La vulnérabilité des personnes atteintes de fibrose kystique face aux microorganismes pathogènes opportunistes

La vulnérabilité des personnes atteintes de fibrose kystique face aux microorganismes pathogènes opportunistes

LESB58, souche de Pseudomonas aeruginosa adaptée à la fibrose kystique

Les premiers isolats des souches LES (Liverpool Epidemic Strain) de P. aeruginosa ont été isolés en 1988 dans une clinique médicale dédiée à la FK, à partir de l’expectoration de patients qui s’y faisaient soigner. La première publication sur ces souches remonte à 1996, dans un article démontrant la possibilité de transmission d’infections pulmonaires à P. aeruginosa entre patients souffrant de FK (Cheng et al., 1996). En effet, non seulement les souches LES sont-elles adaptées à ce type d’infection, mais elles sont également épidémiques chez ces patients, un phénomène qui n’avait encore jamais été observé. On découvrit par la suite qu’il existe plusieurs souches de P. aeruginosa pouvant être épidémiques chez les gens atteints de FK (par exemple la Manchester epidemic strain et l’Australian epidemic strain (Fothergill et al., 2012)), mais les souches LES furent les premières à être décrites. LESB58, l’une de ces souches, fut finalement séquencée en 2009 (Winstanley et al., 2009) et devint un exemple des souches qui peuvent être retrouvées lors d’infections pulmonaires chroniques chez les personnes souffrant de FK. D’ailleurs, afin de pouvoir étudier plus en profondeur les mécanismes moléculaires de sa virulence particulière, une banque de mutants uniques de LESB58 a été créée par mutagenèse par étiquette (STM pour « signature-tagged mutagenesis », en anglais) (Winstanley et al., 2009).
Du point de vue génétique LESB58 possède six prophages (dont un défectueux) et plusieurs îlots génétiques qui pourraient être liés à sa virulence (Jani et al., 2016; Lemieux et al., 2016). Comme on peut s’y attendre d’une souche provenant d’infection chronique, elle est moins motile, mais produit plus de biofilm que PAO1, en plus d’être résistante à de nombreux antibiotiques (Salunkhe et al., 2005; Carter et al., 2010). Par ailleurs, des tests d’infectiosité pulmonaire chez le rat ont démontré que LESB58 tend à demeurer dans les bronches, au contraire de PAO1 qui parvient à coloniser les alvéoles pulmonaires (Kukavica-Ibrulj et al., 2008).
Les souches LES causent des infections chroniques et sont souvent qualifiées d’hypervirulentes. Capables de se propager entre les patients FK, la transmission à des personnes non-FK a également déjà été rapportée (McCallum et al., 2002) et les souches LES sont associées à un plus haut taux de mortalité que les autres souches de P. aeruginosa (Al-Aloul et al., 2004). De plus, leur QS semble s’exprimer tôt, faisant en sorte qu’elles produisent de façon abondante certains facteurs de virulence, dont la pyocyanine (Winstanley et al., 2009; Carter et al., 2010). LESB58 est donc une souche d’infection chronique FK singulière et inquiétante, capable de nous aider à comprendre la virulence de P. aeruginosa chez les patients atteints de FK.

L’origine des infections à Pseudomonas aeruginosa chez les personnes atteintes de fibrose kystique

