Soutenance mémoire
La pathologie respiratoire porcine
Détection des agents pathogènes
Pour chacun des échantillons, 4 agents bactériens ont été recherchés par PCR : M.hyorhinis, M.hyopneumoniae, S.suis, H.parasuis. La méthode d’analyse a été développée par l’équipe de Corinne Marois (ANSES-‐laboratoire de Ploufragan-‐Plouzané)
Préparation des échantillons
La préparation des ADN a été réalisée à partir de 1mL de chacun des prélèvements (mucus trachéal et lavage trachéo-‐bronchique). Après une centrifugation de 15 min à 12000 g, le culot a été repris dans 400 µL de solution de lyse A (Tris HCL 10mM pH 8,3, KCl 100mM, MgCl2 2,5 mM) et 400 µL de solution de lyse B (Tris HCL 10mM pH 8,3, MgCl2 2,5 mM, tween 20 1%, Triton 1X, Nonidet 40 0,01%, Protéinase K 120 µg/mL). Après homogénéisation, les solutions obtenues ont été incubées 1 heure à 60°C (température d’activation de la Protéinase K) puis 15 min à 95°C (température d’inactivation de la protéinase K). Les matrices d’ADN ainsi obtenues ont été conservées à 4°C jusqu’à l’analyse par PCR puis à -‐20°C. Dans les cas où le contrôle interne d’amplification s’est révélé négatif, les ADN ont été purifiés sur membrane de silice (Qiagen®, Courtaboeuf, France).
Détection de M. hyorhinis par PCR quantitative
La sérologie n’ayant été développée pour M.hyorhinis, le diagnostic a du forcément être direct. Actuellement, trois méthodes permettent de détecter la présence de M.hyorhinis par PCR : -‐ Stemke et al. (1994), ont effectué une étude de différenciation de M. hyorhinis, M.hyopneumoniae et M.flocculare par PCR ayant comme cible l’ADNr 16S ; -‐ Caron et al. (2000) ont utilisé la souche de M.hyorhinis ATCC 17981 (disponible sur GenBank avec l’accession D16682) pour définir un couple d’amorce ayant pour cible le gène codant la protéine P37, spécifique de l’espèce M.hyorhinis ; -‐ Stakenborg et al. (2006) ont développé une PCR multiplex, détectant M.hyorhinis, M.hyopneumoniae et M.flocculare et ayant pour cibles des séquences d’ADNr16S. Un test PCR en temps réel « TaqMan » a été récemment développée à l’ANSES (test non publié) et utilisé pour cette étude. Les sondes marquées et les amorces ont été définies sur le gène p37, à l’aide du logiciel « Beacon Designer Real-‐time PCR Primer/ Probe Design Software » (BioRad, Marnes la Coquette, France). La spécificité analytique a été validée via l’analyse de différentes espèces bactériennes : des mycoplasmes porcins (M.hyorhinis, M.hyopneumoniae, M.flocculare, M.hyopharyngis…), des mycoplasmes provenant d’autres espèces animales (M. gallisepticum, M.synoviae, M.bovis), ainsi que des bactéries provenant de la même niche écologique que M.hyorhinis (voies respiratoires et séreuses des porcs : H.parasuis, S.suis, Actinobacillus pleuropneumoniae…). Le seuil de détection du test a été évalué à partir d’une suspension de M.hyorhinis (souche de référence), de concentration connue, diluée de raison 10. Il s’est révélé être environ 10 fois inférieur à celui des tests PCR « conventionnelles » soit environ 200 équivalents génomes/µL (1×103 équivalents génomes/tube). Un échantillon a été considéré positif lorsque la quantité d’ADN détecté a été supérieure ou égale au dernier point de la gamme (soit environ 200 fg/µL).` Le mélange réactionnel de la PCR Temps Réel contenait du tampon iQ Supermix (KCl 50 mM ; Tris-‐HCl 20 mM, MgCl2 3 mM [pH 8,4], 800 µM de chacun des désoxyribonucléotides triphosphates (dNTP), 0,625 unités de Taq polymérase, stabilisateurs) (Biorad), 500 nM de chaque amorce, 300 nM de sonde TaqMan et 5 µL de matrice. La réaction d’amplification comportait une dénaturation initiale de 3min à 95°C et 35 cycles comprenant chacun une dénaturation de 15 s à 95°C et une hybridation/élongation de 1 min à 65°C. L’appareil Chromo4 (BioRad) a été programmé en mesure de fluorescence « Fam ».
