son taureau blond d’Aquitaine. Sur les 40 taureaux restants, quatre n’ont pas pu être prélevés en raison de défauts de réponse à l’électroéjaculateur.
Sur les 36 taureaux prélevés lors de l’expérimentation, 29 taureaux présentaient une sérologie positive à la besnoitiose dont 12 présentaient des signes cliniques. Les 8 autres taureaux étaient séronégatifs.
La contention de ces taureaux a été possible par l’utilisation d’une cage de contention permettant un accès aisé à l’appareil génital du taureau.
La récolte de sperme
La récolte de la semence a été réalisée à l’aide d’un électro-éjaculateur. Une sonde rectale Electrojac5® (Ideal® Instruments, MI, USA) a été utilisée (Photographie 1).
Les étapes successives de la collecte ont débuté par un nettoyage soigneux de la région préputiale du taureau à l’aide d’un savon antiseptique iodé (Vétédine savonND, Vétoquinol, Lure), suivi d’un rinçage abondant à l’eau claire et d’un séchage au papier jetable. Simultanément, un deuxième opérateur massait, par voie transrectale, les glandes annexes dans le but de stimuler les sécrétions préspermatiques.Après avoir préalablement vidé le rectum, la sonde transrectale était introduite dans le rectum (électrodes dirigées ventralement) et l’intensité de la stimulation électrique était progressivement augmentée manuellement jusqu’à obtenir l’éjaculation. L’éjaculat a été récupéré dans un tube de collecte de type FalconND grâce à un cône de prélèvement. Le tube a été maintenu à la température de 37°C et a été directement transféré au laboratoire, adjacent au hangar de collecte.
Examen de la semence
L’examen de la semence a été réalisé immédiatement après la récolte par deux opérateurs expérimentés dans le laboratoire adjacent (Photographie 2). Ces deux opérateurs se sont mis en accord pour les différentes mesures. Les différentes étapes de cet examen ont été décrites par Dumont (1997). Les résultats de spermogramme attendus chez un taureau de monte naturelle sont présentés dans le Tableau 16 (Annexe I).
Les données obtenues lors de cet examen ont été analysées dans la thèse de Simon FLORENTIN (« La semence de taureaux infectés par Besnoitia besnoiti : moindre qualité et source de contamination ? »).
a. Aspect macroscopique de l’éjaculat : volume, couleur et consistance
Directement après prélèvement, le volume de l’éjaculat a été mesuré par lecture des graduations du tube collecteur (type FalconND). Simultanément, la couleur et la consistance ont été appréciées.
b. Concentration
L’évaluation de la concentration a été réalisée par spectrophotométrie (Accuread, IMV, L’Aigle) selon les recommandations du fabricant.
c. Motilité massale
Directement après le prélèvement de la semence, une goutte de sperme a été déposée à la surface d’une lame préalablement chauffée à 37°C. La goutte a été observée sous microscope au grossissement x100.
d. Motilité individuelle
L’évaluation de la motilité individuelle a été réalisée par observation, au microscope à contraste de phase, d’une goutte de sperme entre lame et lamelle, préalablement chauffées à 37°C, au grossissement x100.
La lecture a été réalisée après dilution du sperme avec le dilueur, à base de lécithine de soja, Bioxcell® (IMV technologies, L’Aigle) maintenu à 37°C. La dilution a pour but de permettre d’individualiser chaque spermatozoïde en mouvement.
L’évaluation de la motilité individuelle consiste en l’estimation du pourcentage de spermatozoïdes mobiles par rapport au nombre de spermatozoïdes totaux. Les spermatozoïdes effectuant des mouvements sur place, tournant en petits cercles ou se déplaçant en arrière du fait d’une queue repliée ne sont pas comptabilisés comme mobile.
Réalisation des lames colorées
Dans un même temps étaient réalisées les lames permettant l’évaluation des pourcentages de spermatozoïdes morts et de spermatozoïdes présentant des anomalies morphologiques. Cette opération a été effectuée par deux opérateurs : un opérateur n’ayant jamais réalisé de spermogramme, qualifié de novice, et un opérateur réalisant régulièrement des spermogrammes depuis plusieurs années, qualifié d’expérimenté.
Chaque éjaculat a été analysé à l’aide de trois kits de coloration différents : le kit Vita-Eosine®, le kit Sperm VitalStain® et le kit Spermoscan®. Chaque coloration a été doublée. Les deux opérateurs réalisaient chacun un jeu de lame.