Avant même que la démonstration d’une transmission de souches épidémiques de P. aeruginosa entre personnes souffrant de FK ne soit rapportée, la possibilité d’une contamination directe ou indirecte entre patients a souvent été soulevée (Speert et Campbell, 1987; Hoogkampkorstanje et al., 1995; Doring et al., 1996). Cette présomption a d’ailleurs été à l’origine de modifications des précautions prises dans les cliniques de soins pour ces patients afin de limiter les risques de contagion (Zimakoff et al., 1983). Cependant, encore aujourd’hui, les infections pulmonaires à P. aeruginosa demeurent majoritairement acquises de source inconnue (Saiman et Siegel, 2004). L’acquisition à partir de l’environnement, dans les lieux de soins ou à l’extérieur de ceux-ci, demeure donc un sujet d’inquiétude.
P. aeruginosa est une bactérie très adaptable, capable de proliférer dans un nombre considérable d’environnements différents. Des souches ont été isolées à des endroits aussi divers que l’eau de mer (Manwar et al., 2004), la rhizosphère de plants de cantaloup (Wu et al., 2011), l’estomac d’un dauphin de delphinarium (Grosso-Becerra et al., 2014) et des sols contaminés aux explosifs (Chien et al., 2014). Dans notre environnement plus immédiat, il est également possible d’isoler cette bactérie à partir de notre nourriture et de l’eau potable (Hardalo et Edberg, 1997). Dans un but évident de comprendre les mécanismes importants de pathogénicité de P. aeruginosa chez l’humain, les souches d’origine clinique, provenant de patients atteints de FK ou d’autres types d’infections humaines, animales ou végétales, sont toutefois les plus représentées dans la littérature. En les comparant entre elles, il est possible de faire ressortir certaines caractéristiques génétiques ou phénotypiques particulières pour mettre à jour des phénomènes tels que l’adaptation à l’infection de patients souffrants de FK, discutée précédemment. Certaines études utilisent aussi des souches environnementales de P. aeruginosa dans un but de comparaison de ces souches avec des souches cliniques, mais la caractérisation comparative des souches environnementales entre elles est peu exhaustive.
Il a été démontré qu’il existe une grande diversité chez les souches de P. aeruginosa de toutes origines, avec, notamment, la détermination de trois grands groupes phylogénétiques (Freschi et al., 2015). L’un de ces groupes (le groupe 2) comporte actuellement 374 isolats répertoriés de P. aeruginosa (A.T. Vincent, communication personnelle), dont 16 souches environnementales qui ont été isolées de canalisations d’eau d’unités dentaires de la faculté de médecine dentaire de l’Université de Montréal pour un projet collaboratif concomitant à l’étude présentée dans ce mémoire. Treize de ces isolats provenant d’unités dentaires ont été le sujet d’un article scientifique démontrant qu’ils peuvent être divisés en deux sous-groupes, nommés Cluster II et III. Dans cette même étude, une comparaison avec 16 isolats provenant de patients atteints de FK a révélé qu’ils étaient nettement distincts des 13 isolats environnementaux et ces isolats cliniques ont été classés dans un sous-groupe différent, le Cluster I, appartenant au groupe 1 (Ouellet et al., 2014). Une seconde étude incorporant trois nouveaux isolats environnementaux de la même origine que les précédents et sept nouveaux isolats cliniques est venue renforcer cette investigation par une analyse génomique approfondie (Vincent et al., 2017) (Figure 1.3).
Figure 1.3 Phylogénie moléculaire de 1394 isolats de P. aeruginosa.3
