Le démarrage de la traduction eucaryotique

Les étapes du mécanisme

Le ribosome bactérien (70S) est composé d’une grande sous-unité (50S) et d’une petite sous-unité (30S), elles-mêmes formées d’un assemblage de protéines et d’ARNs. La sous-unité 30S contient ainsi 21 protéines et un ARNr sédimentant à 16S. La sous-unité 50S est quant à elle composée de 34 protéines et de 2 ARNrs sédimentant respectivement à 5S et 23S. La structure tertiaire de l’ARN ribosomal est stabilisée par différents types d’interactions, notamment des interactions ARN-ARN, des interactions ARN-protéines et des pontages par des ions Mg2+ qui stabilisent les polynucléotides ribonucléiques phosphatés (Ban et al., 2000 ; Nissen et al., 2001). Le ribosome possède trois sites de liaison pour les molécules d’ARNt : le site A (aminoacyl) où se fixent les ARNts élongateurs, le site P (peptidyl) qui fixe l’ARNt portant la chaîne polypeptidique naissante et accueille l’ARNt initiateur, et le site E (exit) où se retrouvent les ARNts déacylés avant leur éjection du ribosome. La Figure 1.1 présente une vue générale des deux sous-unités ribosomales bactériennes. Le lancement d’un nouveau cycle de traduction nécessite la dissociation préalable du complexe 70S en sous-unités séparées. Cette dissociation est déclenchée par le facteur de recyclage RRF (Ribosome Recycling Factor) et la translocase EF-G (Elongation Factor G). Cette étape requiert l’hydrolyse d’une molécule de GTP portée par EF-G. Cette dissociation produit une sous-unité 50S libre et une sous-unité 30S complexée à l’ARNm et au dernier ARNt déacylé bloqué au site ribosomal P. L’éjection de ce dernier ARNt de la sous-unité 30S nécessiterait l’intervention du facteur de démarrage IF3 ( Karimi et al., 1999; Agrawal et al., 2004) (Etape 1 de la Figure 1.2). Une fois le complexe de post-terminaison dissocié, la réassociation 30S – 50S est empêchée grâce au rôle anti-associateur du facteur IF3 qui se fixe sur la petite sous-unité ribosomale. Le facteur IF1 vient stimuler l’activité anti-associatrice d’IF3 en se fixant également sur la 30S. L’action conjuguée de ces deux facteurs de démarrage pourrait également permettre de faciliter la dissociation de complexes 70S reformés prématurément. Après dissociation du ribosome, IF2, l’ARNm et l’ARNt initiateur se fixent successivement à la sous-unité 30S dans un ordre qui reste à déterminer. L’ARNm est prépositionné sur le ribosome grâce à l’interaction d’une séquence dite de Shine-Dalgarno (SD), placée en amont de la séquence à traduire sur l’ARNm, avec une séquence nucléotidique qui lui est complémentaire sur l’ARNr 16S (ASD) (Shine and Dalgarno, 1974). Le positionnement précis de l’ARNm de manière à ce que le codon AUG initiateur se trouve au niveau du site ribosomal P requiert la présence des trois IFs. L’ordre exact dans lequel les différents partenaires du complexe de prédémarrage se fixent sur le ribosome n’étant pas certain, deux hypothèses sont à envisager. Soit les trois facteurs de démarrage sont déjà présents lors du recrutement de l’ARNm et par conséquent, le polynucléotide est directement placé dans une position optimale pour l’interaction codon-anticodon. Soit l’ARNm est prépositionné grâce à l’interaction SD-ASD au niveau du ribosome et le recrutement des IFs permet ensuite d’ajuster son positionnement de manière à ce que le codon initiateur se retrouve près du site P du ribosome (La Teana et al., 1995). L’ARNt initiateur est également positionné au niveau du site P de la 30S selon un mode de liaison qui est tout d’abord indépendant de son interaction avec le codon de l’ARNm (Tomsic et al., 2000). Le facteur IF1, qui se fixe au niveau du site A de la 30S, empêche ainsi le recrutement de l’ARNt initiateur au niveau du site A et il participe conséquemment à sa fixation au site P (Dahlquist and Puglisi, 2000 ; Carter et al., 2001). IF3 stabilise également la liaison de l’ARNt initiateur au site P (Gualerzi et al., 1977). Chez les Bactéries, l’ARNt initiateur porte une méthionine formylée (fMet-ARNtf Met) et il est spécifiquement reconnu par le facteur IF2 avec lequel il interagit sur le ribosome (Etape 2 de la Figure 1.2).

