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La peau : physiologie, plaies et cicatrisation
La peau : structure et fonction
La peau est considérée comme l’organe le plus étendu et le plus lourd du corps humain. Chez une personne adulte, la surface de la peau est en moyenne de 2 mètres carrés pour une masse avoisinant les 5 kilogrammes, ces valeurs variant suivant la taille et le poids des individus (Leider, The Journal of Investigative Dermatology, 1949). Cette enveloppe, première barrière protégeant l’organisme, est composée de trois couches avec de la plus superficielle à la plus profonde l’épiderme, le derme et l’hypoderme (Figure 1).
L’épiderme, couche la plus superficielle et la plus fine de la peau est responsable de l’imperméabilité et de la résistance de celle-ci. Cette enveloppe, dont l’épaisseur varie de 80 à 300µm, présente un épithélium stratifié composé de plusieurs couches cellulaires qui est considéré comme squameux avec des cellules en surface qui sont plates (Oltulu et al., Turkish Journal of Plastic Surgery, 2018). Parmi les différentes cellules composant l’épiderme, deux types présentent une importance particulière :
• Les kératinocytes, représentant 90 à 95% des cellules épidermiques. Elles sont responsables de la synthèse de kératine, protéine fibreuse et insoluble assurant l’imperméabilité de la peau.
• Les mélanocytes, produisant la mélanine responsable de la pigmentation de la peau et jouant un rôle de protection vis-à-vis des rayons ultraviolets.
L’épiderme est un tissu non vascularisé mais possédant de nombreuses terminaisons nerveuses. Il est recouvert de sébum, film hydrolipidique produit par les glandes sébacées du derme, assurant là aussi une fonction protectrice (Wickett et al., American Journal of Infection Control, 2006 ; Haake et al., The Biology of the skin, 2001 ; Kanitakis, European Journal of dermatology, 2002). Le derme est un tissu conjonctif environ 10 à 40 fois plus épais que l’épiderme. Ce tissu a la particularité d’être fortement vascularisé et innervé. Il est composé de fibroblastes, cellules spécialisées dans la synthèse de fibres de collagène ou d’élastine, composants principaux de la matrice extracellulaire (MEC) environnante. Le collagène confère des propriétés de résistance aux tensions et tractions exercées lors de mouvements et l’élastine, comme son nom l’indique, apporte des propriétés élastiques à la peau (Haake et al., The Biology of the skin, 2001 ; Daly, The Journal of Investigative Dermatology, 1982 ; Kanitakis, European Journal of dermatology, 2002). Le derme possède plusieurs fonctions essentielles au bon fonctionnement du corps humain telles que :
• Une fonction sensitive permettant la perception de notre environnement (vibrations, toucher, variations de températures…)
• Une fonction nutritive pour les tissus environnants grâce à sa forte vascularisation
• Une fonction thermorégulatrice
• Une fonction de détersion des plaies grâce aux glandes sudoripares.
Enfin, la couche la plus profonde de la peau ou hypoderme, est un tissu conjonctif lâche composé d’adipocytes, cellules spécialisées dans le stockage des triglycérides. À ce titre, il a un double rôle de stockage d’énergie et de protection thermique et mécanique (Kanitakis, European Journal of dermatology, 2002).
Grâce à cette structure, la peau possède plusieurs fonctions importantes telles que la protection des agressions extérieures, la régulation thermique, et la sensation de toucher
Au-delà de ces fonctions, la peau, comme la plupart des tissus de l’organisme, est renouvelée en permanence. Ce renouvellement concerne principalement la couche externe de la peau, où les cellules migrent de la couche inférieure de l’épiderme à la couche supérieure. En migrant, ces cellules se différencient et s’aplatissent pour finalement former la cornée ou couche supérieure de l’épiderme. Ce renouvellement prend en moyenne 45 jours, et les cellules en surface sont éliminées par un phénomène de desquamation. Outre ce phénomène physiologique, il peut arriver que la couche protectrice de notre organisme soit endommagée de manière plus ou moins importante : on parle alors de plaie.