Tel que démontré par Freschi et al., les souches de P. aeruginosa se partagent en trois grands groupes (Freschi et al., 2015). PAO1 et LESB58 appartiennent au groupe 1. Les 13 souches environnementales (Cluster II et III) de Ouellet et al. (Ouellet et al., 2014) se retrouvent toutes dans le groupe 2. Le cercle jaune présent dans le groupe 1 correspond à deux souches cliniques qui auraient été attribuées au Cluster II par erreur et devraient plutôt appartenir au Cluster I (cercles roses). Des cercles gris (souches non assignées par Ouellet et al.) permettent de distinguer les souches ajoutées dans l’étude de Vincent et al. (Vincent et al., 2017) de celles de Ouellet et al. Les trois souches de Vincent et al. d’origine environnementale appartiennent au groupe 2 (deux s’associent au Cluster II et une au Cluster III). La souche Urg-7 est un exemple des dix souches comprises dans le Cluster II (cercles jaunes). La souche PPF-1 est un exemple des six souches comprises dans le Cluster III (cercles turquoises). La barre de mesure représente le nombre de substitutions par site. La distance entre le groupe 3 et les deux autres groupes a été tronquée, mais est illustrée à l’échelle dans le coin supérieur droit de l’image.
Figure modifiée (traduction et édition d’image) d’après une figure originale de Vincent et al. (Vincent et al., 2017), utilisée sous licence RightsLink (#4283080286886) avec la permission d’Oxford University Press (OUP) au nom de la Federation of European Microbiological Societies (FEMS). OUP et FEMS ne sont pas légalement responsables de la fidélité de la traduction effectuée et du contenu des modifications apportées. C. Gagné-Thivierge en assume l’entière responsabilité.
Les souches du Cluster II sont génétiquement plus proches des souches du Cluster III que de celles du Cluster I, ce qui est probablement le reflet de l’appartenance à une niche écologique commune des souches des Clusters II et III. Par contre, le Cluster II partage plusieurs similitudes phénotypiques avec les souches cliniques du Cluster I. Les données disponibles sur l’état de santé des patients au moment de l’échantillonnage des souches du Cluster I étant fragmentaires, il est possible que ces patients n’aient pas été infectés de façon chronique et que les souches isolées aient été encore en processus d’adaptation à l’infection pulmonaire. C’est possiblement parce qu’elles n’auraient pour la plupart pas encore développé les caractéristiques habituelles des souches chroniques que les souches cliniques du Cluster I seraient donc, d’un point de vue phénotypique, plutôt ressemblantes à celles environnementales du Cluster II (A.T. Vincent, communication personnelle).
Les souches du Cluster III, quant à elles, sont singulières. Elles possèdent des gènes codant pour des épimérases (des enzymes impliquées dans la formation des lipopolysaccharides (LPS) et l’attribution du sérotype de la bactérie (Kneidinger et al., 2003)) et produisent très peu d’élastase, mais beaucoup de biofilm (Ouellet et al., 2014). De plus, leur QS est perturbé par l’insertion d’un élément d’ADN mobile à l’intérieur du gène lasR (Vincent et al., 2017).
À la lumière des résultats de leur étude, Vincent et al. ont émis l’hypothèse que les isolats du Cluster III étaient peut-être le fruit d’une adaptation à la colonisation de canalisations d’eau potable (Vincent et al., 2017). Cependant, cette adaptation semble partager plusieurs similarités avec l’adaptation de P. aeruginosa qui s’effectue lors de l’infection pulmonaire FK (diminution de la motilité, augmentation de la formation de biofilms, perturbation du QS, etc.). Les auteurs émettent ainsi l’hypothèse que certains environnements parviennent à induire un stress sur les bactéries qui entraîne une évolution similaire à celle menant au développement de la chronicité des infections dans les poumons des personnes atteintes de FK. Ils concluent en remarquant que, s’il est vrai que l’adaptation de P. aeruginosa à différents environnements peut converger vers un résultat évolutif équivalent, l’étude de P. aeruginosa ne devrait donc pas se restreindre à l’évaluation de souches cliniques. Il n’est, en effet, pas exclu que les souches environnementales ne soient pas toutes similaires et que certaines d’entre elles en viennent à représenter un risque important pour les patients souffrant de FK.

