Le cytosquelette d’Actine

Le cytosquelette

Dans les cellules eucaryotes, le cytosquelette est composé de trois familles de filaments, chaque type de filament est construit à partir de protéines différentes (Alberts 2002). Les protéines qui constituent les filaments sont parmi les plus abondantes dans les cellules eucaryotes. On décrit les filaments d’Actine, les microtubules et les filaments intermédiaires. Ces trois familles de filaments, bien qu’elles interagissent dans certains mécanismes, sont régulées différemment et ont des fonctions complémentaires. Elles partagent la propriété d’être des polymères dont l’assemblage et le désassemblage se produisent très rapidement, et la dynamique très importante de ces structures ainsi que leur capacité de se réorganiser constamment est nécessaire à leurs fonctions.

Je décris brièvement dans ce chapitre le fonctionnement du cytosquelette d’Actine relatif à la division cellulaire, puis, de façon plus approfondie, le fonctionnement et la régulation du cytosquelette de microtubules qui est indispensable à la division cellulaire, et enfin le centrosome.

Le cytosquelette d’Actine

Rôles

Le cytosquelette d’Actine intervient dans l’interaction entre la cellule et son environnement en régulant la forme de la cellule, son adhérence à la matrice extracellulaire et les phénomènes de migration (Vicente-Manzanares, Webb et al. 2005). L’Actine est un des composants majeurs des myofibrilles qui constituent les fibres musculaires et permet en s’organisant avec des molécules de Myosine II de former des fibres capables de se contracter, et donc de modifier la forme et la taille des cellules (Bagshaw 2000). Les filaments d’Actine jouent aussi un rôle dans le métabolisme cellulaire, notamment dans le transport actif de vésicules qui est nécessaire aux mécanismes de sécrétion, d’endocytose et dans la synthèse de lipides (Lanzetti 2007). Enfin, les filaments d’Actine jouent un rôle déterminant dans la dernière phase de la division cellulaire, la cytokinèse, en formant un anneau contractile responsable de la séparation des deux cellules filles (Wang 2001; Burgess 2005).

Structure

Les microfilaments d’Actine, ou Actine-f pour Actine-fibrillaire, sont formés à partir d’une seule molécule, l’Actine-g ou Actine globulaire, c’est-à-dire l’Actine sous sa forme monomérique. L’Actine-g est une protéine de 43 kDa dont il existe plusieurs isoformes. On dénombre 6 isoformes de l’Actine-g chez les mammifères qui sont codés par des gènes différents, régulés de façon tissu-spécifique (Vandekerckhove and Weber 1978). Les molécules d’Actine-g sont couplées à une molécule d’ATP qui est hydrolysée en ADP lors du processus de polymérisation. La polymérisation des microfilaments d’Actine s’effectue à partir de sous-unités formées de trimères d’Actine-g qui permettent d’amorcer la formation d’un noyau (Alberts 2002). Du fait même de la présence de la molécule d’ATP, les microfilaments d’Actine formés sont dit polaires, avec deux extrémités structuralement différentes. On distingue l’extrémité (+) ou « barbue » et l’extrémité (-) ou « pointue ». Ces deux extrémités présentent des cinétiques d’assemblage et de désassemblage des monomères d’Actine différentes, l’extrémité (+) incorporant plus rapidement des sous-unités d’Actine que l’extrémité (-) . La différence de vitesse d’assemblage et de désassemblage des sous-unités aux deux extrémités induit une polymérisation globalement « en tapis roulant » (« traidmilling »), avec un flux unidirectionnel des nouvelles sous-unités vers le pôle (-) (Wang 1985).

Dynamique d’assemblage/désasemblage et régulation 

In vitro, la polymérisation des filaments d’Actine se produit lorsque l’Actine-g atteint une certaine concentration, et la vitesse de polymérisation dépend aussi de la concentration d’Actine-g. In vivo, la nucléation et la dynamique d’élongation des filaments sont régulées par des protéines interagissant soit avec les monomères d’actine soit avec les filaments d’actine (Welch, Mallavarapu et al. 1997; dos Remedios, Chhabra et al. 2003).

La régulation de la contraction des myofibrilles dans les fibres musculaires dépend essentiellement de la régulation de la Myosine II. La Myosine II est une protéine motrice interagissant avec les filaments d’Actine et capable de transformer l’énergie issue de l’hydrolyse de l’ATP en énergie mécanique.

Cas particulier de l’anneau contractile

En cytokinèse, l’Actine forme avec la Myosine II un anneau contractile juste sous la membrane cellulaire, à mi-distance entre les deux centrosomes (Burgess 2005). A la fin de la division cellulaire cet anneau se contracte tel un sphincter et départage les deux cellules filles tout en délimitant le site du clivage qui aura lieu en toute fin de cytokinèse. Les protéines Formine et Profiline participent à la polymérisation des fibres d’Acto-Myosine (Basu and Chang 2007).

