Soutenance mémoire
La traduction des ARN messagers
La traduction permet la synthèse des protéines à partir de l’information génétique. Ce processus qui se déroule dans le cytoplasme des cellules permet l’élaboration d’une séquence d’acides aminés à partir de la séquence de nucléotides d’un ARN messager (ARNm). Ce processus vital dans la cellule peut être décomposé en trois étapes : l’initiation, l’élongation et la terminaison. Chacune de ces étapes intervient dans la régulation de l’expression des gènes. La traduction de l’ARNm en protéine implique un grand nombre de facteurs protéiques qui interviennent dans les étapes d’initiation (eIF, pour « eukaryotic Initiation Factor »), d’élongation (eEF, pour « eukaryotic Elongation Factor ») et de terminaison (eRF, pour « eukaryotic Release Factor » ou facteur de libération eucaryote). Ces facteurs assurent le déroulement précis de chaque étape et sa régulation. Certains de ces facteurs ont une activité GTPase qui apporte l’énergie nécessaire à chaque étape du processus de traduction. Au cours de ce chapitre, je vais décrire, brièvement, dans un premier temps l’ARNm et par la suite je décrirai le processus de la traduction en insistant sur le facteur de terminaison de la traduction eRF3.
L’ARN messager
Le processus de la transcription est la transformation du matériel génétique d’ADN en ARN. Chez les eucaryotes, trois ARN-polymérases (ARNpol) interviennent dans la transcription : l’ARNpol I pour les ARN ribosomiques (ARNr) 28S, 18S et 5,8S transcrits dans le nucléole, l’ARNpol II pour les ARN messagers et l’ARNpol III pour les petits ARN comme les ARN de transfert (ARNt), l’ARNr 5S, et les petits ARN nucléaires (ARNsn).
En ce qui concerne la formation de l’ARNm, le transcrit primaire n’est pas utilisé tel quel pour la synthèse protéique (la traduction). Il subit des modifications qui permettent l’augmentation de sa demi-vie et la modification de sa séquence. Toutes ces modifications sont réalisées au fur et à mesure de la progression de la synthèse du préARNm dans le nucléoplasme. Il existe trois grands types de modifications : l’addition d’une coiffe en 5′, l’excision des introns -épissage des exons et la polyadénylation en 3′.
Le coiffage consiste en l’ajout d’un nucléotide à guanine sur l’extrémité 5′ de l’ARNm suivi de sa méthylation sur l’azote 7 de la base, ainsi que de la méthylation en 2′ du ribose des un ou deux premiers nucléotides du transcrit primaire. Il en résulte que l’extrémité 5′ de l’ARNm n’est pas porteuse des trois acides phosphoriques libres habituels, mais d’un GMP, ce qui limite la réactivité de cette extrémité et sa reconnaissance par les exonucléases (protection contre la dégradation). Cet ensemble sert de coiffe protectrice à l’extrémité 5′ de l’ARNm. Elle est également nécessaire à l’exportation de l’ARNm vers le cytoplasme et à la liaison de ce dernier avec la petite sous-unité du ribosome lors de l’étape d’initiation de la traduction.
L’excision-épissage : les gènes sont constitués d’une alternance d’exons et d’introns qui sont d’abord intégralement transcrits en préARNm, qui subissent ensuite une opération d’excision des introns suivi d’un épissage (splicing), c’est à dire de la réunion bout à bout des exons restants qui constituent alors l’ARNm. Ce remaniement se déroule au fur et à mesure de la progression de la transcription.
