Le riz

Le riz 

Le riz : plante de grande culture et plante modèle

Le genre botanique Oryza regroupe des riz sauvages et les riz cultivés. Ce sont des monocotylédones de la famille des Poacées, ordre des Cypérales, classe des Liliopsidés (Conquist, 1988). Le genre Oryza comprend 24 espèces dont deux seulement sont cultivées. Suite à différentes études, tant morphologiques que moléculaires, ces différentes espèces ont été réparties en complexes selon différentes modalités. Ge et al. (2001) proposent, sur des bases moléculaires, une division en quatre complexes (sativa, officinalis, ridleyi et meyeriana), qui se rapproche de la division en sections et en séries proposée par le Genetic Ressources Center+ (Centre des Ressources Génétiques, GRC) sur des bases morphologiques (tableau A1). Le complexe sativa de Ge et al. comprend les deux espèces de riz cultivés, Oryza sativa L. et Oryza glaberrima Steud, ainsi que les six espèces sauvages qui leur sont apparentées : O. barthii A. Chev., O. glumaepatula Steud, O. longistaminata A. Chev. et Roehr., O. meridionalis Ng., O. nivara Sharma et Shastry, et O. rufipogon Griff. Toutes les espèces de ce groupe sont diploïdes, de génome AA, avec 2n = 24. Les espèces cultivées sont annuelles avec une autogamie prépondérante. Les espèces sauvages sont pérennes ou annuelles, allogames ou autogames (Arraudeau, 1998). Les riz sauvages du complexe Sativa se répartissent dans toute la zone intertropicale à l’exception des îles du Pacifique (figure A1a). Aux Amériques, O. glumaepatula a une aire de répartition s’étendant des bassins de l’Amazone et de l’Orénoque jusqu’au sud du Mexique et aux Antilles. En Afrique équatoriale, on trouve O. barthii et O. longistaminata qui est aussi présent à Madagascar. En Asie, dans un triangle dont la base court de la frontière indopakistanaise à Taiwan et dont la pointe se trouve dans le nord de l’Australie, on trouve O. rufipogon. A l’intérieur de cette zone, on trouve deux autres espèces, O. nivara+ dans le Deccan, les contreforts himalayens et la péninsule indochinoise, et O. meridionalis au nord de l’Australie et au sud de l’île de Nouvelle Guinée (figure A1a). Les riz cultivés : diversité Le caractère morphologique essentiel permettant de différencier les deux espèces cultivées du riz est la longueur de la ligule toujours plus courte et tronquée chez O. glaberrima (7 mm au maximum contre 8 à 45 mm pour O. sativa) (Arraudeau, 1998). Oryza glaberrima, originaire d’Afrique, est uniquement cultivée dans la zone subsaharienne (figure A1a). Les surfaces cultivées sont en constante régression du fait de ses faibles qualités agronomiques (sensibilité à la photopériode, à la verse, égrenage spontané et faible productivité) et de l’introduction de l’espèce asiatique dans la région. Des études enzymatiques ont montré que cette espèce présente une moindre diversité génétique avec moins de polymorphisme que chez Oryza sativa. Oryza sativa est l’espèce la plus cultivée dans le monde. Elle présente une très grande diversité de formes avec plus de 100 000 cultivars répertoriés dans la collection mondiale dont 65 000 sont gérés par le Genetic Resources Center (GRC++) au sein de l’International Rice Research Institute (IRRI) aux Philippines. La structuration de cette diversité intraspécifique est très forte et très particulière. Sa compréhension a permis de grands progrès dans la définition des stratégies raisonnées d’amélioration génétique du riz. L’espèce a tout d’abord été subdivisée en deux sous espèces, indica et japonica, sur la base d’observations phénotypiques, sérologiques et de barrières reproductives (Kato et al., 1928). La variété type du groupe indica se caractérise par un fort tallage, des feuilles étroites et des grains longs et minces. Le groupe japonica possède trois types morphologiques. Le type tempéré, japonica au sens strict, possède un tallage moyen, des feuilles fines, des grains arrondis et courts. Le type tropical, appelé parfois javanica, se distingue par un tallage réduit, des feuilles larges et des grains longs et larges. Le troisième type est intermédiaire entre les deux précédents (Jacquot & Clement, 1995). Les études isoenzymatiques menées sur un large échantillon de la collection mondiale ont permis de mieux cerner cette diversité. Six groupes isoenzymatiques ont été identifiés et définis en fonction de leur distance génétique (Glaszmann, 1987). L’utilisation des marqueurs moléculaires du type RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ont abouti à confirmer la classification obtenue grâce aux marqueurs isozymes (Arraudeau, 1998). Parmi ces six groupes, ceux regroupant le plus grand nombre de variétés correspondent aux deux sous-espèces déjà définies : japonica (groupe VI) et indica (groupe I). Les groupes III et IV, originaires du Bengladesh, correspondent à des riz supportant de longues et profondes submersions et capables de les compenser par une croissance importante (jusqu’à 6m). Le groupe V, présent dans une bande allant de l’Iran à la Birmanie, correspond à des riz de haute qualité, parmi lesquels le Basmati des contreforts himalayens ou les riz Sadri d’Iran. Les riz du groupe II coexistent avec les riz indica en Inde, au Pakistan, au Népal et au Bengladesh. Au Bengladesh et dans les régions environnantes de l’Inde, le groupe II s’identifie clairement avec l’écotype « Aus ». Ce sont des riz de cycle court, pouvant être cultivés dans des conditions hydriques très variables (Glaszmann, 1987). La structuration de la diversité du riz en deux grands pôles (groupe VI – japonica et groupe I – indica) a amené Second (1982) à faire l’hypothèse que la domestication du riz s’est faite séparément dans deux régions différentes de part et d’autre de l’Himalaya à partir de deux populations différentes de O. rufipogon (figure A1b). Selon d’autres auteurs, dont Oka (1974), la domestication du riz s’est faite dans une seule zone. La structuration de la population actuelle proviendrait de variations locales des conditions de culture, en particulier liées à l’altitude. Cette hypothèse s’appuie sur le fait que des grains de riz trouvés lors de fouilles archéologiques présentent des morphologies intermédiaires entre indica et japonica et présentent aussi des caractéristiques de riz sauvages (Zhang & Yuan, 1998 in Liu, 2000+). Cependant, l’étude comparée de génomes indica et japonica semble indiquer que la séparation entre les deux groupes date d’avant le processus de domestication (Panaud, 2002, communication personnelle), ce qui semble renforcer l’hypothèse d’une double domestication avancée par Second (1982).

importance économique du riz

La culture du riz Le riz, au même titre que le blé, est une culture ancienne. Les premières traces de sa culture remontent à 5000 ans avant notre ère (Hingham, 1989). Il constitue l’aliment de base des habitants d’un grand nombre de pays en voie de développement, et la moitié de la population mondiale en consomme régulièrement. Les cultures de riz couvrent environ 150 millions d’hectares, soit plus du dixième de l’ensemble des surfaces cultivées. L’essentiel des surfaces (132 sur 150 millions d’hectares) se situe dans les zones humides tropicales et subtropicales soumises au régime de la mousson. Près de 90 % de ces surfaces se trouvent localisées en Asie alors que les 10 % restant se répartissent sur tous les autres continents. Le riz, cultivé entre 40° de latitude sud et 53° de latitude nord, se développe dans un très large éventail de milieux en terme de topographie, type de sol, régime hydrique et facteurs climatiques. Le riz est aussi cultivé sous toutes les altitudes, de 0 à 1800 mètres à Madagascar ou 2400 au Népal ou sur les hauts plateaux andins (M. Valès, communication personnelle). Les conditions d’environnement dans lesquelles le riz est cultivé sont généralement classées en fonction du régime hydrique. Lorsqu’il y a submersion, la riziculture est dite irriguée s’il y a contrôle de l’eau et inondée dans le cas contraire. Lorsqu’il n’y a pas submersion pendant la culture, la riziculture peut être strictement pluviale ou pluviale sur nappe (Arraudeau, 1998 ; Chaïr, 1995). maîtrise de l’eau (figure A2). Malgré cette irrégularité, un certain nombre de projections relatives à la production ont pu être établies. Les superficies cultivées au niveau mondial devraient progresser lentement au rythme de 0,12 % par an, soit la moitié seulement de la croissance annuelle intervenue au cours des vingt dernières années (figure A2). Le taux de croissance du rendement moyen prévu d’ici 2004 est comparable à celui enregistré au cours des six dernières années, qui était de 1,16 %. Cependant, cette projection est bien inférieure au taux de 2,04 % enregistré au cours des vingt dernières années. La lutte contre les maladies du riz, en particulier par l’utilisation de résistances variétales, semble être l’une des solutions à apporter face à cette stagnation des rendements.

