Soutenance mémoire
LA THERAPIE GENIQUE
LA THERAPIE GENIQUE CHEZ L’HOMME ET LES MODELES ANIMAUX CLASSIQUES
Le degré de connaissance en génétique canine ne cesse d’augmenter. Les gènes responsables de nombreuses maladies et caractères chez les animaux de compagnie sont maintenant répertoriés [9]. Ces percées génétiques ne sont pas uniquement susceptibles de jouer un rôle dans le diagnostic et la prévention de maladies, passant par une conduite d’élevage sélective; elles précèdent aussi la mise en oeuvre de thérapies géniques cliniquement réalisables. Après avoir défini les principes généraux de la thérapie génique, nous ferons un état des lieux de l’utilisation de cette technique dans le domaine de la recherche humaine et canine afin de traduire l’ampleur de son avancée. Enfin, nous considèrerons les problèmes rencontrés par la thérapie génique en tant que technologie intervenant sur des gènes, en abordant les interrogations suscitées mais également la réglementation qui la régit.
Qu’est-ce que la thérapie génique? La thérapie génique est une stratégie thérapeutique qui consiste à faire pénétrer de l’ADN dans les cellules ou les tissus d’un individu, pour traiter ou prévenir une maladie. Elle vise à remplacer ou complémenter un allèle mutant défectueux par un allèle fonctionnel, ou à sur exprimer une protéine dont l’activité aurait un impact thérapeutique. Actuellement, le terme de thérapie génique regroupe donc les thérapeutiques biotechnologiques visant à réparer une anomalie de l’ADN ou faisant exprimer une protéine thérapeutique [27].
Les débuts de la thérapie génique Le concept de thérapie génique, en tant que réparation ou modification du patrimoine génétique pour traiter une maladie, est réellement évoqué par la communauté scientifique à la fin des années 1960 [71]. Malgré la présence de ces réflexions théoriques, le niveau technologique ne permet pas encore de réaliser pratiquement ce projet. La thérapie génique est réellement née des progrès extraordinaires qu’a connus la génétique depuis les années 1970. A cette époque sont apparus les premiers outils du « génie génétique »: enzymes de restriction, sondes et clonage moléculaire, grâce auxquels le génome des organismes supérieurs (les eucaryotes), y compris celui de l’Homme, devenait enfin accessible à une analyse détaillée [44]. L’amélioration des connaissances concernant les liens entre certains gènes mutés et certaines maladies, la création de systèmes de transfert de gènes à partir de virus sécurisés, l’amélioration des technologies de manipulation de l’ADN (toutes ces avancées sont aujourd’hui regroupées sous le terme de biotechnologie) ont permis la réalisation du premier essai clinique (figure 1) initié par S.Rosenberg, F.Anderson et M.Blaese, aux USA, à la fin des années 1980: un essai de thérapie génique sur une petite Américaine de quatre ans, atteinte d’une maladie génétique qui provoquait un effondrement total de ses défenses immunitaires.
Cette déficience, due à l’absence d’une enzyme, l’adénosine désaminase ou ADA, nécessitait le maintien de l’enfant dans un environnement totalement stérile, en attendant une greffe de moelle ou, comme ce fut le cas, une greffe génétique. Cette petite fille reçut une greffe de ses propres lymphocytes T dans lesquels avait été introduit le gène permettant de produire l’enzyme dont elle était dépourvue. La modification génétique de ses lymphocytes fut effectuée au moyen d’un vecteur rétroviral exprimant le gène ADA. Le fait d’injecter à la fillette ses propres lymphocytes T a permis d’écarter les soucis de rejets de greffe. Cependant, l’expression du gène transféré s’est montrée très fugace, et des injections répétées étaient nécessaires.
Cette percée a permis le développement d’une kyrielle d’essais cliniques dès les années 1990 pour des maladies aussi diverses que le cancer, les maladies cardio-vasculaires, les infections virales, les immunodéficiences héréditaires… [57, 5]. Ces approches innovantes sont apparues alors comme une nouvelle étape fondamentale dans l’histoire de la médecine. En effet, elles permettaient d’envisager de traiter directement les causes de la maladie plutôt que de s’attaquer seulement aux symptômes. Ces avancées se sont associées à un engouement majeur du public et des investisseurs pour les biotechnologies au début du XXIè siècle, notamment grâce au Téléthon. Néanmoins, face à des industriels et des patients avides de résultats positifs immédiats, et desservie par une communication faisant peu la part des choses entre la réalité du terrain et les hypothèses, la thérapie génique s’est rapidement confrontée à un constat d’échec; en effet, aucun bénéfice réel n’a été observé pour les quelques 4000 patients jusque là enrôlés dans les essais. Cela a inévitablement conduit les capitauxrisqueurs à se désengager du projet et la thérapie génique a du amorcer son entrée dans le XXIè siècle accompagnée de la méfiance de beaucoup concernant son réel potentiel en génétique médicale.