La polyadénylation est l’addition d’une succession de résidus adényl sur l’extrémité 3′ de l’ARNm pour former une queue Poly(A). Le site de polyadénylation codé au niveau du gène est présent sur l’ARNm. Ce site est formé par une séquence hexanucléotidique AAUAAA et par une séquence nommée DSE (Downstream SequenceElement) riche en U ou en GU. La séquence AAUAAA est reconnue spécifiquement par un complexe protéique appelé CPSF (Cleavage and Polyadenylation Specific Factor), et la séquence DSE par le complexe CstF (Cleavage Stimulation Factor). Ces deux complexes et d’autres composants, comme l’ARN pol II et la Poly(A) polymérase (PAP), vont interagit en formant le complexe de clivage qui va cliver la molécule de préARNm au niveau du site de clivage. La PAP va alors ajouter environ 200 nucléotides adénine. Cette queue Poly(A) confère de la stabilité au futur ARNm (Figure 1).
La traduction des ARN messagers
La traduction correspond à la lecture des codons de l’ARNm par le ribosome. Elle se fait de l’extrémité 5’ vers l’extrémité 3’ de l’ARNm et se déroule en trois étapes: l’initiation, l’élongation, la terminaison. A la fin de la terminaison, le recyclage du ribosome permet le déclenchement d’un nouveau cycle de la traduction. L’initiation permet de définir le site de démarrage de la synthèse protéique où s’associent les deux sous unités du ribosome, l’élongation correspond à la synthèse de la chaîne polypeptidique constituant les protéines par décodage de l’ARNm. La terminaison permet la libération de la protéine néo-synthétisée et la dissociation des sous unités ribosomiques. Enfin le recyclage du ribosome permet la réinitiation de la traduction.
Les étapes de la traduction chez les eucaryotes
Je décrirai dans ce paragraphe très brièvement les étapes d’initiation et d’élongation pour approfondir celle de terminaison qui a fait l’objet de mon travail de thèse.
L’initiation
Le mécanisme d’initiation de la traduction chez les eucaryotes est décrit par le modèle du balayage ou «scanning model», proposé par Kozak en 1978 (Kozak, 1978). Selon ce modèle, l’initiation commence par la reconnaissance du complexe de coiffe (eIF4E-eIF4G) fixé sur l’extrémité 5’ de l’ARNm par la sous unité 40S du ribosome chargée d’un ARNt méthionine initiateur et finit par la reconnaissance du codon d’initiation. La fixation de la grande sous-unité permet au ribosome ainsi constitué de débuter la synthèse protéique.
L’élongation
L’élongation correspond à un allongement de la chaîne polypeptidique par ajout d’acides aminés apportés au ribosome en cours de traduction par les aminoacyl ARNt. Le processus d’élongation se fait de manière cyclique (Kapp and Lorsch, 2004). Au début de chaque cycle, le site A ribosomique est vide, le site P est occupé par l’ARNt chargé de la chaîne polypeptidique en cours de synthèse et le site E par l’ARNt déchargé. Un aminoacyl-ARNt est apporté au site A par le facteur d’élongation eEF1A lié au GTP. Le complexe eEF1A-GTP-aminoacyl-ARNt se place donc au site A. Il se produit un appariement entre le codon placé au site A du ribosome et la boucle anticodon de l’ARNt correspondant. Cette première étape est suivie d’une activation du centre peptidyl-transférase du ribosome. La chaîne polypeptidique portée par l’ARNt au site P est alors transférée sur l’acide aminé porté par l’ARNt au site A grâce à l’établissement d’une liaison peptidique dont la formation est catalysée par l’ARN ribosomique du centre peptidyl-transférase. La translocation de l’ARNt à l’intérieur du ribosome est alors amorcée. Ainsi l’ARNt déchargé de la chaîne peptidique est transféré du site P vers le site E du ribosome et l’ARNt chargé de la chaîne néosynthétisée est transféré du site A vers le site P, laissant libre le site A pour l’arrivée d’un nouvel aminoacyl-ARNt. Un nouveau cycle d’élongation peut ainsi se mettre en place et ce, jusqu’à ce qu’un codon stop soit rencontré.