Liaison de l’ARNm

Pour former le bon complexe de démarrage, le codon initiateur doit être rigoureusement sélectionné sur l’ARNm et en particulier, il doit être distingué des autres codons AUG codant pour des méthionines internes de la protéine à traduire. De plus, chez les Bactéries, les ARNms sont polycistroniques, ce qui complique encore le travail de sélection. Chaque séquence à traduire possède en général ses propres signaux de démarrage. Le positionnement correct de l’ARNm sur le ribosome, de manière à sélectionner le bon codon de démarrage au niveau du site ribosomal P, est contrôlé par différentes interactions entre l’ARNm et le ribosome. La plus importante d’entre elles concerne une séquence de l’ARNm placée en amont de la séquence à traduire, sur la région 5’ non traduite (5’UTR), et qui est appelée séquence de Shine-Dalgarno (SD). La séquence consensus des ARNms d’E. coli est une séquence GGAGG située 7 ± 2 nucléotides en amont de l’AUG initiateur. Chez E. coli, le démarrage de la traduction peut également survenir sur un codon GUG ou UUG (respectivement 8% et 1% des cas) (Schneider et al., 1986). Cependant, pour chacun de ces trois codons initiateurs possibles, c’est toujours une méthionine qui est incorporée par l’intermédiaire de l’ARNt initiateur N-formyl-méthionylé. Cette séquence SD va s’apparier avec une séquence complémentaire présente à l’extrémité 3’ de l’ARNr 16S de la petite sousunité 30S, appelée séquence anti-Shine Dalgarno (ASD) (Shine and Dalgarno, 1974). Une autre interaction survient entre la protéine ribosomale S1 et une région de l’ARNm riche en pyrimidines qui se trouve en amont de la séquence SD. Cette région se comporte comme un site de reconnaissance du ribosome (Boni et al., 1991) et une interaction directe a été mise en évidence par cryo-EM (Sengupta et al., 2001). Enfin, une région en aval du codon de démarrage appelée DB (Downstream Box) est rencontrée sur certains ARNms et elle présente une forte complémentarité avec les bases 1469 à 1483 de l’hélice 44 de l’ARNr 16S. Cette interaction DB-ADB serait donc de même nature que l’interaction SD-ASD (Sprengart et al., 1990). Cependant aucune preuve génétique ou biochimique n’a pu mettre en évidence la nécessité de cette interaction pour le recrutement de l’ARNm par le ribosome. De plus, la structure de la sous-unité 30S de T. thermophilus suggère que l’épaule de la 30S s’insère entre les deux zones potentielles d’interaction (Wimberly et al., 2000). L’ARNm est d’abord prépositionné sur le ribosome au niveau d’un site d’attente (« standby site ») puis il est ajusté au niveau du site P par les différents facteurs de démarrage, en particulier IF3 (La Teana et al., 1995).