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Table des matières

REMERCIEMENTS
INTRODUCTION GENERALE
I) Présentation du pathosystème
1) Le riz : plante de grande culture et plante modèle
a) présentation botanique du riz b) importance économique du riz
c) Le riz en tant que plante modèle
2) Magnaporthe grisea, agent causal de la pyriculariose du riz
a) Symptomatologie et importance de la maladie
b) Morphologie, taxonomie
c) Cycle de multiplication et épidémiologie de Magnaporthe grisea
d) Méthodes de lutte
e) Un agent pathogène fongique modèle
II) Interaction gène de résistance – gène d’avirulence
1) La théorie gène – pour – gène et la réaction hypersensible
a) Les gènes « majeurs » de résistance
b) La théorie gène – pour – gène
c) La réaction hypersensible
2) Les gènes de résistance : structures et organisation génomique
a) Structures moléculaires des gènes de résistance
b) Organisation des gènes de résistance dans le génome
3) Les interactions plantes – bactéries phytopathogènes :
un modèle permettant de proposer des théories
moléculaires de l’interaction gène – pour – gène
a) Quel rôle pour les facteurs d’avirulence bactériens ?
b) Une première théorie moléculaire de l’interaction gène – pour – gène
c) L’hypothèse du protecteur (« Guard hypothesis »)
d) Conclusion : le modèle initial est remis en cause
4) Les interaction plantes – champignon : un domaine encore
peu défriché au niveau moléculaire.
a) L’interaction Cladosporium fulvum – Lycopersicon esculentum
b) L’interaction Oryza sativa – Magnaporthe grisea
III) Objectifs de cette thèse
1) Le gène d’avirulence ACE1
a) Structure du gène 69
b) Diversité et rôle de ACE1 dans le pouvoir pathogène
2) Pourquoi étudier Pi33 ?
a) Etude de l’interaction
b) Un gène de résistance intéressant pour le sélectionneur
3) Objectifs et stratégie employée
a) Clonage d’un gène de résistance
b) Caractérisation de Pi33 comme nouveau gène de résistance
I) Matériels
1) Matériel fongique
2) Matériel végétal
a) Variétés de riz
b) Lignées IR64 × Azucena
c) Lignées JX17 × ZYQ8 87
3) Banques génomiques
a) Banque de clones YAC de la variété Nipponbare du riz
b) Banques BAC
c) Contigs de la banque Nipponbare (OSJNBa)
II) Caractérisation et cartographie génétique de Pi-33
1) Détermination de la présence de Pi33 dans les lignées de riz étudiées
a) Culture du riz
b) Préparation de l’inoculum
c) Inoculation, lecture des symptômes 2) Recherche et cartographie de marqueurs proches de Pi33
a) synthèse de marqueurs RFLP à partir de séquences connues
b) Synthèse de sondes d’extrémités de YAC
c) Réalisation de membranes RFLP, marquage des sondes et hybridation
d) Marqueurs microsatellites
e) Sélection de marqueurs AFLP par Bulk Segregant Analysis
III) Cartographie physique et analyse de séquences
1) Hybridation sur membranes BAC
a) Confection des membranes
b) Conditions d’hybridation
2) Synthèse de sondes à partir de clones BAC
a) Reverse Southern
b) Utilisation de BAC entiers
c) Synthèse de sondes d’extrémité de BAC 3) Marche in silico
4) Recherche de RGA
5) Analyse de séquences