La première réussite C’est en décembre 1999 qu’est survenu le premier succès probant, par l’équipe du professeur Alain Fisher de l’unité INSERM U429 de l’hôpital Necker à Paris, sur des enfants atteints d’un déficit immunitaire grave [27]. Ces « enfants bulles », c’est-à-dire touchés par le « déficit immunitaire combiné sévère lié au chromosome X » (DICS), ne devaient être en contact avec le moindre antigène car leur organisme était incapable de résister aux infections, mêmes légères, dues aux divers agents pathogènes, bactéries et virus, présents dans l’environnement normal; c’est pourquoi ils étaient confinés dans des enceintes hospitalières sous atmosphère stérile. Dans cette maladie héréditaire touchant exclusivement les garçons et concernant environ un garçon sur 300 000, les lymphocytes T et les cellules NK (Natural Killer) ne sont pas produits car leurs cellules souches, dépourvues des récepteurs pour deux cytokines (ces récepteurs sont appelés gamma c, ou yc), sont incapables de se différencier et de se multiplier (figure 2). La maladie est létale durant la première année de vie en l’absence de greffe de moelle osseuse allogénique [25].
Thérapie génique somatique ou germinale ? Dans cette étude ne sera abordée que la thérapie génique somatique, où il s’agit de traiter un malade par un médicament qui est ici un gène, ou encore de corriger la mutation d’un gène dans le tissu atteint, sans modifier d’aucune manière l’hérédité de ce malade. Cette thérapie génique somatique s’oppose à la thérapie génique germinale, où le nouveau gène se retrouve dans toutes les cellules de l’organisme, notamment dans les gamètes ; il sera donc transmissible à la descendance comme un nouveau caractère génétique. La thérapie génique germinale n’est réalisée à ce jour que chez l’animal. Par transfert d’un gène thérapeutique dans des embryons unicellulaires, celui-ci se retrouve dans toutes les cellules de l’organisme issu de cet embryon, notamment dans les gamètes, et il sera donc transmis à la descendance comme un nouveau caractère génétique. Une telle méthode n’aurait, dans l’immense majorité des cas, pas d’indication thérapeutique chez l’Homme.
En effet, il faudrait, pour ce faire, disposer des embryons unicellulaires, tels qu’ils sont obtenus aujourd’hui, en plusieurs exemplaires, par fécondation in vitro. Ensuite, dans le cas d’un couple risquant d’avoir un enfant atteint, il faudrait faire un diagnostic des embryons normaux et de ceux possédant l’anomalie, grâce à des méthodes réunies sous le terme de « diagnostic pré-implantatoire ». Cependant, la réalisation d’un tel diagnostic conduirait évidemment à écarter les embryons destinés à donner naissance à un enfant malade et à ne transférer dans l’utérus maternel que les embryons indemnes, c’est-à-dire aboutirait à un tri d’embryons et non pas à une tentative incertaine de thérapie génique. Le débat sur la légitimité éventuelle de la thérapie génique germinale est constant parmi les scientifiques. En l’absence d’indication thérapeutique réelle à ce jour, il apparait que ce terme recouvre plus « l’amélioration génétique » que le traitement germinal d’une maladie, ce qui soulève naturellement de toutes autres questions morales et éthiques.
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Table des matières
TABLE DES FIGURES
TABLE DES TABLEAUX
TABLE DES ABREVIATIONS
INTRODUCTION
I – LA THERAPIE GENIQUE CHEZ l’HOMME ET LES MODELES ANIMAUX CLASSIQUES
A – Qu’est-ce que la thérapie génique
1 – Historique
a – Les débuts de la thérapie génique
b – La première réussite
2 – Les aspects techniques de la thérapie génique
a – Définition
b – Thérapie génique somatique ou germinale
c – Les vecteurs de la thérapie génique
B.Vecteurs viraux
– Vecteurs adénoviraux
– Vecteurs rétroviraux
– Vecteurs dérivés de l’AAV
– Vecteurs herpesviraux
– Vecteurs chimériques
C.Vecteurs non viraux
Les méthodes physiques: éléctroporation et injection sans aiguille
d – Administration du vecteur
La thérapie génique ex vivo
La thérapie génique in vivo
La thérapie génique in situ
3 – Des stratégies sans limites
a – Les maladies génétiques candidates à la thérapie génique
b – Le cancer, une maladie à la génétique complexe
c – Thérapie génique des maladies virales
d – Gène vaccin
e – Thérapie génique et diverses maladies acquises
B – Les modèles animaux en thérapie génique
1 – La Souris : intérêt et limites
2 – Autres modèles animaux
a – Le modèle félin
b – Le modèle équin
c – Le modèle bovin
d – Le modèle porcin
e – Le modèle singe
C – La thérapie génique chez l’Homme
1 – La thérapie génique humaine en 2007
a – Répartition des essais cliniques selon les continents
b – Les maladies à l’étude
c – Les vecteurs de thérapie génique
d – Les gènes transferés
