le rapport protéines sur créatinine urinaires

le rapport protéines sur créatinine urinaires

Mesure de la concentration urinaire des protéines

Méthode de référence

Les techniques de dosage actuelles répondent à plusieurs critères d’une méthode idéale, mais leurs différences analytiques peuvent conduire à des résultats différents. Contrairement au sérum, il n’existe pas de méthode de référence pour le dosage urinaire des protéines totales27. Deux types de méthodes présentent une sensibilité suffisante pour un dosage quantitatif de routine en laboratoire : − La colorimétrie, dont le principe repose sur la fixation de colorants aux constituants protéiques avec modification de leur spectre d’absorption : réaction du biuret, rouge de pyrogallol, bleu de Coomassie, violet de pyrocathéchol. − La précipitation en milieu acide (trichloracétique ou sulfosalicylique) ou en milieu alcalin (chlorure de benzéthonium) avec détection en turbidimétrie ou néphélémétrie.

Méthodes colorimétriques

Réaction du biuret

Le principe de ce dosage repose sur la mise en évidence des liaisons peptidiques qui forment, avec les ions Cu2+, un complexe bleu-violet en milieu alcalin. Ce dosage est le plus souvent utilisé en laboratoire sur un automate de biochimie. L’avantage majeur de faire intervenir les liaisons peptidiques est d’obtenir une équivalence de réactivité entre les différentes protéines.Le réactif utilisé est le réactif de Gornall11 composé de : − sulfate de cuivre CuSO4 pour fournir les ions Cu2+, − une solution d’hydroxyde de sodium afin de rendre le milieu alcalin, − du tartrate double de sodium et de potassium afin de chélater les ions Cu2+ et éviter la formation d’hydroxyde de cuivre insoluble, − de l’iodure de potassium afin d’éviter les réactions d’oxyréduction impliquant les ions cuivre avant le dosage. Les urines sont mises en présence du réactif de Gornall3, 11, incubées, puis le surnageant est éliminé ; le complexe formé est ensuite mesuré par spectrophotométrie à 590 nm11. Dans le cas de l’espèce canine, du fait de la faible quantité de protéines excrétées, cette méthode n’est pas utilisable dans des conditions identiques comme pour le dosage des protéines sériques45. Elle est dite « modifiée » : les protéines sont préalablement isolées par centrifugation45 ou par précipitation à l’acide trichloroacétique ou perchlorique, puis isolées par passage sur gel de filtration11. Cette méthode présente l’avantage de donner une réaction équivalente entre l’albumine et les globulines, mais elle nécessite de nombreuses manipulations11, 33, 45, et sa sensibilité est médiocre (environ 60 mg/L). De nombreux composés peuvent fausser le résultat : composés possédant des groupes 22
anioniques, métabolites colorés tels que l’hémoglobine, la bilirubine ou la myoglobine, ainsi que l’ammoniac11. Néanmoins pour les protéinuries de surcharge massive (> 5 g/L), cette technique montre une reproductibilité journalière correcte qui permet le suivi d’un patient33.

Technique au rouge de pyrogallol

Dans cette méthode décrite initialement par Fujita et coll, puis modifiée par Watanabe et coll46, le rouge de pyrogallol est combiné au molybdate dissodique en milieu acide (pH=2.5) et forme un complexe coloré rouge qui absorbe à 460 nm. De l’oxalate est ajouté afin d’éviter la réaction du molybdate avec des substances chélatrices.. En présence de protéines et en milieu acide, ce complexe se fixe sur les groupements amines des protéines et déplace le pic d’absorption à 600 nm.La réaction se développe en 8 min et est stable pendant 30 min44. Le colorant se fixe préférentiellement sur les groupements amines des acides aminés basiques, et peu sur ceux des acides aminés acides44. La sensibilité de cette technique est correcte, soit 40 mg/L, et permet donc de mesurer une protéinurie physiologique.Son domaine de mesure est large (de 0,04 à 4 g/L)44. Elle présente l’avantage d’être facile à mettre en œuvre et son automatisation est aisée, ce qui en fait une technique de choix à ce jour27. Cependant, la composition très hétérogène des réactifs27 utilisés selon les laboratoires (différences de pureté, de concentration du colorant, présence d’additifs) peut faire varier les résultats de manière sensible. Les différentes solutions d’étalonnage utilisées peuvent faire varier les résultats même avec l’utilisation d’un réactif donné27. Le rouge de pyrogallol réagit avec les pigments colorés présents dans l’urine27,44, notamment l’hémoglobine, et reconnaît en partie certains solutés de remplissage vasculaire à base de gélatine, mais ceux-ci sont moins utilisés en pratique vétérinaire courante qu’en médecine humaine.

Coloration au Bleu de Coomassie

Le Bleu de Coomassie se lie aux protéines par adsorption aux acides aminés basiques (notamment l’arginine) et/ou aromatiques (comme la phénylalanine ou la tyrosine). Les mécanismes d’interaction entre ce colorant et les protéines sont mal connus, mais celle-ci ne se produit que pour des peptides de plus de neufs résidus.Lorsqu’il est lié aux protéines, le pic d’absorption du bleu de Coomassie se déplace de 465 nm à 595 nm3, 16. La fixation du colorant est complète en 2 min et la coloration est stable environ une heure3, 16. La technique est très sensible (2.5 mg/l), toutes les protéines présentes dans l’urine réagissant avec le bleu de Coomassie16, 43. Du fait de la fixation préférentielle sur certains acides aminés, toutes les protéines ne réagissent pas avec la même intensité16, 43. L’automatisation de cette technique de coloration est rendue difficile du fait de l’adhésion du complexe colorant-protéines sur les tubulures, cuvettes réactionnelles et de mesure, ce qui nécessite un matériel à usage unique3, 33. Le réactif est également corrosif et la technique impose deux étapes avec un prétraitement des urines par un réactif acide phosphoformolé suivi d’une centrifugation3, 33. Cette technique est donc de moins en moins utilisée au profit des autres dosages plus faciles à mettre en oeuvre3, 27.