La mise en place de cet anneau contractile est guidée par la protéine Anilline, qui se lie d’une part à la membrane et d’autre part aux filaments d’Actine (Piekny and Glotzer 2008) . La contraction de l’anneau contractile est principalement contrôlée par la protéine RhoA, une protéine GTPase qui est l’isotype principal des protéines Rho chez les mammifères (Hickson and O’Farrell 2008). Parmi les inducteurs de l’activation de RhoA lors de la cytokinèse seraient les microtubules astraux (D’Avino, Savoian et al. 2005). L’extrémité (+) des microtubules astraux qui est dirigée vers la membrane (le cortex) serait à l’origine de signaux qui inhiberaient la contraction et limiteraient ainsi l’ingression de la membrane à la zone située autour de l’anneau contractile, non régulée par les microtubules astraux (Basu and Chang 2007).

Par ailleurss, l’accumulation, au niveau du fuseau central (central spindle), de protéines nécessaires à l’accumulation et l’activation locale de RhoA limiterait aussi la localisation de l’anneau contractile. Parmi les protéines régulatrices de RhoA au fuseau central se trouve Ect2/Pebble (une GEF : GTP-GDP Echange Factor) et MgcRacGAP (une GAP : GTPase Activating Protein), dont la localisation est restreinte au fuseau central par liaison à la protéine motrice de type kinésine MKPL1 (Kurasawa, Earnshaw et al. 2004; McCollum 2004; Zhu, Bossy-Wetzel et al. 2005). Ect2/Pebble est aussi phosphorylée en métaphase et cette phosphorylation inhibe sa liaison à MKLP1 (Piekny, Werner et al. 2005). Les protéines kinases Aurora B et Plk1 jouent aussi un rôle dans la régulation de la cytokinèse. La protéine kinase Aurora B phorphoryle MgcRacGAP et cette phosphorylation modifie l’activité RacGAP en activité RhoGAP, qui permet l’activation de RhoA et la contraction de l’anneau (Minoshima, Kawashima et al. 2003). La protéine kinase Plk1 régule quant à elle la localisation sur le fuseau central d’Ect2/Pebble (Petronczki, Glotzer et al. 2007). En l’absence d’activité Plk1 spécifiquement en cytokinèse, l’ingression de la membrane ne se produit pas.

La Myosine II est responsable de la contraction de l’anneau d’Acto-Myosine en télophase et en cytokinèse. Elle est régulée par phosphorylation sur les résidus Ser19/Thr18 de sa chaine légère. En fin de phase G2, la chaine légère de la Myosine II est phosphorylée et la Myosine II est active, jouant un rôle au niveau des adhésions focales et des fibres de stress. En début de prophase, la phosphatase spécifique de la Myosine est activée, elle déphosphoryle la Myosine II, ce qui permet la réorganisation du réseau de microfilaments d’Actine (Matsumura, Totsukawa et al. 2001). En fin de mitose, lors de la cytokinèse, la Myosine II est phosphorylée et activée par des kinases dépendantes de Rho (Matsumura, Totsukawa et al. 2001). Les kinases Citron et ROCK sont des effecteurs de Rho et sont capables de phosphoryler la chaine légère de la Myosine II in vitro (Piekny, Werner et al. 2005). Citron et ROCK ont été impliquées dans la régulation de la contraction de l’anneau d’Acto-Myosine (Madaule, Eda et al. 1998; Matsumura, Totsukawa et al. 2001; Yamashiro, Totsukawa et al. 2003).

Les microtubules

Rôles

Les microtubules interviennent dans l’organisation du cytoplasme, ils sont responsables de la place centrale du noyau cellulaire et régulent la répartition et localisation de l’appareil de Golgi et du réticulum endoplasmique. Les microtubules jouent un rôle très important dans la structure des axones neuronaux. Le cytosquelette microtubulaire est particulièrement impliqué dans le transport de molécules spécifiques via des moteurs moléculaires qui se déplacent sur les microtubules. Ce transport est particulièrement important dans le fonctionnement des neurones mais aussi pour les échanges entre le noyau et le cytoplasme. Les microtubules forment aussi la structure des cils que l’on peut observer dans certaines cellules somatiques et qui constituent le flagelle du spermatozoïde. Les microtubules opèrent un complet réarrangement de leur organisation pour former le fuseau mitotique en début de mitose puis le fuseau central en télophase. La dynamique des microtubules est déterminante pour le bon déroulement de la mitose et la ségrégation correcte des chromosomes. Le point de contrôle mitotique permet de contrôler la dynamique des microtubules grâce à des mécanismes que je décris plus loin. Récemment, il a été montré que la phase G2 serait aussi le lieu d’un contrôle de la dynamique des microtubules via la protéine Chfr, cette découverte est aussi décrite dans le chapitre consacré aux points de contrôles du cycle cellulaire.