Site de fixation sur le ribosome

Dans le modèle actuel, l’ARNt initiateur reconnu par IF2 est acheminé au niveau du site P du ribosome, contrairement aux ARNts élongateurs qui arrivent d’abord au site A et subissent ensuite une translocation vers le site P après formation d’une nouvelle liaison peptidique. La tige anticodon de l’ARNt interagit avec l’ARNr 16S, tandis que la tige acceptrice et le bras T s’associeront avec l’ARNr 23S de la grande sous unité ribosomale, la boucle du bras T interagissant alors avec la protéine ribosomale L23 (Yusupov et al., 2001). Deux paramètres sont à considérer pour expliquer pourquoi l’ARNt initiateur est dirigé vers le site P. Le premier concerne le facteur IF1. Comme l’ont révélé de nombreuses études de marquage et comme l’a confirmé la structure du complexe IF1-30S, IF1 se fixe au niveau du site A du ribosome, bloquant ainsi l’accès de ce site à l’ARNt (Carter et al., 2001) (Figure 1.11). Le second concerne le facteur IF3. Comme le souligne la Figure 1.4, sur la sous-unité 30S, IF3 occupe une position qui recouvre le site E du ribosome. IF3 pourrait donc jouer un rôle similaire à celui d’IF1 au site A, en bloquant l’accès du site E à l’ARNt.D’autre part, la présence d’IF1 sur la sous-unité 30S renforce la liaison du facteur IF2 sur le ribosome (Weiel and Hershey, 1982) et les deux facteurs ont ainsi une influence mutuelle sur leur liaison respective à la 30S. IF1 se lierait au niveau d’une région comprise entre les domaines III et VI d’IF2 (Moreno et al., 1999). Cette hypothèse est cohérente avec la position d’IF2 sur le ribosome 70S (Figure 1.10) obtenue par cryo-EM. IF1 serait alors à proximité des domaines V et VI-2 d’IF2 ainsi que de la tige anticodon de l’ARNt. L’obtention de nouvelles données de microscopie ou de cristallographie, mettant en œuvre un complexe IF2:fMet-ARNtf Met:GTP:IF1:IF3:30S, permettra sans doute dans un avenir proche de déterminer définitivement la position de chaque partenaire sur la petite sousunité ribosomale.

Les protéines G : un mécanisme universel

Au sein des cellules, les protéines G oscillent entre un état conformationnel actif (état ON) et un état conformationnel inactif (état OFF), ce qui leur permet de contrôler une grande variété de processus allant de la croissance et de la différentiation cellulaire au transport nucléo-cytoplasmique et vésiculaire. L’activation des protéines G (passage au mode ON) nécessite la dissociation préalable du nucléotide GDP qui leur est complexé. Ce processus relativement lent doit être accéléré par un facteur noté GEF (pour Guanine Exchange Factor) qui permet l’échange GDP → GTP sur la protéine G. Il s’agit d’une étape généralement réversible. A l’inverse, le passage au mode OFF est un processus intrinsèquement irréversible qui correspond à l’hydrolyse du GTP en GDP – soit la réaction GTPasique à proprement parler – et ce processus également relativement lent doit être accéléré par une GAP (GTPase Activating Protein). Les cellules eucaryotiques contiennent entre 100 et 150 protéines G différentes. Celles-ci sont regroupées en plusieurs superfamilles : les protéines dérivées de la protéine Ras, les protéines G hétérotrimériques, les facteurs impliqués dans la synthèse protéique et diverses autres sous-familles. Malgré des différences notables au sein de ces familles, le domaine G de ces protéines présente une structure (Figure 2.1) et un mécanisme de changement conformationnel universels. Ainsi, un domaine minimal d’environ 20 kDa, commun à toutes les protéines G, assure les fonctions de liaison et d’hydrolyse des nucléotides guanine. Cette structure minimale comprend 6 brins βet 5 hélices α. Le domaineG présente cinq séquences consensus impliquées dans sa fonction, à savoir les motifs G1 : GX4GK(S/T) ou boucle P, G2 : boucle effectrice ou Switch I, G3 : DXXG ou Switch II, G4 : (N/T)KXD et G5 : (T/G)(C/S)A où X représente un résidu quelconque (Sprang, 1997) (Bourne et al., 1991). Autour de ce cœur fonctionnel et universel, les divers domaines G présentent des insertions ou des modifications caractéristiques de chaque protéine et importantes pour leur fonction biologique propre.