Les plaies aiguës : renouvellement cutané physiologique
Une plaie est généralement considérée comme une perturbation locale, une interruption du revêtement cutané pouvant être due à une coupure ou une éraflure. Il existe plusieurs types de blessures, pouvant aller de la simple blessure superficielle n’affectant que l’épiderme à une blessure plus grave pouvant engager le pronostic vital de la personne atteinte. L’évolution de la plaie dépend généralement de son étendue et de sa gravité, mais peut également dépendre de facteurs locaux ou généraux pouvant influencer tout phénomène de guérison. Au-delà de la sévérité de la plaie, celle-ci peut également être catégorisée suivant sa durée de cicatrisation. En effet, une plaie qui suit une cicatrisation classique avec des étapes régulées amenant à la formation d’un tissu cicatriciel est définie comme plaie aiguë. Une plaie qui, quant à elle, présente une inflammation prolongée retardant tout phénomène de cicatrisation est considérée comme chronique.
Physiologie et cicatrisation des plaies aiguës
Les plaies aiguës sont des plaies dites « classiques » qui suivent une régulation précise amenant la formation d’un tissu cicatriciel. Cette cicatrisation comporte quatre phases, chacune présentant des caractéristiques physiologiques particulières.
L’hémostase
Cette première phase se met en place au moment où le tissu est lésé et comporte elle-même plusieurs étapes. Dans un premier temps, une vasoconstriction des vaisseaux sanguins présents au niveau du lit de la plaie apparait. Cette constriction des vaisseaux dure 15 à 60 secondes et a pour but de ralentir le saignement pour faciliter la mise en place de l’hémostase primaire. Durant cette étape, un clou plaquettaire est créé pour parer à tout saignement résiduel. L’étape suivante est la formation d’un réseau de fibrine, réseau servant à la fois de matrice pour le développement de fibroblastes mais aussi de protection contre les microorganismes pouvant entrainer une infection. Cette étape dite d’hémostase secondaire dure entre 3 et 5 minutes et permet au phénomène de coagulation de se mettre en place. La formation de ce réseau stimule la croissance de fibroblastes et de cellules de muscle lisse au sein de la paroi vasculaire, entamant le processus de réparation pour à terme entrainer la dissolution du caillot ou fibrinolyse. Le temps total de cette première étape d’hémostase peut aller de 1 à 3 jours (Brown et al., Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2018 ; Zhao et al., International Journal of Molecular Sciences, 2016).
L’inflammation
La deuxième phase du processus de cicatrisation permet l’élimination de corps étrangers et de tissus morts au niveau de la blessure. Elle débute grâce à la sécrétion de cytokines et de facteurs de croissance par les fibroblastes présents dans le lit de la plaie (Goldman, Advances in Skin & Wound Care, 2004). Parmi ces molécules pro-inflammatoires se trouvent des interleukines comme l’interleukine 1β ou encore le facteur de nécrose tumorale ou TNFα. Ces facteurs vont initier une réponse inflammatoire avec notamment la migration de neutrophiles. Par la suite, des monocytes vont être recrutés au niveau de la plaie et vont se différencier en macrophages. Ces cellules inflammatoires sont responsables des étapes de phagocytose, d’angiogenèse et de recrutement cellulaire pour le débridement et la formation d’une matrice extracellulaire provisoire au lit de la plaie (Zhao et al., International Journal of Molecular Sciences, 2016). En parallèle, elles contribuent au recrutement de molécules spécifiques telles que des enzymes lysosomales comme des lipases ou des protéases ou des espèces oxygénées participant au nettoyage de la plaie. D’un point de vue macroscopique, cette phase est caractérisée par l’apparition de signes spécifiques appelés signes cardinaux de l’inflammation. Ces signes comprennent le développement d’un œdème et d’un érythème au niveau de la plaie, une sensation de chaleur et ainsi qu’une douleur pulsatile (Medzhitov, Cell, 2010).
