Soutenance mémoire
Le placement des archées au sein du domaine du vivant
La structure cellulaire
Les archées ont des morphologies variées, et certains sont même hautement pléiomorphique. Elles peuvent être de forme carrée comme Haloquadratum walsbyi, ronde comme Sulfolobus solfataricus, en disque plat ou en bâtonnet comme Haloferax volcanii. Certaines sont aussi très motiles et doivent leur mouvement à une structure baptisée « archaellum » qui leur permet de nager en surface ou dans une culture liquide [10]. L’archaellum est plus proche en termes d’évolution et de structure du pilli IV des bactéries qui assure une attache entre la bactérie dont il provient et une autre bactérie ou surface que de leur flagelle, responsable de la motilité chez les bactéries.
Bien que de morphologie bactérienne, leur enveloppe cellulaire diffère de celles des bactéries. En effet, à la différence des bactéries qui possèdent une paroi cellulaire riche en peptidoglycane [11], les archées n’ont qu’une couche S (S-layer) riche en glycoprotéines qui les protège des agressions extérieures [12]. En revanche, pour s’adapter à de fortes températures, qui dénaturent les biomolécules et liquéfient les membranes, les archées ne possèdent pas les mêmes lipides. En effet, les hydrocarbones sont liés entre eux via des liaisons ether qui en condition extrême sont plus stables chimiquement que les liaisons ester présentes chez les eucaryotes et la plupart des bactéries. Les membranes sont plus imperméables grâce à la structure de ces hydrocarbures qui sont formés de chaine de carbone branchées chez les archées au lieu de longue chaine linéaire chez les eucaryotes et les bactéries [13].
Réplication, transcription et traduction
Bien que les processus de réplication, transcription et traduction soient conservés au sein des trois domaines du vivant, ils présentent des divergences entre domaine (mais aussi au sein de chaque domaine). Cette partie décrit le placement des archées au sein du domaine du vivant à travers la comparaison de ces trois processus fondamentaux : la réplication, la transcription et la traduction, et à travers l’étude phylogénétique des protéines qui y sont impliquées.
Structure du génome et réplication chez les archées
Chez les bactéries, le chromosome est circulaire et présente une seule origine de réplication. Alors que chez les archées, sur un chromosome circulaire (comme pour les bactéries) il peut exister plusieurs origines de réplication (comme chez les eucaryotes mais dont le chromosome est linéaire).
La réplication de l’ADN est le processus permettant la synthèse d’ADN et la production d’une molécule d’ADN identique à la molécule initiale. La réplication de l’ADN est un processus universel qui est essentiel pour toute cellule avant la division cellulaire. Elle est scindée en trois étapes : l’initiation, l’élongation et la terminaison. Ainsi les fonctions assurées par les protéines y participant sont similaires chez les trois domaines du vivant et peuvent donc être comparées. De récentes études ont permis de répertorier le rôle des protéines de la réplication (établi par des études fonctionnelles) et de déterminer par étude in silico leur homologie entre les trois domaines du vivant .
Ainsi, il existe cinq protéines archéennes impliquées dans l’initiation de la réplication, c’est-à-dire dans le processus de préparation à la synthèse de l’ADN. Parmi ces cinq protéines, toutes sont homologues aux protéines eucaryotes uniquement, aucune n’est homologue à la fois aux bactéries et aux eucaryotes. Il existe quatorze protéines archéennes impliquées dans l’élongation qui assure la synthèse de l’ADN. Parmi ces quatorze protéines, sept sont homologues à la fois aux protéines bactériennes et eucaryotes, cinq ne sont homologues qu’aux protéines eucaryotes et pour les deux restantes l’une est spécifique aux archées (l’ADN polymérase) et l’autre n’intervient pas dans la réplication (DnaG). Et enfin, il existe trois protéines archéennes impliquées dans l’arrêt de la réplication. Parmi ces protéines, une est homologue à la fois aux protéines bactériennes et eucaryotes, les deux autres sont uniquement homologues aux protéines eucaryotes.