Détection de S. suis par PCR quantitative
Le test QPCR utilisé a été développé dans le cadre d’une étude descriptive intitulée « Infection à Streptococcus suis : un danger pour les personnels de la filière porcine ? ». Un contrôle interne d’amplification est inclus dans ce test PCR afin d’éviter les résultats faussement négatifs induits par des inhibiteurs de PCR éventuellement présents dans les échantillons (polysaccharide, protéine…). Le seuil de détection pour l’amplification de l’espèce S.suis est de 50 équivalents génomes /µL. Le mélange réactionnel de la PCR en temps réel simplex contenait du tampon iQ Supermix (KCl 50 mM ; Tris-‐HCl 20 mM, MgCl2 3 mM [pH 8,4], 800 µM de chacun des désoxyribonucléotides triphosphates (dNTP), 0,625 unités de Taq polymérase, stabilisateurs) (BioRad, Marne la Coquette, France), 400 nM de chaque amorce (Ssuis-‐16S-‐RT-‐F5 / Ssuis-‐16S-‐ RT-‐R5), 300 nM de sonde (Sonde-‐Ssuis-‐16S-‐5), 0,25X de contrôle interne « TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents » (Applied Biosystem, Courtaboeuf, France) et 5 µL de matrice d’ADN (Volume final : 25 µL). La réaction d’amplification a été effectuée à l’aide de l’appareil Chromo4 (Biorad) et comportait une dénaturation initiale de 3 min à 95°C et 35 cycles comprenant chacun une dénaturation de 15 s à 95°C et une hybridation/élongation de 1 min à 65°C. L’appareil Chromo4 a été programmé en mesure de fluorescence « FAM » (Biorad). Le seuil de fluorescence a été fixé à 0,15.
Détection de M. hyopneumoniae par PCR quantitative
Le mélange réactionnel de la PCR en temps réel « M.hyopneumoniae » contenait du tampon iQ Supermix (KCl 50 mM ; Tris-‐HCl 20 mM, MgCl2 3 mM [pH 8,4], 800 µM de chacun des désoxyribonucléotides triphosphates (dNTP), 0,625 unités de Taq polymérase, stabilisateurs) (BioRad, Marne la Coquette, France), 500 nM de chaque amorce (Mhp-‐P102-‐as/ Mhp-‐P102-‐s), 300 nM de sonde (Sonde-‐Mhp-‐P102) et 5 µL de matrice d’ADN (Volume final : 25 µL). La réaction d’amplification a été effectuée dans l’appareil Chromo4 (Biorad) et comportait une dénaturation initiale de 3 min à 95°C et 40 cycles comprenant chacun une dénaturation de 15 s à 95°C et une hybridation/élongation de 1 min à 65°C. L’appareil Chromo4 a été programmé en mesure de fluorescence « Cy5 » (Biorad). Le seuil de fluorescence a été fixé à 0,090. Le seuil de détection pour l’amplification de l’espèce M.hyopneumoniae est de 1,3 équivalents génomes/µL.