La nécessité de trouver de nouveaux moyens de lutte contre Pseudomonas aeruginosa

Considérant les caractéristiques particulières des souches de P. aeruginosa adaptées à la FK, il est actuellement très complexe de soigner les patients infectés. Des antibiotiques peuvent être administrés par voie orale, par intraveineuse ou par inhalation (Cystic Fibrosis Foundation, 2018). Cependant, étant donné le développement fréquent de résistances aux antibiotiques lors de l’adaptation de P. aeruginosa à la FK, le type de traitement choisi doit être ajusté en fonction du patient et des souches de P. aeruginosa retrouvées et peut, malgré tout, éventuellement échouer. De façon presque inévitable, l’infection devient alors chronique et impossible à éliminer (Doring et al., 2000; Folkesson et al., 2012).
Une approche proposée pour contrer cette problématique serait d’altérer un ou plusieurs facteurs de virulence de P. aeruginosa nécessaire(s) à l’infection afin de limiter sa capacité infectieuse et augmenter l’efficacité des traitements déjà existants. Plusieurs chercheurs intéressés par cette démarche envisagent le QS et/ou le biofilm comme facteurs de virulence à cibler (Sharma et al., 2014; Taylor et al., 2014; O Muimhneachain et al., 2018).

Les biofilms et leur importance

La formation de biofilm est intimement liée au QS (Fazli et al., 2014). Il s’agit d’un mode de croissance microbien qui se caractérise par l’attachement à une surface et la production, par les microorganismes, d’exopolysaccharides. Ces polymères de sucres viennent entourer les cellules microbiennes qui les produisent, formant un manteau protecteur. En plus des exopolysaccharides produits par les microorganismes, le biofilm comprend toutes sortes de matériaux cellulaires (ADN, lipides, protéines) qui façonnent sa structure et ses propriétés physico-chimiques (Wei et Ma, 2013).De façon simplifiée, la formation de biofilm peut être divisée en cinq étapes (Stoodley et al., 2002; Toyofuku et al., 2015). 1) Tout d’abord, des cellules planctoniques adhèrent de façon réversible à une surface. 2) Éventuellement, notamment grâce à un début de production d’exopolysaccharides qui permet de stabiliser l’attachement, une ou quelques cellules se fixent de façon irréversible à la surface. 3) Ensuite, il y a prolifération des cellules à l’intérieur du jeune biofilm, qui prend de l’expansion. 4) Puis, le biofilm mature, développant une structure influencée par l’environnement dans lequel il se trouve. Cela crée des microenvironnements au sein du biofilm et les phénotypes de la population bactérienne qui s’y trouve se diversifient, en fonction de ces microenvironnements. 5) Finalement, une partie des cellules microbiennes (sous forme planctonique ou dans un morceau arraché au biofilm) va être libéré afin de permettre la colonisation d’un nouvel endroit.Les biofilms se retrouvent partout. Bien que les débuts de la microbiologie en aient fait abstraction en se concentrant sur l’étude de cultures pures de microorganismes planctoniques, on considère aujourd’hui que c’est sous forme de biofilms que vit certainement la majorité des bactéries (Costerton et al., 1978).D’un point de vue humain, bien qu’ils puissent parfois être avantageux (ils peuvent, par exemple, être utilisés comme biofiltres pour le traitement de l’air et des eaux usées (Wani et al., 1997; Cohen, 2001)), les biofilms sont le plus souvent perçus négativement. Dans l’industrie maritime, l’accumulation de biofilms sur la coque des navires diminue l’hydrodynamisme de ces derniers, entraînant une augmentation de la consommation en carburant (Townsin, 2003). Dans l’industrie alimentaire, la formation de biofilms sur les équipements peut présenter un risque pour la qualité et la sécurité des produits (Winkelströter et al., 2014). Dans les canalisations d’eau potable, les biofilms peuvent présenter un risque sanitaire, en plus d’être impliqués dans la corrosion des tuyaux (Wingender et Flemming, 2011; Vargas et al., 2017). Les biofilms sont également une cause d’inquiétude importante dans le domaine médical, où il est question de microorganismes pathogènes envers l’humain dans un environnement comptant de nombreuses personnes à la santé fragile (Costerton et al., 1999).
Les biofilms de P. aeruginosa sont parmi les plus étudiés. Dans le domaine médical, ils ont d’ailleurs été documentés dès 1980 (Lam et al., 1980), à la même époque où le terme « biofilm » fut popularisé par William J. Costerton (Costerton et al., 1978; McCoy et al., 1981). Cette observation provenait de poumons de patients atteints de FK et vint poser l’hypothèse que la formation de biofilms pourrait jouer un rôle important pour la virulence de P. aeruginosa dans ce contexte.

