Soutenance mémoire
LE MUSCLE ET SES AFFECTIONS CHEZ LE CHIEN
Modèles animaux de la myopathie de Duchenne
Il existe trois modèles animaux spontanés de la myopathie de Duchenne qui ne sont pas des modèles parfaits : modèles murins (souris mdx), modèle canin (chien GRMD) et modèle félin (chat FXMD). Malgré les différences importantes entre la symptomatologie de ces modèles animaux et la symptomatologie humaine, ils sont extrêmement utiles pour les études physiopathologiques et la mise au point de traitements.Dans notre étude, nous avons utilisé des chiens GRMD. Les chiens atteints par une dystrophie musculaire ont été décrits en 1986 et 1988 dans la race Golden Retriever (109 , 61). Ces chiens GRMD ont une mutation ponctuelle au niveau d’un site d’épissage dans l’intron six du gène qui code pour la dystrophine sur le chromosome X. Cette mutation entraîne un changement dans le cadre de lecture à l’origine de la formation prématurée d’un codon stop dans l’exon huit, ce qui se traduit par la présence d’un ARNm codant pour la dystrophine dont la longueur est estimée à 5% de la longueur normale (100). Ces chiens ne présentent pas d’atteinte clinique au niveau des systèmes nerveux central et périphérique.Dès les premières semaines, on peut observer une élévation des créatines kinases et un retard de croissance. Les premiers signes cliniques majeurs apparaissent vers l’âge de 2 mois. Les chiens sont incapables d’ouvrir complètement la bouche. Ils se déplacent avec une certaine raideur en mobilisant simultanément les deux postérieurs (« bunny hopping »). Les troubles locomoteurs deviennent plus marqués vers 3 mois. Il existe alors une abduction des coudes, une adduction des genoux, une hyperextension des carpes, une hyperflexion des tarses. L’animal est amyotrophié au niveau des muscles du tronc et des temporaux (cf Planche1). L’ouverture buccale devient très réduite. Dans le 4ème mois, on note une aggravation des symptômes qui vont se stabiliser vers l’âge de 6 mois avec une amyotrophie marquée des muscles du tronc, des temporaux et des muscles des membres ; des contractures dues à la fibrose des muscles proximaux qui paraissent très fermes à la palpation, une macroglossie, des troubles de la déglutition pharyngée et oesophagienne avec ptyalisme et régurgitation ; fréquemment des hernies hiatales ou un mégaoesophage compliqué très souvent de bronchopneumonie par fausse déglutition ; une polypnée avec respiration abdominale et dyspnée à l’effort. De 3 à 6 ans, les signes cliniques précédemment décrits restent stables ou s’aggravent progressivement. Une cardiomyopathie dilatée peut alors s’installer.
La présence d’une dystrophine de 390 kDa a été mise en évidence en faible quantité dans les muscles de chiens GRMD (97). La découverte de cette isoforme pourrait expliquer la grande variabilité de sévérité entre des animaux de portées différentes : certains animaux ne survivent pas après la naissance, d’autres présentent de graves altérations de l’état général à l’âge d’un an, tandis que d’autres souffrent de cardiomyopathie dilatée vers l’âge de six ans. Cette grande variabilité clinique porte également sur le degré d’ankylose articulaire liée à la contracture musculaire.
Les signes cliniques et pathologiques des chiens GRMD sont similaires à ceux observés chez les patients atteints de myopathie de Duchenne. Le chien apparaît ainsi comme le modèle animal le plus propice pour des essais thérapeutiques.
La dystrophine
La dystrophine est, comme nous l’avons vu précédemment, la protéine déficiente dans la myopathie de Duchenne.
Présentation du gène
Le gène de la dystrophine a été identifié et cloné en 1986 (82 ). On l’a appelé DMD (Duchenne Muscular Dystrophy) (1). Ce gène est composé de 2400 kb soit 1% du chromosome X, c’est-à-dire 0,05 % du génôme humain. La séquence codante représente seulement 0,5 % de la longueur totale soit 11kb . Elle est répartie en 79 exons séparés par des introns allant jusqu’à 200 kb.