Detection de H.parasuis par PCR conventionnelle
H.parasuis a été detecté par PCR conventionnelle. Le mélange réactionnel de la PCR contenait du tampon (Tris-‐HCl 10 mM, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM [pH 8,3]), 240 µM de chacun des désoxyribonucléotides triphosphates (dNTP), 300 nM de chaque amorce HPS-‐f-‐USA et HPS-‐ r-‐USA, 0,5 unités de Taq polymérase (Roche), et 5 µL de matrice d’ADN. La réaction d’amplification a été réalisée dans l’appareil G-‐STORM et comportait 30 cycles comprenant chacun une dénaturation de 30 s à 94°C, une hybridation de 30 s à 59°C et une élongation de 2 min à 72°C. Les produits amplifiés ont été révélés par électrophorèse en gel d’agarose. 25 µL de produit ont été déposés sur un gel d’agarose à 2% et la migration a été réalisée dans du tampon TBE (Tris 90 mM, Acide borique 90 mM, EDTA 2,5 mM pH8) pendant 1h à 125 V. Le marqueur de taille moléculaire utilisé était le GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder Thermo scientific (Fermentas).Les bandes d’ADN ont été révélées dans une solution de GelRed (3X, NaCl 0,07M) (Interchim) et visualisées sur un transilluminateur à Ultra Violet (Vilbert Lourmat). La taille des fragments amplifiés a été évaluée à l’aide du logiciel Quantum afin de s’assurer que ce produit était bien celui attendu.
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Guide du mémoire de fin d’études avec la catégorie Les co-‐infections dans la pathologie respiratoire porcine |