a) Comparaison de séquences, recherches des séquences répétées
b) Détection et analyse des séquences exprimées
IV) Transformation du riz par bombardement
1) De la graine au cal transformé
a) Induction de la callogenèse b) Transformation
c) Culture sur un milieu de sélection
2) Du cal à la plante
a) Prérégénération, régénération
b) Culture des plantes en milieu artificiel
c) Culture en Jiffy® et conditions d’inoculation
CARACTERISATION ET CARTOGRAPHIE FINE
D’UN NOUVEAU GENE DE RESISTANCE : Pi33
I) Caractérisation d’un nouveau gène de résistance, Pi33
1) Recherche et cartographie de la résistance correspondant à ACE1
2) Distinction entre Pi33 et les autres gènes de résistance
a) Utilisation des lignées isogéniques et des cultivars différentiels
b) Tests d’allélisme
3) Caractère dominant de Pi33
a) plantes F1
b) plantes F2 II) Densification de la carte IR64 × Azucena dans la zone de Pi33
1) Cartographie fine de Pi33
a) Observations sur les 105 premières lignées
b) Recherche des recombinants dans la région de Pi33
c) Cartographie fine de Pi33
2) Recherche de marqueurs liés à Pi33
a) Cartographie des marqueurs microsatellites
b) marqueurs RFLP
c) Sélection de marqueurs AFLP par Bulk Segregant Analysis
d) Marqueurs YAC end
e) Conclusion
III) Discussion
1) Identification de Pi33, un nouveau gène de résistance du riz
a) Différentes méthodes d’identification de nouveaux gènes de résistance.
b) Limites
c) Utilisation de couples de lignées isogéniques
3) Hypothèses sur l’origine de Pi1
2) Cartographie fine de Pi33
a) Intérêt de cloner Pi33
b) Nécessité d’une cartographie fine, comparaison avec d’autres études
c) Autres utilités de la cartographie fine
CARTOGRAPHIE PHYSIQUE DE PI33, TEST DE
COMPLEMENTATION, ET ETUDE DE LA
SEQUENCE AU NIVEAU DE CE GENE
I) Cartographie physique de Pi33 chez IR64 et Azucena
1) Cartographie physique des marqueurs de la zone de Pi33
a) Marqueurs RFLP
b) Marqueurs d’extrémité de YAC
2) Marche chromosomique dans Nipponbare
a) De G1010 vers R1813
b) De R1813 vers Y2643L : Echec de diverses tentatives
c) De Y2643L vers R1813 : Utilisation de la PCR walking
d) Validation de la marche chromosomique par cartographie génétique
e) Conclusion
3) Cartographie physique de Pi33 dans la banque IR64 (OSIIBb)
a) Cartographie dans la banque IR64 (OSIIBb) de
sondes déjà cartographiées dans la banque Nipponbare (OSJNBa)
b) Confirmation de la carte physique du locus de Pi33 chez IR64
c) Confirmation de la cartographie physique par cartographie génétique
4) Recherche d’homologues à des gènes de résistance (RGA)
II) Test de complémentation
1) Efficacité de la transformation
2) Tests de résistance
III) Etude de la séquence du locus de Pi33
1) Structure de la séquence de Nipponbare
a) Séquences répétées
b) Gènes
2) Les contigs de séquence indica
a) Présentation de cette séquence, utilité de son étude
b) Alignement des séquences indica et japonica
c) Etude de certains contigs indica
IV) Discussion
1) Marche chromosomique
2) Cartographie physique comparée
3) Tentative d’affinement de la cartographie physique (test de complémentation)
4) Pi33 est-il un gène centromérique ?