Le gène de la dystrophine est à l’origine de la transcription d’une grande quantité d’ARNm différents qui aboutissent à une variété de formes de dystrophine de longueur différente (71). Plusieurs mécanismes semblent intervenir : l’initiation de la transcription à partir d’une série de promoteurs, de multiples sites d’épissage alternatif et l’existence de différentes longueurs de queues polyA . Ces isoformes de dystrophine s’expriment selon les tissus et selon le stade de développement de l’individu (71). Leurs fonctions sont encore inconnues (26).
Les différentes isoformes de dystrophine (Cf Tableau 1)
Huit promoteurs ont été identifiés à ce jour. Ces promoteurs aboutissent à la synthèse de dystrophine de taille différente. Un premier groupe de promoteurs comprend : – un promoteur cortical (9) actif dans les neurones du cortex et de l’hippocampe ainsi que dans le muscle cardiaque et squelettique – un promoteur de cellules musculaires différenciées (squelettique, cardiaque et lisse) (4, 38) – un promoteur des cellules de Purkinje (39) actif également dans le cortex fœtal, les muscles cardiaque et squelettique – un promoteur des cellules lymphocytaires (86) Ce premier groupe induit la formation de dystrophine de 427 kDa (Dp427).
Il existe un promoteur dans les cellules de la rétine (92), également retrouvé dans le cerveau et le muscle cardiaque. Il permet la synthèse de dystrophine de 260 kDa (Dp260). On trouve un autre promoteur dans de nombreuses cellules du cerveau comme les neurones du cortex, du cervelet, de l’hippocampe, du bulbe olfactif et de la moelle épinière (69). Ce promoteur induit la synthèse d’une isoforme de dystrophine de 140 kDa. Le promoteur des cellules de Schwann (14) qui donne une dystrophine de 116 kDa (Dp116) est aussi actif dans le cerveau des nouveaux-nés (98). Une autre isoforme de dystrophine de 71 Kda (Dp71) est, elle, ubiquitaire. Son promoteur est retrouvé actif dans le foie, le poumon, le rein et les testicules (65) mais aussi dans les fibres musculaires squelettiques fœtales et les myoblastes en prolifération. Ainsi, cinq isoformes différentes de dystrophine sont retrouvées exprimées dans différents tissus.
Présentation de la protéine (Cf Figure 2)
La protéine traduite majoritairement dans les fibres musculaires, la Dp427, contient 3685 acides aminés et a une longueur de 175 nm. Elle est constituée de quatre domaines fonctionnels.:
– le domaine N terminal d’environ 250 acides aminés possède une analogie de séquence et de fonction avec des protéines du cytosquelette : la β-spectrine et l’α-actinine (44). Ce domaine permet de lier la dystrophine avec l’actine, elle-même reliée au cytosquelette sous-jacent.
– le domaine central d’environ 2710 acides aminés est constitué de la répétition en vingt-quatre (1) ou vingt-cinq ou vingt-six exemplaires de 109 acides aminés. Chaque répétition forme une hélice élémentaire α qui comprend deux tours riches en proline ce qui permet à la moitié C terminale d’une répétition de se lier à la moitié N terminale de la suivante, créant ainsi un repliement en triple hélice (59). – on trouve ensuite une région d’environ 300 acides aminés, riche en cystéine, homologue d’un domaine de l’α-actinine et de la β-spectrine, qui contient un motif à deux tryptophanes (WW) (95) très conservés notamment dans l’utrophine.
– enfin, la région C terminale composée d’environ 325 acides aminés qui a pour seul homologue la séquence C terminale du gène qui code pour l’utrophine. Dans cette région, la séquence codée par les exons 73 à 75 permet la formation d’une structure en deux hélices α séparées par une séquence linéaire (7). La première hélice située entre les acides aminés 3447 et 3481 lie la syntrophine-α qui elle-même lie les autres syntrophines .