Recyclage GDP → GTP, GEF-assisté

Le relargage du GDP des protéines G est un processus relativement lent et la présence d’une GEF permet de l’accélérer de plusieurs ordres de grandeur (environ 5). Le mécanisme d’action de la GEF passe par une série de réactions rapides et réversibles qui correspondent au passage successif du complexe binaire GTPase-GDP à un complexe ternaire GTPase-GDPGEF puis à un nouveau complexe binaire GTPase-GEF où la protéine G n’est plus liée à aucun nucléotide guanine. Cette série de réactions est alors réinversée par liaison d’un nouveau nucléotide qui est généralement le GTP, du fait de sa présence cellulaire prédominante par rapport au GDP (Cherfils and Chardin, 1999). La structure de complexes binaires entre la GTPase libérée de tout nucléotide et sa GEF a été obtenue dans le cas de différentes protéines G et en particulier pour le facteur d’élongation 1A (complexe EF-Tu:EF-Ts : Wang et al., 1997 ; complexe eEF1A-eEF1B : Andersen et al., 2000). Bien que les mécanismes diffèrent d’une GTPase à l’autre, quelques caractéristiques communes ont pu être tracées. Ainsi, les GEFs interagissent avec les régions Switch I et II de leur GTPase et en particulier, elles intercalent des résidus à proximité de la boucle GKT (motif G1) et de l’ion magnésium. Ces insertions provoquent un changement structural local au sein de la GTPase qui a un effet inhibiteur sur la liaison des phosphates du nucléotide guanine et de l’ion Mg2+ et permet ainsi le relargage du GDP.