La prolifération / granulation
Cette troisième phase du processus de cicatrisation intervient 2 à 10 jours après apparition de la blessure, le but étant de restaurer une barrière épithéliale stable pour la formation d’un tissu cicatriciel. Suite à la phase inflammatoire, les macrophages et les neutrophiles sécrètent des cytokines et chimiokines afin d’amorcer le recrutement cellulaire au niveau de la lésion (Brown et al., Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2018). Au cours de cette prolifération cellulaire, le phénomène de granulation apparait. La granulation permet la formation d’un nouveau tissu conjonctif fortement vascularisé. Des fibroblastes sont activés par des facteurs de croissance pour la sécrétion de collagène et de fibrinogène afin de constituer une nouvelle matrice extracellulaire pour refermer la blessure, des angioblastes forment un nouveau réseau de capillaires et enfin des kératinocytes s’agrègent sur les bords de la plaie pour permettre l’épithélialisation du tissu (Gonzalez et al., Anais Brasileiros de Dermatologia, 2016).
Le remodelage / maturation
Le remodelage ou maturation est la phase la plus longue du phénomène de cicatrisation. Elle intervient deux à trois semaines après la blessure et peut durer jusqu’à un an. Pendant cette phase, la réponse immunitaire diminue progressivement, une réorganisation de la matrice extracellulaire et du tissu granulaire a lieu afin d’obtenir un tissu cicatriciel ayant une structure la plus proche possible du tissu d’origine, avec notamment une diminution de la vascularisation et une augmentation de la proportion de collagène (Han et Ceilley, Advanced Therapy, 2017). Certaines plaies ne suivent pas ce processus traditionnel de cicatrisation et sont en phase inflammatoire prolongée. Ces plaies sont dites chroniques. La prévalence de ce type de plaie a augmenté de manière alarmante ces dernières années, notamment à cause de l’augmentation du nombre de personnes diabétiques, facteur prédominant chez les personnes atteintes de plaies chroniques.
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
CHAPITRE 1- PLAIES ET CICATRISATION, PANSEMENT INTELLIGENT : CONTEXTE, ETAT DE L’ART.
PARTIE I – LA PEAU : PHYSIOLOGIE, PLAIES ET CICATRISATION
1.1/ LA PEAU : STRUCTURE ET FONCTION
1.2/ LES PLAIES AIGUËS : RENOUVELLEMENT CUTANE PHYSIOLOGIQUE Physiologie et cicatrisation des plaies aiguës
1.2.1- L’hémostase
1.2.2- L’inflammation
1.2.3- La prolifération / granulation
1.2.4- Le remodelage / maturation
1.3/LES PLAIES CHRONIQUES : RENOUVELLEMENT CUTANE COMPROMIS
1.3.1- Le diabète
1.3.2- Classification des plaies chroniques
1.3.2.1- Ulcères veineux/artériels
1.3.2.2- Les escarres.