Structure

Les microtubules sont des polymères composés de proto-filaments de Tubuline, un dimère comprenant une sous-unité de Tubuline-α et une de Tubuline-β (Alberts 2002). Chacune des sous-unités du dimère est associée à une molécule de GTP. Au cours de la polymérisation des microtubules la molécule de GTP associée à la sous-unité β est hydrolisée en GDP, tandis que la molécule de GTP associée à la sous-unité α est non hydrolysable (David-Pfeuty, Erickson et al. 1977; Spiegelman, Penningroth et al. 1977). Les microtubules sont des tubes creux de 24 nm de diamètre formés de 13 proto-filaments de Tubuline associés latéralement et orientés dans la même direction (cf. schéma 4). La structure résultante est polarisée, avec une extrémité présentant des sous-unités α et une extrémité présentant des sous-unités β (Alberts 2002). Ces deux extrémités ont des dynamiques d’assemblage et de désassemblage différentes. On décrit les extrémités des microtubules selon leur dynamique, ainsi l’extrémité qui polymérise/dépolymérise le plus rapidement est l’extrémité (+), l’autre est l’extrémité (-). Des études de biologie structurale ont permis de déterminer que l’extrémité (+) est en fait celle présentant les sous-unités β (Downing and Nogales 1999).

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Table des matières

INTRODUCTION
1 PREAMBULE
2 INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE
2.1 LE CYTOSQUELETTE
2.1.1 Introduction
2.1.2 Le cytosquelette d’Actine
2.1.2.1 Rôles
2.1.2.2 Structure
2.1.2.3 Dynamique d’assemblage/désasemblage et régulation
2.1.2.4 Cas particulier de l’anneau contractile
2.1.3 Les microtubules
2.1.3.1 Rôles
2.1.3.2 Structure
2.1.3.3 Dynamique d’assemblage
2.1.3.4 Cas particulier du fuseau mitotique
2.1.3.4.1Mise en place du fuseau
2.1.3.4.2Régulation via les protéines non motrices
2.1.3.4.3Régulation via des protéines motrices
2.1.4 Le centrosome
2.1.4.1 Rôle
2.1.4.2 Structure
2.1.4.3 Le cycle de duplication du centrosome
2.1.4.4 Centrosome et régulation du cycle cellulaire
2.2 VIE ET MORT DES CELLULES SOMATIQUES
2.2.1 Introduction
2.2.2 Le cycle cellulaire
2.2.2.1 Les différentes phases du cycle cellulaire
2.2.2.2 Description de la phase M
2.2.2.3 Les intervenants moléculaires de la mitose
2.2.2.3.1Les complexes régulant la compaction et l’organisation des chromosomes
2.2.2.3.2Les kinétochores et les protéines du point de contrôle mitotique
2.2.2.3.3Les protéines passagères
2.2.2.4 La régulation du cycle cellulaire
2.2.2.4.1Les complexes Cyclines-CDK
2.2.2.4.2Les régulateurs des complexes Cyclines-CDK
2.2.2.5 Cas particulier de la phase G1
2.2.2.6 Cas particulier de la mitose
2.2.2.6.1L’entrée en mitose
2.2.2.6.2La sortie de mitose
2.2.2.7 Les points de contrôle
2.2.2.7.1La notion de point de contrôle du cycle cellulaire
2.2.2.7.2Le point de contrôle de l’antéphase
2.2.2.7.3Le point de contrôle du fuseau mitotique
2.2.2.7.4Points de contrôle détéctant l’endommagement de l’ADN
2.2.3 La mort cellulaire programmée
2.2.4 La senescence
2.3 ANOMALIES CHROMOSOMIQUES ET CANCEROGENESE
2.3.1 Définitions
2.3.2 Origine
2.3.3 Rôle dans la cancerogénèse
3 OBJECTIFS DES TRAVAUX DE THESE
4 RESULTATS ET DISCUSSION I : ROLE D’UNE PROTEINE DU CENTROSOME DANS LES EVENEMENTS FINAUX DE LA PHASE M
4.1 INTRODUCTION AU SUJET
4.2 ARTICLE
5 RESULTATS ET DISCUSSION II : ETUDE DES CONSEQUENCES DE LA PERTURBATION DE LA MITOSE SUR LA PROLIFERATION CELLULAIRE
5.1 PRESENTATION DU SUJET
6 RESULTATS
6.1 VALIDATION DU MODELE
6.1.1 Etude de l’effet de différentes concentrations d’inhibiteurs de la polymérisation des microtubules sur le contenu des cellules en ADN
6.1.2 En présence de faibles doses d’inhibiteur, les cellules traversent la mitose de façon anormale
6.2 ETUDE DE LA PROLIFERATION DES CELLULES ANEUPLOÏDES
6.3 CARACTERISATION DU PHENOTYPE OBSERVE
6.3.1 L’arrêt des cellules est dû aux anomalies de la mitose
6.3.2 Le contournement de cet arrêt nécessite l’inhibition de p53 et de pRb
7 CONCLUSIONS
CONCLUSION

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