Coloration au violet de pyrocatéchol

Développée en 1984, cette méthode de dosage des protéines urinaires met en jeu l’utilisation de la chimie sèche, le colorant utilisé étant le violet de pyrocatéchol6, 14. Le principe repose sur le déplacement du pic d’absorption de 450 à 670 nm lors de la fixation des protéines sur un complexe molybdate-pyrocatéchol en présence d’oxalate6, 14. Par rapport au rouge de pyrogallol, le violet de pyrocatéchol est plus sensible à la composition en protéines de l’urine9, 14, 31.

Méthodes turbidimétriques

Le principe de ces méthodes repose sur la formation d’un précipité insoluble, le plus souvent en milieu acide en suspension dans l’urine44. L’agent précipitant est, selon les laboratoires, soit l’acide sulfosalicylique, soit l’acide trichloracétique44. La précipitation en milieu alcalin est également possible, par utilisation du chlorure de benzéthonium, mais reste toutefois marginale44. Une fois le précipité obtenu, la turbidité de la solution est évaluée par mesure de l’absorbance d’un rayon lumineux envoyé à travers l’échantillon44. Cette dispersion est corrélée au taux de précipitation et donc à la concentration initiale des protéines dans les urines44. Les réactions de précipitation avec lecture de l’absorbance en turbidimétrie ont l’avantage d’être peu coûteuses, simples et sensibles. La sensibilité est plus élevée pour l’acide sulfosalicylique et le chlorure de benzéthonium que pour l’acide trichloracétique (10 versus 20 mg/L)44. Cependant, ces agents précipitants sous-estiment les gammaglobulines par rapport à l’albumine, notamment dans le cas de l’acide sulfosalicylique44. Certaines protéines (notamment les protéines tubulaires) sont mal précipitées par les acides, d’où un manque d’exactitude dans leur dosage44. De nombreuses interférences ont été décrites avec des médicaments éliminés principalement dans l’urine : pénicillines, antifongiques, aspirine et produits de contraste44.

Autres méthodes

Bandelette réactive

Ce test repose sur le principe de la colorimétrie : les protéines forment avec le réactif (bleu de bromophénol par exemple27, 36) un complexe coloré, la modification du pH provoquant un changement de couleur27. Selon l’intensité de la réaction, la concentration en protéines est plus ou moins élevée27, 36. Cette intensité de réaction est évaluée visuellement34 par l’opérateur et comparée à une échelle de couleur standardisée, , ou par un lecteur automatisé36. Il existe, chez l’homme, de nombreux faux positifs ou négatifs, notamment en fonction du pH de l’urine testée.
L’évaluation de l’importance de la réaction est fonction de l’opérateur et de sa subjectivité. C’est pourquoi elle n’est jamais utilisée seule et le résultat doit être interprété en fonction de la densité urinaire. Une protéinurie persistante détectée par cette méthode doit être suivie par d’autres techniques d’évaluation quantitative.

Electrophorèse

Il s’agit de la méthode de référence pour la différenciation des protéines dans tous les fluides13, 15, 28. Deux méthodes sont principalement utilisées15 : la migration sur gel d’agarose après traitement au dodécylsulphate sodique (SDS–AGE) et l’électrophorèse haute résolution (HRE). Le principe est la migration des protéines sur un gel, en milieu basique (pH = 8.5), auquel on applique un courant d’intensité constante pendant un temps donné (60 V/h pendant 15 min pour le SDS–AGE et 75 V/h pendant 10 min pour le HRE)15. Le gel est ensuite réhydraté et coloré avec de l’acide violet15. Pour le SDS-AGE ou le HRE, la migration des protéines sur le gel permet de distinguer les différentes protéines présentes dans l’urine et d’en comparer les quantités relatives15. Le résultat est donné sous forme de bandes colorées, comparé à un échantillon de référence de composition connue (obtenu en même temps que l’échantillon analysé) pour le SDS–AGE15. Pour le HRE, les résultats sont donnés sous la forme d’un graphique, chaque pic correspondant à un type de protéines précis ainsi qu’à sa quantité présente.

Guide du mémoire de fin d’études avec la catégorie méthodes colorimétriques et turbidimétrique

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Table des matières

Liste des abréviations
Liste des tableaux et des illustrations
Liste des illustrations
Introduction
Partie bibliographie : le rapport protéines sur créatinine urinaires
I – Définitions
II – Dosages des protéines et de la créatinine dans les urines
III – La protéinurie chez le chien
IV – Utilisation du rapport protéines sur créatinine urinaires
Partie expérimentale : étude de la variabilité inter- et intra– laboratoire de la mesure du rapport protéines sur créatinine urinaires
I – Problématique et objectifs
II – Matériels et méthodes
III – Résultats
Discussion
Conclusions
Bibliographie
Table des matières
Annexes

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