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Table des matières

Chapitre I : INTRODUCTION
Partie A : Le démarrage de la traduction bactérienne
1) Les étapes du mécanisme
2) Formation du complexe de prédémarrage
1. Activités anti-associatrices d’IF3 et d’IF1
2. Liaison de l’ARNm
3. Liaison de l’ARNt
3) Interaction codon-anticodon et décodage
4) Association des sous-unités ribosomales
Partie B : Le démarrage de la traduction eucaryotique
1) Les étapes du mécanisme
2) Formation du complexe de prédémarrage 43S
1. Les partenaires protéiques du complexe de prédémarrage
2. Activité anti-associatrice d’eIF3, eIF1 et eIF1A
3. eIF6 : un cas ambigu ? 46
3) Recrutement de l’ARNm et balayage de sa séquence
1. Reconnaissance de la coiffe en 5’
2. Reconnaissance de la queue poly-(A) en 3’
4) Reconnaissance du codon AUG et hydrolyse du GTP
5) Association des sous-unités ribosomales
6) Autres modes de démarrage
Partie C : Le démarrage de la traduction archéenne
1) La traduction chez les Archées : un mécanisme hybride
2) Démarrage de la traduction archéenne : similitudes et divergences avec les autres domaines
1. L’ARNm
2. Les facteurs de démarrage
3) Conclusion
Chapitre II : LE FACTEUR D’INITIATION e/aIF2
Fonctionnalités et Organisation Structurale
Partie A : Rôle général du facteur de démarrage e/aIF2
1) Description fonctionnelle
2) Les protéines G : un mécanisme universel
1. Mécanisme du changement conformationnel
2. Hydrolyse du GTP, GAP-assistée
3. Recyclage GDP → GTP, GEF-assisté
Partie B : La sous-unité γdu facteur e/aIF2
1) Structure de la sous-unité γ
2) Zones spécifiques au facteur de démarrage
3) Modèle de positionnement de l’ARNt
4) Mouvement des régions Switch : comparaison d’e/aIF2γavec EF1A
5) Perspectives
Partie C : La sous-unité βdu facteur e/aIF2
1) Généralités
2) Structure de la sous-unité β
3) Fonction d’e/aIF2β
4) Modèle de positionnement d’aIF2βsur aIF2γ
5) Le domaine N-terminal d’eIF2β: une spécificité eucaryotique
6) eIF5 : une GAP classique ?
Partie D : La sous-unité αdu facteur e/aIF2
1) Généralités
2) Structure de la sous-unité α
3) Le recyclage GDP → GTP chez les Eucaryotes
OBJECTIFS
Chapitre III : CARTOGRAPHIE FONCTIONNELLE DU FACTEUR aIF2
Partie A : Reconnaissance spécifique de l’ARNt initiateur par le facteur aIF2
1) Clonage des gènes codant pour les 3 sous-unités du facteur aIF2 de P. abyssi
2) Purification des 3 sous-unités du facteur aIF2 de P. abyssi
1. Mode de surproduction adopté
2. Purification de Pa-aIF2, Pa-aIF2βet Pa-aIF2γ
4) Mesure de l’affinité de Pa-aIF2 pour l’ARNt
1. Principe de la méthode
2. Mise en œuvre expérimentale
3. Résultats préliminaires et mesure du Kd pour le complexe Pa-aIF2:Met-ARNti Met
4. Spécificité de Pa-aIF2 pour l’ARNt initiateur
5) Rôle des différentes sous-unités de Pa-aIF2 dans la liaison de l’ARNt
1. Rôle de Pa-aIF2γ
2. Rôle de Pa-aIF2
Partie B : Cartographie des zones d’interactions entre les sous-unités du facteur Pa-aIF2 La sous-unité γ, maillon central de l’assemblage
1) Obtention des mutants de la sous-unité γ
1. Obtention des différents plasmides mutés
2. Production et purification des mutants de Pa-aIF2γ
3. Production et purification des mutants du domaine du zinc
2) Tests d’assemblages sur gels natifs
3) Vérification de la stabilité structurale du mutant γΔL1
4) Validation du modèle de liaison de l’ARNt fourni par EF1A
Partie C : Cartographie des zones d’interactions entre les sous-unités du facteur Pa-aIF2 La sous-unité , un partenaire essentiel
1) Production des domaines séparés de Pa-aIF2
2) Tests d’assemblages avec la sous-unité γ
3) Implications fonctionnelles
Conclusions au Chapitre III
Chapitre IV : ÉTUDE STRUCTURALE DE LA SOUS-UNITÉ aIF2α
Partie A : Résolution de la structure de la sous-unité aIF2αde l’archée Pyrococcus abyssi
1) Principe de la cristallographie par diffraction des rayons X
2) Obtention des cristaux d’aIF2D2-3 de P. abyssi
3) Acquisition et traitement des données
1. Source de rayons X
2. Préparation des échantillons
3. Acquisition et traitement des données pour la protéine native
4) Résolution d’une structure par la diffusion anomale multi-longueur d’onde (MAD)
1. Principe
2. Obtention de la protéine αD2-3 sélénométhionylée, cristallisation et enregistrement des données
3. Résolution de la structure
5) Affinement du modèle
6) Résolution de la structure d’aIF2de P. abyssi
1. Cristallisation d’aIF2et acquisition des données
2. Principe de la méthode du remplacement moléculaire
3. Résolution de la structure
Partie B : Structure de la sous-unité aIF2αde l’archée Pyrococcus abyssi
1) Description générale
1. Structure de Pa-aIF2αD2-3
2. Structure de la protéine intacte Pa-aIF2α
3. Orientation relative des 3 domaines de la sous-unité α
2) Homologies structurales et de séquence
1. Homologies structurales
2. Homologies de séquence
3. Implications fonctionnelles
Chapitre V : ÉTUDE FONCTIONNELLE ET STRUCTURALE DE l’HÉTÉRODIMÈRE aIF2γ
Partie A : L’hétérodimère aIF2αD3γde P. abyssi
1) Cristallisation d’aIF2D3γde P. abyssi
2) Enregistrement et traitement des données
3) Tentatives pour résoudre la structure
Partie B : Caractérisation biochimique du facteur aIF2 de Sulfolobus solfataricus
1) Introduction
2) Clonage des gènes codant pour les 3 sous-unités d’aIF2 de S. solfataricus et purification des protéines
3) Affinité vis-à-vis du Met-ARNti Met et rôle des différentes sous-unités
Partie C : Résolution de la structure de l’hétérodimère aIF2γde l’archée Sulfolobus solfataricus
1) Cristallisation de Ss-aIF2γet enregistrement des données
2) Résolution de la structure et affinement du modèle
Partie D : Structure de l’hétérodimère aIF2γde l’archée Sulfolobus solfataricus
1) Description générale
1. Organisation structurale de l’hétérodimère
2. Zone d’interaction entre les deux sous-unités
3. Poche de fixation des nucléotides guanine
4. Les régions Switch I et Switch II
2) Positionnement de l’ARNt au sein du complexe SsaIF2αγ
1. Modèle de positionnement
2. Rôle de la sous-unité αdans la liaison de l’ARNt
3) Les sous-unités αet γ: un rôle concerté au sein de l’hétérotrimère ?
CONCLUSION
ANNEXES
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
LISTE DES TRAVAUX