AYY-AZIL-79
Le lait de chamelle
Généralités sur les bactéries lactiques
Définition et caractéristiques
Il s’agit de bactéries à Gram positif asporulées et immobiles, ne possédant ni catalase ni plusieurs exigences nutritionnelles vis à vis des acides aminés, peptides, vitamines, sels, acides gras et glucides fermentescibles (Gaspar et al., 2013). Les bactéries lactiques dont le nom est en lui-même évocateur de la caractéristique emblématique du métabolisme de ce groupe bactérien, à savoir la production d’acide lactique, étaient souvent traditionnellement associées aux fermentations alimentaires. Leur capacité roduit final si elles sont homofermentaires (voie d’Embden Meyerhof Parnas) ou à la bactéries entreprennent la voie dite hétérofermentaire ou hétérolactique connue aussi comme et al., 2014).
oxydase, généralement anaérobies facultatives, dépourvues de nitrate réductase et montrant la voie du 6- phosphogluconate ou encore la voie des hexose monophosphates (Figure1) (Liu synthèse de CO , d’acide acétique et d’éthanol en plus de l’acide lactique 2 dans le cas où ces d’utiliser plusieurs sources carbonées conduit soit à la formation d’acide lactique comme seul .
(A) homofermentation via la glycolyse (B) hétérofermentation par la voie du 6-phosphogluconate (Axelsson, 1993). Les bactéries lactiques sont généralement représentées par les genres Lactococcus, critères de la taxonomie moderne considèrent les microorganismes appartenant aux genres Aerococcus, Vagococcus, Tetragenococcus et Carnobacterium comme appartenant aux.
Taxonomie des bactéries lactiques
La taxonomie des bactéries lactiques est en mouvement continuel avec le développement des techniques de la biologie moléculaire. Les groupes Thermobacterium, Streptobacterium et Betabacterium d’Orla-Jensen (1919) ont été remplacés par ceux classant les lactobacilles selon leur type fermentaire (Durlu-Ozkaya et al., 2001). Des espèces, des sous espèces ou voire même des genres ont été revus aussi. De cette façon Lb bavaricum est devenu Lb sakei, Lb casei ssp rhamnosus est devenu Lb rhamnosus et Lb bulgaricus est devenu Lb delbrueckii ssp bulgaricus, Lb kandleri est devenu Weissella kandleri, Leuconostoc paramesenteroides est devenu Weissella paramesenteroides et Lb divergens est devenu Carnibacterium divergens (Coeuret et al., 2003) (parfois écrit Carnobacterium).
Actinobacteria appartient aussi aux bactéries lactiques (Liu et al., 2014). bactéries lactiques (Axelsson, 1993). Toutefois le genre Bifidobacterium dans le phylum Leuconostoc, Lactobacillus, Pediococcus, Enterococcus et Streptococcus. Cependant les Selon les données de la classification courante, les bactéries lactiques appartiennent au phylum des Firmicutes, à la classe des Bacilli et à l’ordre des Lactobacillales. Cet ordre est composé de six familles qui sont Aerococcaceae, Carnobacteriaceae, Enterococcaceae, Leuconostocaceae, Lactobacillaceae, et Streptococcaceae (Figure 2) (Ludwig et al.,2009; Gaspar et al., 2013).
La phylogénie basée sur la comparaison des séquences de l’ADN ribosomique et sur l’analyse de séquences signatures dans les protéines très conservées suggère que le monde bactérien comprend onze principaux phylums; celui des bactéries à Gram-positif comprend deux subdivisions principales : la subdivision « Clostridia » et apparentés qui regroupe les bactéries possédant un ADN avec bas taux de guanine et cytosine (GC≤50%) et la subdivision «Actinobacteria» et apparentés qui regroupe les bactéries à Gram positif et à GC supérieur à 50% (Figure 3) (Schleifer et Ludwig, 1995 ; Holzapfel et al., 2001). D’un point de vue taxonomique, les bactéries lactiques représentent un groupe de microorganismes très hétérogène composé des genres avec G+C inférieur à 50% comme Carnobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Enterococcus, Oenococcus, Weissella, Aerococcus, Streptococcus et Tetragenococcus. Dans cette classification le genre Bifidobacterium est lié à la branche des Actinobacteria alors qu’il est physiologiquement proche des bactéries lactiques. Cette classification montre aussi que les genres Lactobacillus, Leuconostoc et Pediococcus, très distincts morphologiquement, sont très entremêlés
phylogénétiquement (Figure 4) (Schleifer et Ludwig, 1995 ; Holzapfel et al., 2001).Figure 2: Dendrogramme reflétant des relations phylogénétiques de l’ordre “Lactobacillales” (Ludwig et al., 2009)
non associés (bactéries avec taux élevé de G+C dans l’ADN).