La terminaison
Mécanisme général
La traduction s’achève lorsqu’un des trois codons stop, UAA, UAG ou UGA, entre au site A du ribosome. Chez les eucaryotes, la terminaison de la traduction est assurée par le facteur eRF1 et son partenaire eRF3. Les deux facteurs, eRF1 et eRF3 s’associent en un complexe qui se fixe au site A du ribosome. Le facteur eRF1 reconnaît les trois codons stop et active le centre peptidyltransférase du ribosome. Celui-ci catalyse l’hydrolyse de la liaison ester entre la chaîne polypeptidique et l’ARNt du peptidyl-ARNt fixé au site P du ribosome, libérant ainsi la chaine polypeptidique néosynthétisée (Frolova et al., 1994). Après cette étape, le ribosome 80S reste fixé à l’ARNm, avec un ARNt dans le site P et le facteur eRF1 dans le site A. Le facteur eRF1 doit alors être relâché du ribosome et le ribosome lui-même doit être dissocié afin de permettre un nouveau cycle de traduction. Un modèle proposé par Pisarev et coll. en 2010 montre que le recyclage du ribosome est médié par le complexe ABCE1 (Pisarev et al., 2010) ; Revue dans (Jackson et al., 2012). Le complexe ABCE1, une ATPase membre de la famille des protéines ‘ATP-binding cassette’ (ABC) vient s’associer au facteur eRF1 pour permettre la dissociation des sous unités ribosomiques (Figure 2).
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Table des matières
Introduction
Chapitre I : La traduction des ARN messagers
I. L’ARN messager
II. La traduction des ARN messagers
II.1. Les étapes de la traduction chez les eucaryotes
II.1.1. L’initiation
II.1.2. L’élongation
II.1.3. La terminaison
II.1.3.1. Mécanisme général
II.1.3.2. Le facteur de terminaison de la traduction eRF1
II.2. Le facteur de terminaison de la traduction eRF3
II.2.1. Historique de l’identification d’eRF3
II.2.2. Structure du facteur eRF3
II.2.3. Mécanisme d’action d’eRF3 dans la terminaison de la traduction
Chapitre II : Le facteur eRF3 en dehors de la terminaison de la traduction
I. Les gènes GSPT1 et GSPT2 humains
II. Les formes alléliques d’eRF3a
III. La traduction et le cancer
III.1. La susceptibilité génétique au cancer
III.2. Le cancer et la machinerie de la traduction
III.3. Le facteur eRF3a et le cancer
III.4. Rôle d’eRF3 dans l’apoptose
Chapitre III : La régulation de la stabilité de l’ARN messager
I. La protéine d’interaction à la queue Poly(A) : PABP
I.1. Identification de PABP
I.2. Structure et fonction de PABP
I.2.1. Les domaines RRMs de PABP
I.2.2. La région « linker » de PABP
I.3. Rôles de PABP
I.3.1. Rôle dans la polyadénylation de l’ARNm
I.3.2. Rôle dans la traduction
II. Stabilité et dégradation de l’ARNm
II.1. La dégradation par la voie de dégradation désadénylation-dépendante
II.1.1. L’étape limitante de la dégradation : la désadénylation
II.1.2. Les complexes de désadénylation PAN2-PAN3 et CCR4- NOT
II.2. Le mécanisme général de dégradation des ARNm normaux
II.3. La dégradation par miRNA
II.4. La dégradation par la voie NMD
Chapitre IV : L’interaction eRF3-PABP et son implication dans la régulation de la stabilité des ARNm
I. L’interaction eRF3-PABP
I.1. Identification de l’interaction eRF3-PABP
I.2. L’interaction MLLE-PAM2
I.2.1. La reconnaissance PAM2-MLLE
I.2.2. La stœchiométrie de l’interaction PABP-eRF3
II. Le motif PAM2 dans d’autres protéines
III. L’interaction MLLE de PABP et PAM2 d’eRF3 et la stabilité des ARN messagers
IV. L’interaction eRF3-Pab1 chez la levure S. cerevisiae
V. Rôle des deux motifs PAM2 d’eRF3
Conclusion
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