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Table des matières
REMERCIEMENTS
TABLE DES ABREVIATIONS
TABLE DES ILLUSTRATIONS
INTRODUCTION
1. Etude bibliographique : Mycoplasma hyorhinis et la pathologie respiratoire en élevage porcin
1.1. La pathologie respiratoire porcine, une entité multifactorielle complexe
1.1.1. L’écosystème porcin, entre pression microbienne et capacité de défense de l’organisme
1.1.2. Facteurs de risque non infectieux
1.1.2.1. L’aire de vie
1.1.2.2. Températures et écarts de températures
1.1.2.3. Qualité de la ventilation
1.1.2.4. Qualité de l’air
1.1.2.5. Conduite hygiénique
1.1.2.6. Renouvellement du cheptel
1.1.2.7. Situation géographique de l’élevage
1.1.2.8. Autres facteurs de risque non infectieux
1.1.3. Facteurs de risque infectieux
1.1.3.1. Principaux agents responsables
1.1.3.2. Les entités respiratoires « classiques »
1.2. Les co-‐infections dans la pathologie respiratoire porcine
1.2.1. Classification des différents agents pathogènes respiratoires
1.2.1.1. Agents « primaires » et « secondaires » / « initiateurs » et « suiveurs »
1.2.1.2. Importance relative des principaux agents pathogènes respiratoires
1.2.2. Le PRDC
1.2.2.1. Définition
1.2.2.2. Epidémiologie
1.2.2.3. Mécanisme d’apparition
1.2.2.4. Facteurs impliqués dans le PRDC
1.2.2.5. Les co-‐infections dans le PRDC
1.2.2.6. Limites dans l’interprétation des résultats d’analyses sur poumons.
1.3. Mycoplasma hyorhinis : agent de polysérosite et de pneumonie ?
1.3.1. Etiologie
1.3.2. Epidémiologie
1.3.2.1. Localisation
1.3.2.2. Elevages cibles
1.3.2.3. Animaux cibles
1.3.2.4. Transmission
1.3.2.5. Prévalence
1.3.2.6. Dynamique de colonisation
1.3.2.7. Facteurs de risque de transmission
1.3.3. Pathogénie
1.3.3.1. Dissémination systémique
1.3.3.2. Interactions avec l’hôte
1.3.3.3. Pouvoir pathogène
1.3.3.4. Implication de M.hyorhinis dans la pathologie respiratoire
1.3.3.5. Facteurs favorisants
1.3.4. Signes cliniques
1.3.4.1. Symptômes
1.3.4.2. Lésions
1.3.5. Diagnostic
1.3.5.1. Diagnostic direct
1.3.5.2. Diagnostic indirect
1.3.5.3. Quand prélever ?
1.3.6. Les co-‐infections impliquant M.hyorhinis
1.3.6.1. Co-‐infection avec le SDRPv
1.3.6.2. Co-‐infection avec S.suis
1.3.6.3. Co-‐infection avec H.parasuis
1.3.6.4. Co-‐infection avec P.multocida
1.3.7. Traitement et vaccination
1.3.7.1. Sensibilité et résistance de M.hyorhinis aux traitements antibiotiques
1.3.7.2. Mise en place du traitement
1.3.7.3. Vaccination
1.3.8. Contrôle de l’infection à M.hyorhinis
2. Etude comparée de la fréquence d’isolement de Mycoplasma hyorhinis en élevage porcin dans l’ouest de la France
1.1. Contexte de l’étude expérimentale
1.1.1. Point de départ de l’étude
1.1.2. Position actuelle des vétérinaires face à M.hyorhinis
1.1.3. Objectifs et principes de l’étude
2.2. Matériel et méthodes
2.2.1. Matériel
2.2.1.1. Répartition géographique des élevages inclus dans l’étude
2.2.1.2. Description des élevages « cas » et des troubles sanitaires
2.2.1.3. Description des élevages « témoins » et des troubles sanitaires
2.2.1.4. Les animaux
2.2.2. Méthodes
2.2.2.1. Protocole expérimental
2.2.2.2. Techniques de prélèvement
2.2.2.3. Traitement statistique des données
2.2.2.4. Détection des agents pathogènes
2.3. Résultats
2.3.1. Etude de la fréquence d’isolement de M.hyorhinis en élevages porcins
2.3.1.1. Fréquence d’isolement de M.hyorhinis dans les élevages étudiés
2.3.1.2. Comparaison des fréquences d’isolement globales entre animaux cliniques et animaux non cliniques
2.3.1.3. Comparaison des fréquences d’isolement entre animaux cliniques et animaux non cliniques dans les élevages cas
2.3.2. Etude des co-‐infections impliquant M.hyorhinis
2.3.2.1. Etude globale des co-‐infections impliquant M.hyorhinis
2.3.2.2. Etude comparée des co-‐infections impliquant M.hyorhinis entre élevages « cas » et élevages « témoins »
2.3.2.3. Les co-‐infections impliquant M.hyorhinis chez les animaux présentant des signes cliniques
2.4. Discussion
2.4.1. Choix des élevages et des animaux
2.4.1.1. Choix des élevages
2.4.1.2. Sélection des animaux
2.4.2. Limites dans l’interprétation des résultats
2.4.2.1. Techniques de prélèvements et interprétation des résultats
2.4.2.2. Confirmation des résultats
2.4.3. Comparaison des fréquences d’isolement des quatre agents étudiés
2.4.3.1. Fréquences d’isolement globales
2.4.3.2. Interprétation des isolements bactériens sur la santé respiratoire
2.4.4. Implication de M.hyorhinis dans les co-‐infections et dans le PRDC
2.4.5. Contribution sur la dynamique d’infection de M.hyorhinis
2.4.6. Méthodes d’évaluation de la santé respiratoire du porc
2.4.7. Choix de la technique de prélèvement
2.4.7.1. Réalisation pratique de l’acte
2.4.7.2. Réalisation du prélèvement et matériel prélevé
2.4.7.3. Sites de prélèvements
2.4.7.4. Contamination des prélèvements
2.4.7.5. Sensibilité et spécificité des deux techniques de prélèvements
CONCLUSION
ANNEXE 1 : Rappels anatomiques et fonctionnels de l’appareil respiratoire des porcs
ANNEXE 2 : Enjeux de la pathologie respiratoire en élevage porcin
ANNEXE 3 : Principales entités cliniques respiratoires du porc
ANNEXE 4 : Principe de la PCR
ANNEXE 5 : Résultats des analyses PCR des élevages « cas »
ANNEXE 6 : Résultats des analyses des élevages « témoins »
ANNEXE 7 : Comparaison des méthodes de prélèvement -‐ lavage trachéo-‐bronchique VS écouvillon trachéo-‐bronchique
ANNEXE 8 : Evaluation of the performances of two sampling methods for qPCR detection of mycoplasmas in
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