La barre indique une divergence des séquences estimées à 10% (Holzapfel et al., 2001).1-2-3) Quelques caractéristiques des genres Lactobacillus et Leuconostoc
Les bactéries lactiques peuvent avoir des formes en bâtonnets ou en coques (Figure 5 a, b et
c). Parmi les 12 genres formant ce groupe bactérien, les lactobacilles et les leuconostocs sont
les deux principaux genres de bactéries lactiques identifiés parmi les isolats issus des
échantillons de lait de chamelle traités dans cette étude.
a b c
Figure 5 : Formes bâtonnet (a) et coque (b, c) des bactéries lactiques.
Observations au microscope électronique à transmission 10000X (Ehrmann et al.,2009)
1-2-3-1) Le genre Lactobacillus
Avec environ 154 espèces et 30 sous espèces, le genre Lactobacillus est le groupe le plus
large des bactéries lactiques (Siezen et van Hylckama Vlieg, 2011 ; Kšicová et al., 2013).
Le terme Lactobacillus fait souvent référence aux petits bacilles isolés du lait. Cependant
certaines espèces prennent la forme coccobacille ou la forme bacilles fins et longs et même
parfois la forme incurvée rappelant celle des corynébactéries (Figure 5a). Les lactobacilles
sont généralement immobiles, à Gram positif et catalase négative mais quelques espèces
peuvent posséder une pseudo-catalase. Sous microscope, les cellules apparaissent isolées mais
parfois elles sont associées en chainettes. Les lactobacilles sont des microorganismes
asporulés mais la présence de granulations ou des inclusions bipolaires dans certaines cellules
colorées par la méthode de Gram ou au bleu de méthylène peut conduire à la confusion
(Coeuret et al., 2003 ; Dicks et Endo, 2009).
Les différentes espèces composant le genre Lactobacillus ont été initialement regroupées selon leur température optimale de croissance et leur profil de fermentation des hexoses en trois sous-genres qui sont le sous genre Thermobacterium, le sous genre Streptobacterium et le sous genre Betabacterium. La classification ancienne d’Orla et Jensen (1919) a été remplacée par celle de Kandler et Weiss (1984) qui ont divisé les lactobacilles selon leur type fermentaire en espèces homofermentaires obligatoires, hétérofermentaires facultatives et hétérofermentaires obligatoires . D’ailleurs cette classification est de nos jours utilisée dans l’étude phénotypique des nouveaux isolats. Par la suite en se basant sur les données de l’ARNr16S, les lactobacilles ont été divisés en trois autres groupes. Le premier connu comme le groupe delbrueckii inclue des espèces homofermentaires et certaines espèces hétérofermentaires facultatives. Le deuxième groupe est celui de casei-Pediococcus qui est composé des espèces homofermentaires strictes, des espèces hétérofermentaires facultatives et hétérofermentaires strictes. Le dernier groupe est connu comme celui de Leuconostoc car il comprend les genres Leuconostoc, Weissella, et Oenococcus à coté de certaines espèces hétérofermentaires strictes du genre Lactobacillus (Tableau 3) (Stiles et Holzapfel, 1997).
Actuellement, la récente classification de ce genre bactérien a subdivisé le groupe caseiPediococcus en 5 sous groupes (le sous groupe Lb. casei, le sous groupe Lb plantarum, le sous groupe Lb reuteri, le sous groupe Lb buchneri et le sous groupe Lb salivarius). Cette même classification a donné au groupe delbrueckii l’appellation acidophilus qui est un groupe composé exclusivement des lactobacilles homofermentaires strictes comme Lb acidophilus, Lb amylovorus, Lb crispatus, Lb johnsonii, Lb helveticus, et Lb gasseri et l’espèce Lb delbrueckii avec ses quatre sous espèces delbrueckii, lactis, bulgaricus et indicus, (Giraffa et al., 2010).
Les lactobacilles colonisent différentes niches écologiques et sont surtout isolés des substrats riches en carbohydrates comme les produits laitiers, les produits carnés et les végétaux fermentés (Kröckel ,2013 ; Vasiee et al., 2014 ; Li et al., 2015). Ils sont aussi retrouvés dans différentes parties du corps humain notamment dans les tubes gastro-intestinal et urogénital (Siezen et Van Hylckama Vlieg, 2011). Certaines espèces sont devenues des habitants spécifiques de quelques niches écologiques comme Lb bulgaricus souvent trouvé dans les produits laitiers et Lb acidophilus, Lb johnsonii, Lactobacillus reuteri et Lactobacillus rhamnosus colonisant principalement le tube digestif humain (Holzapfel et al., 2001).