5) Etude des gènes prédits dans la séquence Nipponbare
6) Perspectives
DIVERSITE AU NIVEAU DU LOCUS DE PI33,
ORIGINE DE CE GENE PARMI LES PARENTS D’IR64
I) Résultats
1) Recherche du gène de résistance Pi33 dans la généalogie d’IR64
a) Géniteurs « primaires »
b) Utilisation des autres membres de la généalogie de IR64
c) Conclusion
2) Analyse de la diversité dans la zone de Pi33 :
Etude moléculaire des parents de IR64 et d’autres variétés
a) Diversité des marqueurs SSR
b) Marqueurs RFLP
c) Structure de la diversité génétique du locus de Pi33
d) Présence de Pi33 et diversité des marqueurs
II) Discussion
1) Intérêt de cette étude dans le cadre d’une
stratégie de sélection assistée par marqueurs
2) Diversité autour de Pi33
a) Plusieurs gènes ?
b) Une origine ancienne ?
3) Perspectives
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
I) Cartographie génétique et diversité
II) Cartographie physique et clonage
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXES
Annexe 1 : Culture du riz en serre, préparation de l’inoculum, inoculation
a) Culture du riz en serre
b) Préparation de l’inoculum
c) Inoculation, lecture des symptômes
Annexe 2 : Milieux de culture pour les micro-organismes, antibiotiques
a) Milieu LB
b) Milieu 2YT
c) Milieu YPD
d) Milieu ” Farine de riz ”
Annexe 3 : Protocoles d’extraction d’ADN
a) ADN plasmidique : miniprep lyse alcaline
b) ADN BAC : protocoles d’extraction 269
c) Maxiprep d’ADN génomique bactérien (D’après Gabriel et De Feyter, 1992)
d) Extraction d’ADN végétal (Hoisington, 1992)
e) Extraction de l’ADN génomique de levure
f) Extraction grossière d’ADN à partir d’un morceau de gel d’agarose
Annexe 4 : amplification PCR de séquences connues
a) Mélange PCR
b) ADN
c) Cycle
d) Oligonucléotides utilisés
Annexe 5 : Ligation, transformation par choc thermique
a) Ligation
b) Transformation
Annexe 6 : Séquences des marqueurs G1010, R1813, C483,
S10038C, Os.r6
a) Sonde G1010
b) Sonde R1813
c) Sonde S10038C
d) Sonde Os-r6.3
e) Sonde C483
Annexe 7 : PCR Walking
a) Principe
b) Préparation de l’adaptateur
c) Digestion – Ligation
d) Première PCR
e) Seconde PCR
f) Observation des amplifications, synthèse des sondes
Annexe 8 : Digestion de l’ADN, transfert sur membrane
a) Digestion
b) Précipitation
c) Electrophorèse, transfert
Annexe 9 : Marquage radioactif d’une sonde ADN
a) ADN obtenu par PCR préparative ou par PCR walking
b) ADN provenant d’une extraction grossière depuis un gel d’agarose
c) ADN provenant directement d’un clone BAC
d) ADN génomique de riz
Annexe 10 : Hybridation et deshybridation des membranes
a) Membranes RFLP
b) Membranes Haute Densité (HD) BAC
Annexe 11 : AFLP
a) Digestion
b) Ligation des adaptateurs
c) Préamplification
d) Marquage de l’amorce
e) Amplification AFLP
f) Pré-dépôt, migration, révélation
Annexe 12 : Confection de membranes BAC à haute densité
a) Repiquage de la banque
b) Repiquage des clones sur la membrane
c) Dénaturation
Annexe 13 : Milieux d’induction,
de transformation et de culture des cals et plantules de riz
a) Solutions mères
b) Confection des milieux
Annexe 14 : Protocoles liés à la transgenèse
a) Désinfection des grains
b) Sélection des cals secondaires pour la transformation
c) Préparation des cals pour la transformation
d) Préparation du matériel pour la transformation
e) Réalisation du bombardement
Annexe 15 : Publication sous presse dans TAG
Annexe 16 : Alignement des séquences indica
Annexe 17 : Alignement de la séquence RGA trouvée dans
le clone OJ1006_H01 avec I2 de la tomate, d’autres
séquences RGA, le contig 5542 de la séquence shotgun indica
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