Il est important de noter que toutes les similitudes entre protéines archéennes et protéines eucaryotes sont des homologies de séquence, ce qui n’est pas le cas pour les protéines bactériennes pour lesquelles les outils utilisés n’ont pas permis d’obtenir d’homologies. Ces protéines bactériennes ne possèdent souvent qu’une structure similaire. De plus, lorsqu’une protéine bactérienne de la réplication est homologue à une protéine archéenne, elle l’est aussi avec une protéine eucaryote : c’est le cas de huit protéines sur vingt-deux. En revanche, il existe des protéines archéennes qui ne sont homologues qu’aux protéines eucaryotes, c’est le cas de douze d’entre elles (Figure 4). De plus, les archées ont des caractéristiques qui leur sont propres comme l’existence d’une ADN polymérase D.
Ainsi, il est clair que chez les archées, en dépit d’une structure du génome similaire aux bactéries, les mécanismes de la réplication et plus particulièrement les protéines impliquées lors de la réplication sont davantage de type eucaryote que bactérien. Ceci est en accord avec les études de phylogénie réalisées qui ont pu déterminer que les archées étaient plus proches phylogénétiquement des eucaryotes qu’elles ne le sont des bactéries.
Caractéristiques de la transcription chez les archées
La transcription est le processus permettant la synthèse d’une molécule d’ARN à partir d’une molécule d’ADN. Elle est scindée en trois étapes : (i) l’initiation, permettant la fixation de l’ARN polymérase, (ii) l’élongation, permettant la synthèse de l’ARN à partir d’une séquence d’ADN et (iii) la terminaison, permettant l’arrêt de la synthèse de l’ARN lorsque l’ARN polymérase rencontre une séquence de terminaison. Le processus de transcription au sein des archées semble être un mélange entre celui des bactéries et celui des eucaryotes. En effet, les promoteurs, l’ARN polymérase, les facteurs de transcription globaux, les régulateurs de la transcription et la maturation de l’ARN sont soit de type eucaryote soit de type bactérien. Les promoteurs sont plutôt de type eucaryote, ils ont des séquences TATA box auxquels vient se fixer la TBP (Tata Box binding Protein) et des séquences BRE (B Recognition Element) auxquels se fixent les TFB (transcription factor B). Des études portant sur la comparaison des structures de la machinerie de transcription, rendues possible par la résolution de la structure de l’ARN polymérase archéenne, ont permis d’affirmer que l’ARN polymérase et les facteurs généraux de la transcription archéens sont plutôt de type eucaryote que bactérien [15, 16]. En revanche, les régulateurs de la transcription : (activateurs ou répresseurs) sont davantage de type bactérien qu’eucaryote [17, 18], quant à la maturation des ARN messagers chez les eucaryotes, elle implique un mécanisme d’épissage des introns et d’ajout de séquences protectrices : la coiffe en 5’ et la queue polyA en 3’. Les archées ont, comme les eucaryotes, une possibilité d’épissage, en effet il existe des introns qui restent rares [19] et certains ARN peuvent être épissés comme les précurseurs des ARNt et des ARNr. En revanche, une autre forme d’épissage peut être rencontrée : les intéines qui sont des segments de protéines pouvant être « épissés » après la traduction. La polyadénylation des extrémités 3’ des ARN n’est pas un processus systématique chez les archées : elle est présente chez certaines archées comme l’archée Sulfolobus solfataricus mais est absente chez l’archée halophile Haloferax volcanii [20]. En revanche, chez les archées, les ARNs qui possèdent une queue polyA n’ont pas de coiffe en 5’. Par ailleurs, les archées possèdent, comme les bactéries, des unités de transcription polycistroniques.
Caractéristiques de la traduction chez les archées
La traduction est le processus permettant la synthèse d’une chaine polypeptidique à partir d’une séquence d’ARN. Elle est scindée en trois étapes : (i) l’initiation, c’est la reconnaissance par le ribosome d’une séquence spécifique sur l’ARNm, (ii) l’élongation, la synthèse de la protéine, à partir de la séquence d’ARN, par assemblage d’acides aminés apportés par les ARNt, et (iii) la terminaison, lorsque le ribosome reconnaît le codon stop. La traduction est assurée pendant toutes ces étapes par les protéines ribosomales et les protéines de la traduction, comme les facteurs d’initiation (IF pour les bactéries, eIF pour les eucaryotes et aIF pour les archées), les facteurs d’élongation (EF pour les bactéries, eEF pour les eucaryotes et aEF pour les archées) et enfin les facteurs de terminaison (RF pour les bactéries, eRF pour les eucaryotes et aRF pour les archées). Quelles sont les caractéristiques de la traduction que les archées partagent avec les deux autres domaines ?