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Table des matières
Liste des abréviations
Liste des figures
Liste des tableaux
Introduction Générale
Analyse Bibliographique
Lait de chamelle
Généralités sur le lait de chamelle
Caractéristiques physicochimiques du lait de chamelle
Transformation du lait de chamelle
Caractères nutritionnels et thérapeutiques du lait de chamelle
Microbiologie du lait de chamelle
Généralités sur les bactéries lactiques
Définition et caractéristiques
Taxonomie des bactéries lactiques
Quelques caractéristiques des genres Lactobacillus et Leuconostoc
Le genre Lactobacillus
Le genre Leuconostoc
Utilisation des bactéries lactiques
❖ Protéolyse chez les bactéries lactiques
❖ Rôle probiotique des bactéries lactiques
❖ Métabolisme des sucres et le pouvoir acidifiant des bactéries
lactiques :
❖ Pouvoir épaississant des bactéries lactiques
❖ Propriétés aromatiques des bactéries lactiques
❖ Bioconservation par les bactéries lactiques
Culture des bactéries lactiques
Méthodes d’identification des bactéries lactiques
Les fermentations
Historique et définitions
Les types de fermentation
Composition des ferments lactiques
Les laits fermentés
Effets thérapeutiques des laits fermentés
Composés volatiles
Introduction et définitions
Analyse des volatiles
Analyse des volatiles par l’espace tête
❖ Echantillonnagedes volatiles déjà présents dans l’espace tête
(static headspace)
❖ Extraction en purgeant et faisant sortir les volatiles d’un
échantillon avec un gaz
❖ Microextraction sur phase solide (SPME)
• L’extraction directe
• L’extraction par espace de tête
❖ Autres techniques
• Séparation des composés par chromatographie en phase
541-4-3 gazeuseCPG:
Association de l’analyse des composés volatiles à l’analyse sensorielle
Matériel et Méthodes
Cadre de l’étude
Collecte et transport des échantillons de lait
Isolement des bactéries lactiques
Préparation des dilutions
Préparation des cultures
Purification des souches
Conservation des isolats
Conservation de courte durée
Conservation de longue durée
Pré-identification biochimique des isolats
Recherche de l’Arginine Di Hydrolase (ADH)
Type fermentaire des isolats
Profil fermentaire des sucres
Identification moléculaire des souches
Empreinte protéique des cellules
Extraction des protéines
Quantification des protéines dans les échantillons
• Préparation de la courbe étalon
• Coloration
• Dosage de la quantité de protéine dans les échantillons
Séparation des protéines par SDS PAGE
Caractérisation génotypique des isolats
Extraction de l’ARNr 16S
Amplification
Purification des produits de la PCR
Séquençage des Amplicons
Purification des produits de séquençage
Analyse des séquences et identification des isolats
Caractérisation physiologique des isolats
Croissance à différentes températures
Croissance en présence de 6.5% de NaCl
Croissance à pH 4.8
Caractérisation technologique des isolats
Activité aromatique des isolats
• L’utilisation de citrate et production de diacétyle/acétoine
• Evaluation de la production de Diacétyle et acétoïne combinés
Activité protéolytique
Aptitude protéolytique exocellualire des isolats
• Activité Aminopeptidase (AP) des cellules
• Différenciation entre les souches lentement coagulantes et
rapidement coagulantes
• Protéolyse dans le lait
– Dosage des fonctions -NH2 par la méthode à l’Orthophthaldehyde
(OPA)
– Préparation des hydrolysats de protéine
– Préparation du réactif OPA
– Préparation de la courbe étalon lysine
Activité acidifiantes
Activité lipolytique
Pouvoir épaississant des isolats
Recherche des Exopolysaccharides( EPS)
Cinétique de la production pendant la croissance sur milieu liquide
Dosage des EPS
❖ dans le ESM (EPS selection medium)
❖ Dans le milieu MRS hypersaccharosé
❖ Préparation de la courbe étalon glucose
– Préparation des dilutions
– Coloration
Extraction des polymères et analyse de leur composition
Antibiogramme en milieu solide
Etude des interactions inter bactériennes
Sélection des isolats pour la préparation des ferments mixtes
Préparation des échantillons de lait fermenté
Test sensoriel des laits fermentés
Analyse des produits volatils
• Extraction des composés volatils
• Séparation des volatiles
• Identification des volatiles
Analyses statistiques des résultats
Résultats et discussion
Identification phénotypique des isolats
Dénombrement
Examen macroscopique des isolats
Examen microscopique des isolats
Pré- Identification des isolats
Identification numérique des isolats
Caractérisation technologique des isolats
Caractères aromatisants des isolats
Pouvoir protéolytique des isolats
Activité acidifiante des isolats
Pouvoir épaississant des isolats
Activité lipolytique des isolats
Relation entre les différents paramètres
Résistance aux antibiotiques
Interactions interbactériennes
Identification moléculaire des isolats
L’analyse électrophorétique des protéines cellulaires totales
Caractérisation génotypique des isolats
Préparation et analyse du lait fermenté
Sélection des souches
Préparation et analyse sensorielle des laits fermentés
Analyse des volatiles
Conclusion
Références bibliographiques
Annexes
Résumés
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