Au début de l’expérimentation, les éjaculats fortement concentrés ont été dilués avec le dilueur Bioxcell® maintenu à la température de 37°C. La dilution a pour but de faciliter la lecture ultérieure en permettant d’individualiser plus facilement les spermatozoïdes (diminution du nombre de spermatozoïdes sur un champ du microscope). Suite à l’observation directe de la faible vitalité des spermatozoïdes de ces quelques lames, il a été décidé de réaliser d’une part un jeu de frottis avec du sperme dilué, et d’autre part, un jeu de frottis avec du sperme non dilué afin d’évaluer l’effet du dilueur sur la vitalité. Chaque échantillon de semence de taureau a fait l’objet de 6 étalements (3 dilués et 3 non dilués).Chaque frottis a été mis à sécher plusieurs heures à l’air libre, à température ambiante. Suite à ce séchage, les lames ont été lutées à l’aide d’Histolaque LMR® (Labomoderne, Paris), laque transparente à séchage rapide. Ceci a permis une lecture différée dans le temps des lames sans altération de la qualité de la coloration.
Réalisation de la coloration Vita-Eosine®
Le kit Vita-Eosine® comporte une solution d’éosine concentrée à 2 % et une solution de nigrosine concentrée à 2 %. Pour la réalisation des lames colorées avec le kit Vita-Eosine®, 50 µL de sperme et 50 µL de solution d’éosine ont été mélangés dans un tube Eppendorf puis agités 30 secondes. À ce mélange, il a été ajouté 100 µL de solution de nigrosine. Ce type de méthode peut être considéré comme une coloration à l’éosine-nigrosine en deux étapes (cf. Figure 1).
Le frottis a été réalisé en étalant une goutte du mélange sur une lame à l’aide d’une lame rodée inclinée à 45°.
Réalisation de la coloration Sperm VitalStain®
Le kit Sperm VitalStain® comporte un unique flacon de colorant constitué de 0,67 % d’éosine Y et de 10 % de nigrosine dilués avec du sodium chloride à 0,9 %. Pour la réalisation des lames colorées avec le kit Sperm VitalStain®, 50 µL de sperme et 50 µL de VitalStain ont été mélangés dans un tube Eppendorf. Après avoir agité le tube,le mélange a été mis à incuber 30 secondes, à température ambiante. Ce type de méthode peut être considéré comme une coloration à l’éosine-nigrosine en une étape.Le frottis a été réalisé en étalant une goutte du mélange sur une lame à l’aide d’une lame rodée inclinée à 45°.
|
Guide du mémoire de fin d’études avec la catégorie Réalisation des lames colorées |
|
Étudiant en université, dans une école supérieur ou d’ingénieur, et que vous cherchez des ressources pédagogiques entièrement gratuites, il est jamais trop tard pour commencer à apprendre et consulter une liste des projets proposées cette année, vous trouverez ici des centaines de rapports pfe spécialement conçu pour vous aider à rédiger votre rapport de stage, vous prouvez les télécharger librement en divers formats (DOC, RAR, PDF).. Tout ce que vous devez faire est de télécharger le pfe et ouvrir le fichier PDF ou DOC. Ce rapport complet, pour aider les autres étudiants dans leurs propres travaux, est classé dans la catégorie La récolte de sperme où vous pouvez trouver aussi quelques autres mémoires de fin d’études similaires.
|
Table des matières
Liste des abréviations
Table des illustrations
1. Liste des Figures
2. Liste des Tableaux
3. Liste des Graphiques
4. Liste des Photographies
INTRODUCTION
I. MATERIEL ET METHODE
1. Organisation de l’étude
2. La récolte de sperme
3. Examen de la semence
a. Aspect macroscopique de l’éjaculat : volume, couleur et consistance
b. Concentration
c. Motilité massale
d. Motilité individuelle
4. Réalisation des lames colorées
a. Réalisation de la coloration Vita-Eosine®
b. Réalisation de la coloration Sperm VitalStain®
c. Réalisation de la coloration Spermoscan®
5. Lecture des étalements de sperme
a. Mode de lecture
b. Évaluation du pourcentage de spermatozoïdes vivants et morts
c. Spermocytogramme
6. Analyse statistique
II. RESULTATS
1. Appréciation des colorations par les opérateurs
2. Evaluation de la vitalité (pourcentage de spermatozoïdes morts)
a. Relation entre l’opérateur, le dilueur et la coloration
b. Relation entre le pourcentage de spermatozoïdes vivants et la motilité individuelle
3. Evaluation des anomalies morphologiques
a. Relation entre l’opérateur et les anomalies morphologiques
b. Relation entre la dilution et les anomalies morphologiques
c. Relation entre la coloration et les anomalies morphologiques
III. DISCUSSION
1. Discussion du matériel et méthode
a. Choix des animaux utilisés
b. Choix de la méthode de collecte : l’électroéjaculateur
c. Choix du nombre de spermatozoïdes comptés
2. Analyse et discussion des résultats
a. Avantages et inconvénients de chaque coloration
b. Evaluation de la vitalité
c. Effet de l’opérateur sur les résultats du spermocytogramme
d. Effet des colorants sur les résultats du spermocytogramme
e. Effet du dilueur sur les résultats du spermocytogramme
3. Limites et perspectives
CONCLUSION
Bibliographie
ANNEXES
Télécharger le rapport complet