Lors de l’étape de l’initiation, chez les bactéries le ribosome se fixe sur une séquence spécifique : la séquence Shine-Dalgarno. Il a été montré que les archées ont des séquences de fixation du ribosome de type Shine-Dalgarno [21]. En ce qui concerne les protéines de la traduction, certains facteurs d’initiation sont communs aux archées et aux eucaryotes, et d’autres facteurs d’élongation sont partagés par les trois domaines [22]. Il semblerait donc que l’appareil de traduction archéen soit un hybride entre les deux appareils de traduction bactérien et eucaryote. Ainsi, cette grande hétérogénéité remet en cause le lien de parenté entre les archées et les eucaryotes. C’est un sujet de débat très actif, certains favorisent l’hypothèse selon laquelle les archées et les eucaryotes ont un ancêtre commun, ce qui fait des archées nos lointaines cousines, tandis que d’autres favorisent l’hypothèse selon laquelle les eucaryotes ont un ancêtre archéen. Si l’on considère la forte hétérogénéité des mécanismes moléculaires qui existe au sein des archées ainsi que leur capacité d’adaptation, il est très probable que les eucaryotes aient un ancêtre archéen.
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Table des matières
1 INTRODUCTION
1.1 Les Archées
La découverte des archées
Les archées dans l’environnement
Le placement des archées au sein du domaine du vivant
1.2 La réplication chez les archées
Les trois étapes conservées : la pré-initiation, l’initiation et élongation
Les origines de réplication et leurs protéines associées
La fourche de réplication
La maturation des fragments d’Okazaki
Haloferax volcanii comme organisme modèle pour l’étude de la réplication chez les
archées
1.3 L’imagerie
Microscopie à contraste de phase et contraste d’interférence pour observer les archées
La microscopie électronique pour étudier les structures des cellules
Etat de l’art sur la microscopie à fluorescence
La microscopie à fluorescence par immunomarquage ou marquage de l’ADN
Microscopie à fluorescence par expression de la GFP dans les cellules
1.4 Problématique de la thèse
2 MATERIEL ET METHODE
2.1 Milieux et souches d’Haloferax volcanii
2.2 Milieux et souches d’Escherichia coli
2.3 Expression physiologique d’une protéine fusionnée à la GFP chez H. volcanii
Construction dans E. coli du plasmide intégratif
Intégration et remplacement au locus chromosomique chez H. volcanii
2.4 Localisation du signal GFP dans les cellules vivantes et analyse quantitative
2.5 Colocalisation du signal GFP avec l’ADN dans les cellules vivantes et analyse
quantitative
2.6 Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)
2.7 Western-blot
3 RESULTATS
3.1 Etude de la protéine PCNA
Clonage du plasmide intégratif
Construction d’une souche Haloferax volcanii permettant l’expression de PCNA
fusionnée à la GFP
3.2 Etude de la protéine FEN1
Clonage du plasmide intégratif
Construction d’une souche Haloferax volcanii permettant l’expression de FEN1
fusionnée à la GFP
Etude de la fonctionnalité de la souche exprimant FEN1 fusionnée à la GFP
Localisation in vivo de FEN1
3.3 Etude de la protéine Orc1
Clonage du plasmide intégratif
Construction des souches d’H. volcanii permettant l’expression de Orc1 fusionnée à
la GFP
Caractéristiques des souches gfp::orc1 et ∆ori gfp::orc1
Localisation in vivo de ORC1
3.4 Etude de la protéine Rpa2
Clonage du plasmide intégratif
Construction des souches d’H. volcanii permettant l’expression de Rpa2 fusionnée à
la GFP
Etude de la fonctionnalité de la protéine fusion GFP::Rpa2
Localisation in vivo de GFP::RPA2 selon la phase de croissance
Localisation in vivo de RPA2 après exposition à différents agents génotoxiques
Quantification de GFP::Rpa2 : western blot anti-GFP
Colocalisation de l’ADN avec les foyers GFP::Rpa2
Dynamique de Rpa2 : Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)
4 CONCLUSION
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