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Table des matières

Chapitre 1 : Introduction
1.1 Introduction
1.1.1 La vulnérabilité des personnes atteintes de fibrose kystique face aux microorganismes pathogènes opportunistes
1.1.2 Le problème des infections pulmonaires chez les personnes atteintes de fibrose kystique
1.1.3 Pseudomonas aeruginosa, bactérie pathogène opportuniste
1.1.4 Les facteurs de virulence de Pseudomonas aeruginosa
1.1.5 L’adaptation de souches de Pseudomonas aeruginosa aux poumons des personnes atteintes de fibrose kystique
1.1.6 LESB58, souche de Pseudomonas aeruginosa adaptée à la fibrose kystique
1.1.7 L’origine des infections à Pseudomonas aeruginosa chez les personnes atteintes de fibrose kystique
1.1.8 La nécessité de trouver de nouveaux moyens de lutte contre Pseudomonas aeruginosa
1.1.9 Les biofilms et leur importance
1.1.10 La formation de biofilm comme facteur de virulence
1.1.11 Les biofilms de Pseudomonas aeruginosa
1.2 Hypothèse de recherche
1.3 Objectifs spécifiques
Chapitre 2 : Identification à l’aide d’une approche multi-hôtes d’un mutant par transposon de Pseudomonas aeruginosa LESB58 ayant une virulence atténuée
2.1.1 Résumé
2.2 A multi-host approach to identify a transposon mutant of Pseudomonas aeruginosa LESB58 lacking full virulence
2.2.1 Abstract
2.2.2 Introduction
2.2.3 Materials and methods
2.2.3.1 Bacterial strains
2.2.3.2 Dictyostelium discoideum predation assay
2.2.3.3 Fly pricking assay
2.2.3.4 Competitive index in rat model
2.2.4 Results and discussion
2.2.4.1 Reduced virulence of LESB58 mutants in Dictyostelium discoideum
2.2.4.2 Identification of the STM PALES_11731 mutant with the Drosophila systemic model
2.2.4.3 The STM PALES_11731 mutant is strongly attenuated in the chronic lung infection model
2.2.4.4 Potential consequences of the transposon insertion in the STM PALES_11731 mutant
2.2.4.5 The highly reduced virulence of the STM PALES_11731 mutant is likely multifactorial
2.2.5 Limitations
2.2.6 References
2.2.7 Additional material
Chapitre 3 : Une nouvelle approche pour l’étude des biofilms adhérés ou flottants produits par des souches de Pseudomonas aeruginosa de différentes origines révèle un effet varié de la présence d’ions divalents sur ces structures
3.1.1 Résumé
3.2 A new approach to study attached and floating biofilms produced by Pseudomonas aeruginosa strains of various origins reveals various effects of divalent ions on these structures
3.2.1 Abstract
3.2.2 Introduction
3.2.3 Materials and methods
3.2.3.1 Bacterial strains
3.2.3.2 Growth curve establishment
3.2.3.3 Crystal violet staining
3.2.3.4 Biofilm quantification using imaging
3.2.3.5 Biofilm-like structure quantification
3.2.3.6 Scanning electron microscopy (SEM) of the biofilm-like structures
3.2.4 Results and discussion
3.2.4.1 Increased attached biofilm formation in the Urg-7 isolate
3.2.4.2 High concentration of Zn2+ greatly increases attached biofilm formation
3.2.4.3 P. aeruginosa’s floating biofilm-like structures and their modulation by cations
3.2.4.4 BLSs are heterogeneous structures formed of cells embedded in extracellular matrix
3.2.4.5 Planktonic growth does not correlate with biofilm formation
3.2.4.6 Conclusions and perspectives
3.2.5 References
Chapitre 4 : Conclusion
4.1 Discussion générale
4.1.1 Étude du mutant STM PALES_11731
4.1.2 Étude de la diversité des biofilms de Pseudomonas aeruginosa
4.1.3 Comprendre la formation des biofilm-like structures (BLS)
4.2 Conclusions et perspectives
Bibliographie
Annexes
Annexe 1 – Comparaison de la formation de biofilms adhérés et de BLS chez LESB58 et le mutant STM PALES_11731
Annexe 2 – Live/Dead des BLS
Annexe 3 – Croissance de PAO1
Annexe 4 – Microfluidique de PAO1, PPF-1 et LESB58

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