1.3.2.3- Les plaies du pied diabétique
1.3.3- Physiopathologie des plaies chroniques
PARTIE II – LES METALLOPROTEASES MATRICIELLES
2.1/DESCRIPTION DE LA FAMILLE DES MMPS
2.2/STRUCTURE DES MMPS
2.3/FONCTIONS GENERALES DES MMPS
2.4/ACTIVATION ET REGULATION
2.5/INHIBITION: LES TIMPS (TISSUE INHIBITORS OF MMPS)
2.6/IMPLICATION DES MMPS DANS LES PLAIES CHRONIQUES
2.6.1- Les MMPs et la cicatrisation
2.6.2- Les MMPs dans les plaies chroniques
PARTIE III – LE PANSEMENT : DISPOSITIF MEDICAL POUR LE TRAITEMENT ET LA CICATRISATION DES PLAIES
3.1/NATURE, CLASSIFICATION ET APPLICATION DES PANSEMENTS
3.2/DISPOSITIFS PASSIFS PERMETTANT LE MAINTIEN DE LA PLAIE
3.3/DISPOSITIFS ACTIFS POUR LE SUIVI OU LA CICATRISATION DES PLAIES
3.3.1- Pansements bioactifs
3.3.1.1- Alginates
3.3.1.2- Collagène
3.3.1.3- Elastine
3.3.1.4- Acide hyaluronique
3.3.1.5- Chitosane
3.3.2- Pansements en voie de développement : pansements intelligents
3.3.2.1- Suivi des plaies chroniques : facteurs physiques
a) pH
b) Température
c) Humidité
3.3.2.2- Suivi des plaies chroniques : facteurs biochimiques
a) Oxygénation des plaies
b) Flore bactérienne
c) Acide urique
d) TNF
e) Metalloprotéases matricielles
OBJECTIF DE MON PROJET DE THESE
CHAPITRE 2-MATERIELS ET METHODES
PARTIE I – PRODUCTION ET CARACTERISATION DE LA MMP9 HUMAINE RECOMBINANTE
1.1/CONSTRUCTION D’UN BACULOVIRUS RECOMBINANT
1.2/PRODUCTION ET PURIFICATION DE LA MMP9 RECOMBINANTE
1.2.1- Purification sur colonne de ConA
1.2.2- Purification sur colonne NiNTA (HisTrap, GE HealthCare, 175255-01)
1.3/CARACTERISATION DE LA MMP9 RECOMBINANTE
1.3.1- Quantification par technique ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
1.3.2- Analyse de l’activité enzymatique par zymographie sur gel
a) Préparation des échantillons
b) Migration sur gel de polyacrylamide
c) Analyse et interprétation des résultats
1.3.3- Détection et identification par Western blot
a) Transfert sur membrane de nitrocellulose
b) Révélation
PARTIE II – UTILISATION DE LA TECHNIQUE DE PHAGE DISPLAY POUR LA SELECTION D’UN ERB
2.1/SELECTION DE L’ERB
2.1.1- Premier tour de « panning »
a) Préparation du premier tour
b) « Screening » des phages
2.1.2- Deuxième tour de « panning »
a) Amplification des phages sélectionnés au premier tour
b) Concentration
2.2/ANALYSE PAR ELISA DES PHAGES SELECTIONNES POUR LA CIBLE MMP9
2.3/EXTRACTION DE L’ADN DES CLONES SELECTIONNES VIA ELISA POUR SEQUENÇAGE
2.4/PRODUCTION DES ERB ISSUS DU PHAGE DISPLAY
2.4.1- Amplification du phagemide
2.4.2- Transfert du VHH dans le plasmide pET-22b
2.4.3- Production et purification des VHH
2.5/PREPARATION DE BACTERIES COMPETENTES, METHODE INOUE.
PARTIE III – ÉLABORATION DES SUPPORTS D’ALUMINE POREUSE POUR FONCTIONNALISATION
3.1/PREPARATION DES SUPPORTS FLEXIBLES D’AL2O3 PAR ANODISATION
3.1.1- Le pré-traitement
3.1.2- Le traitement
3.1.3- Le post-traitement
3.1.4- Le dépôt d’électrodes
3.2/LA FONCTIONNALISATION DES CAPTEURS CAPACITIFS
3.2.1- Avec l’anticorps conventionnel
a) Via adsorption
b) Via création de liaison covalente
3.2.2- Avec le VHH commercial
3.3/VALIDATION DE LA FONCTIONNALISATION DES
3.3.1- Tests biologiques
a) Avec l’anticorps conventionnel
b) Avec le VHH commercial
3.3.2- Tests d’imagerie
3.4/TESTS ELECTRIQUES
3.4.1- Mesures d’échantillons bruts
3.4.2- Mesures d’ajouts de molécule cible sur échantillons nus et fonctionnalisés : expériences de saturation : sensibilité du biocapteur
3.4.3- Mesures d’ajouts de sérum humain dopé sur échantillons nus et fonctionnalisés : spécificité du biocapteur
CONCLUSION GENERALE
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