Localisation de la dystrophine
Dans les fibres musculaires squelettiques du fœtus humain, l’apparition de la dystrophine sous le sarcolemme est progressive (93). Elle a tout d’abord été détectée dans le cytoplasme des régions proches des jonctions myotendineuses entre la huitième et la onzième semaine de gestation (24). A un stade fœtal plus avancé, elle est localisée à travers tout le cytoplasme (114). Un marquage éparse est visible par immunohistochimie sous la membrane de certaines fibres à la dixième semaine (93). Puis la dystrophine apparaît nettement localisée à la membrane entre la dix-huitième semaine (20) et la vingt-deuxième se ento1parse est charnière importante puisqu’elle relie le cytosquelette sous-jacent à la matrice extracellulaire par l’intermédiaire du complexe de DAPs et de DAGs et de la laminine.La myopathie de Duchenne est une maladie toujours létale. Aucun traitement n’est actuellement disponible. Plusieurs voies de recherche sont explorées pour trouver un traitement efficace contre la myopathie de Duchenne. Ce traitement devra réduire ou inhiber la nécrose des fibres musculaires et empêcher ainsi, la dégénérescence du tissu musculaire. Des thérapies cellulaires ou géniques sont ainsi envisagées. Des méthodes plus conventionnelles basées sur des molécules chimiques de remplacement font l’objet de recherche. La surexpression de l’utrophine pour compenser l’absence de dystrophine en est un bon exemple.
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Table des matières
QUELQUES RAPPELS SUR LE MUSCLE ET SES AFFECTIONS
INTRODUCTION
I- ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
1. Dystrophine et myopathie de Duchenne
1.1. Origine de cette maladie
1.2. Modèles animaux de la myopathie de Duchenne
1.3. La dystrophine
1.3.1. Présentation du gène
1.3.2. Les différentes isoformes de dystrophine
1.3.3. Présentation de la protéine
1.3.4. Localisation de la dystrophine
2. L’utrophine
2.1. Présentation du gène
2.2. Localisation de l’utrophine
2.3. Fonction de l’utrophine
2.4. Intérêt de l’utrophine pour compenser l’absence de dystrophine
3. Approche pharmacologique des myopathies dystrophiques
8 la L-arginine, un donneur de NO
3.1. La L-arginine
3.2. Quelques considérations sur le métabolisme cellulaire
3.3. La L-Arginine substrat de la monoxyde d’azote synthétase
3.4. Les monoxyde d’azote synthétases
3.4.1. Les différentes isoformes
3.4.2. Monoxyde d’azote synthétase musculaire et myopathie de Duchenne
3.4.3. Résultats expérimentaux obtenus sur la souris mdx
in vitro et in vivo
3.5. La L-Arginine et le monoxyde d’azote pour surexprimer l’utrophine
II- MATERIELS ET METHODE
1. Chiens et traitement
2. Analyse clinique
2.1. Examen clinique
2.2. Mesure des pressions artérielles
3. Analyse biologique
3.1. Diagnostic génétique
3.2. Analyse biochimique
3.3. Radiographies
4. Biopsie musculaire
4.1. Immunocytochimie de l’utrophine
4.2. Immunocytochimie des sarcoglycanes
III- RESULTATS ET DISCUSSION
1. Examens cliniques
2. Mesures de pression artérielle
3. Dosages biochimiques
3.1. Urée/ créatinine
3.2. Créatine Kinase
3.3. CO2
3.4. Na+
3.5. K+
3.6. PAL
3.7. SGPT
4. Histologie musculaire
5. Immunocytochimie
5.1. Utrophine
5.2. Sarcoglycanes
6. Devenir de ces chiens
7. Bilan et critiques
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE
Annexe 1 : Figures
Figure 1 : Schéma de la dystrophine
Figure 2 : Les domaines de la dysrophine et de l’utrophine
Figure 3 : Métabolisme de la L-arginine
Figure 4 : Traitement à la L-arginine
Figure 5 : Evolution de l’état clinique des chiens malades qu’ils soient traités ou non Figure 6 : Pressions Artérielles Moyennes dans les trois groupes de chiens