e – Evolution du nombre d’essais cliniques de 1987 à 2007
f – Les phases des essais cliniques actuels
Etude de phase I
Etude de phase II
Etude de phase III
Etude de phase IV
2 – La thérapie génique: problèmes éthiques et législation
a – Thérapie génique: problèmes éthiques, sociologiques et financiers
b – Aspects législatifs et réglementaires de la thérapie génique
b1 – La réglementation française
Procédure d’autorisation d’un essai clinique de thérapie génique
Réglementation française des produits de thérapie génique
b2 – Les législations aux Etats-Unis et en Europe
En Europe
Aux Etats-Unis
II – LE MODELE CANIN EN THERAPIE GENIQUE
A – Données récentes de génétique canine
1 – Origine des canidés et diversité génétique
2 – Les maladies génétiques chez le Chien
3 – Les différents modes de transmission des maladies génétiques
a – Hérédité mendélienne et hérédité multifactorielle
b – Transmission autosomique récessive
c – Transmission autosomique dominante
d – Transmission liée à l’X
e – Le mode de transmission maternel
4 – Connaissance du génome canin
B – Données de physiologie canine
1 – Développement embryonnaire
a – Premières étapes de l’évolution du zygote après la fécondation
b – Formation des organes et conséquences sur les malformations
2 – Les différents stades de la vie post natale du Chien
a – La période néonatale
b – La période de transition
c – La période de socialisation
d – La période juvénile
3 – Physiologie neuromusculaire et organes des sens
a – Les muscles chez le Chien
b – Organes des sens
4 – Le système immunitaire du Chien
a – Introduction
b – Les cellules de l’immunité
La lignée lymphoïde
La lignée myéloïde
c – Autres agent
Le complément
Les anticorps
d – Immunité à médiation humorale
La réponse anticorps
Les mécanismes de la réponse anticorps
e – Immunité à médiation cellulaire
Activation des LTc
Rôle central des macrophages
f – La réaction immunitaire lors d’une infection virale
C – Particularités et pertinence du modèle canin en thérapie génique
1 – Nécessité d’un modèle intermédiaire
2 – Entretien du Chien en animalerie
a – L’alimentation
b – Choix de la race
c – Logement
d – Hygiène
3 – Médecine et chirurgie du Chien
D – Les essais de thérapie génique chez le Chien
1 – Historique et premier succès
2 – Essais en cours, en France et dans le monde
III – ILLUSTRATIONS DE L’INTERÊT DU MODELE CANIN EN THERAPIE GENIQUE
A – La dystrophie de l’épithelium pigmentaire rétinien chez le Briard
1 – Historique de la maladie
2 – La maladie génétique chez l’Homme et chez le Briard
a – Déterminisme génétique
b – Signes cliniques et lésions associés
3 – Pourquoi espérer de la thérapie génique
4 – La thérapie génique chez le Briard, de ses débuts à aujourd’hui
a – Etude phénotypique détaillée de la RPED
b – Analyse moléculaire de la RPED
c – Premier essai de thérapie génique
d – Le Chien, un modèle pour la thérapie de la RPED
B – La myopathie de Duchenne chez le Golden Retriever
1 – La dystrophine
a – Structure et fonctions de la cellule musculaire
Organisation cellulaire
L’environnement de la cellule musculaire
La croissance du muscle après la naissance
b – Le gène de la dystrophine et ses produits
c – Rôles de la dystrophine
2 – La dystrophie musculaire de Duchenne chez l’Homme
a – Origines et transmission de la maladie
b – Présentations clinique et histologique succintes de la DMD
3 – La dystrophie musculaire de Duchenne chez le Chien GRMD
a – Historique et origine de la maladie
b – Présentations clinique et lésionnelle de la myopathie de Duchenne chez le Chien GRMD
4 – Le Chien Golden Retriever, un modèle parfait pour la myopathie de Duchenne chez l’Homme
a – Comparaison clinique homme/chien
b – Utilité du modèle GRMD
Le Chien myopathe, un animal difficile à élever au sein d’une colonie
Le Golden Retriever se prête bien aux expérimentations
5 – Myopathie de Duchenne et thérapie génique chez le Golden Retriever: état des lieux et perspectives
a – Utilisation de la thérapie génique chez le Chien GRMD: état des lieux
Utilisation de vecteurs viraux
– Utilisation des herpesvirus simplex
– Utilisation des rétrovirus
– Utilisation des adénovirus
– Utilisation des virus associés aux adénovirus
Les problèmes rencontrés
– Les effets toxiques des virus et leur pouvoir immunogène
– La voie d’administration
– La quantité de dystrophine nécessaire et sa répartition
– Objectiver une réussite de thérapie génique
– La durée d’expression du gène introdui
Myopathie de Duchenne et thérapie génique : état des lieux
– Chez le modèle canin
– Chez l’Homme
b – Les nouvelles pistes de recherche
L’utilisation d’oligonucléotides d’ADN/ARN
Le saut d’exon
La thérapie cellulaire
La thérapie pharmacologique
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE
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