Figure 7 : Pressions systoliques dans les trois groupes de chiens
Figure 8 : Pressions diastoliques dans les trois groupes de chiens
Figure 9 : Evolution du taux d’urée au cours du traitement
Figure 10 : Evolution du taux de créatinine au cours du traitement
Figure 11 : Evolution du taux de créatine kinase au cours du traitement
Figure 12 : Evolution du taux de CO2 au cours du traitement
Figure 13 : Evolution du taux de Na+ au cours du traitement
Figure 14 : Evolution du taux de K+ au cours du traitement
Figure 15 : Evolution du taux de PAL au cours du traitement
Figure 16 : Evolution du taux de SGPT au cours du traitement
Figure 17 : Index histopathologique à l’âge de 5 mois
Figure 18 : Index histopathologique à l’âge de 8 mois
Figure 19 : Evolution de l’index histopathologique
Annexe 2 : Tableaux
Tableau 1 : Isoformes de la dystrophine
Tableau 2 : Protocole et traitement
Tableau 3 : Paramètres cliniques à évaluer chez les chiens malades
Modèle de tableau.
Tableau 4 : Stade de myopathie des différents chiens en fonction de leur âge
Tableau 5 : Mesures des différentes pressions artérielles chez les chiens sains
Tableau 6 : Mesures des différentes pressions artérielles chez les chiens malades traités
Tableau 7 : Mesures des différentes pressions artérielles chez les chiens malades non traités
Tableau 8 : Analyse de variance pour le facteur pression artérielle moyenne entre les chiens GRMD traités ou non Tableau 9 : Analyse de variance pour le facteur pression systolique entre les chiens GRMD traités ou non
Tableau 10 : Analyse de variance pour le facteur pression diastolique entre les chiens GRMD traités ou non
Tableau 11 : Dosages d’urée dans les trois groupes de chiens
Tableau 12 : Dosages de créatinine dans les trois groupes de chiens
Tableau 13 : Dosages de créatine kinase dans les trois groupes de chiens
Tableau 14 : Dosages de CO2 dans les trois groupes de chiens
Tableau 15 : Dosages de Na+ dans les trois groupes de chiens
Tableau 16 : Dosages de K+ dans les trois groupes de chiens
Tableau 17 : Dosages de PAL dans les trois groupes de chiens
Tableau 18 : Dosages de SGPT dans les trois groupes de chiens
Tableau 19 : Index pathologiques
Tableau 20 : Immunocytochimie des β-sarcoglycanes chez les chiens sains et dystrophiques
Tableau 21 : Immunocytochimie des γ-sarcoglycanes chez les chiens sains et dystrophiques
Annexe 3 : Planches
Planche 1 : Aspect de deux chiens atteints de myopathie dystrophique
Planche 2 : Aspect histologique et immunocytochimique du biceps fémoral
avant traitement chez des chiens sains et des chiens GRMD
Planche 3 : Aspect histologique et immunocytochimique du biceps fémoral après 4 mois de traitement à la L-arginine ou avec un placebo chez des chiens GRMD
Planche 4 : Aspect immunocytochimique du biceps fémoral p105 avant et après traitement chez des chiens sains
Planche 5 : Immunomarquage des β-sarcoglycanes chez des chiens sains avant et après traitement à la L-arginine. Immunomarquage des γ-sarcoglycanes chez des chiens sains avant et après traitement à la L-arginine.
Planche 6 : Immunomarquage des β-sarcoglycanes chez un chien malade avant et après traitement à la L-arginine. Immunomarquage des β-sarcoglycanes chez deux chiens malades après traitement à la L-arginine ou au sérum physiologique.
Planche 7 : Immunomarquage des γ-sarcoglycanes chez un chien malade avant et après traitement à la L-arginine. Immunomarquage des γ-sarcoglycanes chez deux chiens malades après traitement à la L-arginine ou au sérum physiologique.
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