La mitochondrie, potentiel marqueur précoce de l’altération ?

Les situations mondiale et française des pêches et de l’aquaculture

  Sur 33 200 espèces de poisson recensées, seulement 700 espèces sont destinées à des fins alimentaires et à la production alimentaire soit seulement 2%. Afin de mieux comprendre l’intérêt de développer de nouvelles méthodes de détermination de la fraîcheur du poisson, il est important d’avoir une vue d’ensemble sur la consommation, l’importation, l’exportation, l’aquaculture et la réglementation liée à l’étiquetage de produits aquatiques. Tous les deux ans, l’Organisation des Nations Unies pour l’alimentation et l’agriculture (en anglais : « Food and Agriculture Organization of the United Nations ») publie un rapport détaillé sur la situation mondiale des pêches et de l’aquaculture (FAO, (2016)). A l’échelle nationale, l’établissement FranceAgrimer dresse tous les ans, dans un rapport détaillé, un bilan sur la consommation des produits de la pêche et de l’aquaculture en France (FranceAgrimer, (2017)). Les données récoltées par la FAO et FranceAgrimer sont donc précieuses pour dresser la situation de la consommation, de l’importation, de l’exportation et de l’aquaculture des produits aquatiques aux échelles mondiale et nationale.

Réglementation européenne concernant l’étiquetage des produits de la mer et d’eau douce

   La Direction générale de la concurrence, de la consommation et de la répression des fraudes (DGCCRF) nous permet de prendre connaissance des règles applicables à l’étiquetage des produits de la mer et de l’aquaculture, dont les poissons. Ces règles sont répertoriées dans le règlement européen n°Règlement UE 1379, (2013) . On y apprend que le consommateur final doit être informé à propos du produit non transformé comme le filet de poisson de la dénomination commerciale, du nom scientifique de l’espèce, de la méthode de production (pêché, pêche en eau douce ou élevé) avec la catégorie de l’engin de pêche (senne, chalut, filet maillant), de la zone de pêche ou du pays d’élevage et enfin de son état décongelé si c’est le cas. Ces informations citées sont les seules obligatoires. A ce jour, la date de capture et la date de débarquement sont des informations facultatives, donc non obligatoires. Dans la grande majorité des cas, les dates de capture et de débarquement ne sont pas indiquées au consommateur. Ce dernier n’est donc pas informé du temps qui s’est écoulé depuis la mort du poisson. Ce manque d’information (facultative) perturbe ainsi l’appréciation de la fraîcheur d’un poisson pour un public essentiellement composé de consommateurs non formés à l’évaluation organoleptique d’un produit aquatique. La tâche est d’autant plus compliquée lorsqu’il s’agit d’un filet.

Les aspects biologiques du poisson

Classification Classiquement, est considéré comme du poisson tout organisme vivant vertébré aquatique utilisant des branchies pour respirer et possédant des nageoires locomotrices. Cette définition est présente dans bon nombre d’ouvrages et dictionnaires. En 2017, d’après la base de données FishBase, 33 200 espèces de poissons sont recensées, soit l’un des plus gros groupes d’espèces du règne animal. Les différentes espèces de poisson peuvent être classées suivant de nombreux critères tels que leur habitat : eau marine ou eau douce ou poisson de fond (benthiques) ou poisson pélagique (nageant près de la surface de l’eau). Ils sont également classés suivant leur composition : poissons osseux (Ostéichtyens) ou cartilagineux (Chondrichtyens) comme les requins et raies (Raja spp.) principalement. Il y a également trois classes de poissons selon la teneur en lipides : poisson maigres (exemple : daurade royale) (moins de 5% de lipides), poissons mi-gras (exemple : bar (Dicentrarchus labrax)) (entre 5 et 10 % de lipides) et poissons gras (exemples : saumon, thon) (entre 10 et 15 % de lipides). Ces contenus en matières grasses sont très dépendants de l’espèce et du niveau de maturité du poisson. Enfin, leur catégorisation peut dépendre de leur forme générale : les poissons plats (raie) et les poissons ronds (daurade royale).
Anatomie Le poisson est un animal vertébré. Par conséquent, il possède une colonne vertébrale qui s’étend de la tête jusqu’à la nageoire caudale. Les vertèbres constituant la colonne vertébrale portent des côtes appelées communément arrêtes composées de structure osseuse ou cartilagineuse. La masse musculaire représente environ 35 à 60 % du poids total chez le poisson. Elle est composée à 90% de fibres musculaires et de 10 % de tissus adipeux et conjonctifs (Listrat et al., (2016)) La masse musculaire du poisson est présente des deux côtés du poisson et constitue le filet. Chez le poisson, il n’y pas de système tendineux pour assurer l’attache du muscle au squelette. Le muscle est composé de longs faisceaux de cellules musculaires appelés myotomes ou myomères disposés parallèlement dans le sens longitudinal du poisson, autrement dit de façon perpendiculaire à la colonne vertébrale. Chaque faisceau est relié et délimité par des gaines de tissu conjonctif appelées myocommes ou myoseptes qui sont accrochées au squelette et à la peau (Bremner et Hallett, (1985)). Ainsi, le myocomme permet d’établir un lien entre le muscle, le squelette et la peau. Son rôle consiste également à assurer la transmission des forces de contraction fibrillaire d’un myomère à l’autre ainsi qu’au squelette et à la peau. Cette disposition parallèle des myomères est en adéquation avec le mouvement d’ondulation nécessaire au déplacement du poisson .La musculature du poisson est la partie se trouvant sur les flancs du poisson, de la tête à laqueue. Elle est communément appelée filet. Cette zone est la partie majeure comestible du poisson. Selon l’espèce, la forme ou l’âge du poisson, le muscle représente 25 à 60 % du poids total de l’animal. Le muscle peut être divisé en deux types : le muscle blanc et le muscle rouge (appelé aussi muscle sombre, muscle brun). Listrat et al., (2016) évoquent également le muscle rose. Leur proportion varie selon les espèces et leur mode de vie. Le muscle blanc est impliqué dans les efforts soudains et rapides. Il est composé de fibres de type II. Il puise son énergie de la glycolyse anaérobie (voie glycolytique). Il est en général plus présent que le muscle rouge et davantage dans les espèces vivant au fond des mers et se déplaçant peu. Le muscle rouge doit sa couleur à une forte teneur en myoglobine. Il est impliqué dans les efforts lents mais prolongés et possède un métabolisme aérobie (voie oxydative). Par conséquent, le muscle rouge est très présent chez les espèces pélagiques. Le muscle rouge, présent le long de l’arrête centrale de la tête jusqu’à la queue, est riche en fibres de type I.Ceci explique pourquoi il est beaucoup plus riche en mitochondries, en myoglobine et en lipides que le muscle blanc. Le muscle blanc se caractérise par une prédominance en enzymes glycolytiques et d’isoformes de protéines associées à une contraction rapide. Le muscle rouge quant à lui dispose d’un contenu plus important en enzymes oxydatives et d’isoformes de protéines à contraction lente (Kuypers et Roomans, (1980)). La teneur en protéines et les fonctions protéiques sont similaires entre les mitochondries du muscle rouge et du muscle blanc. La différence majeure observée entre mitochondries du muscle rouge et du muscle blanc se situe dans le métabolisme des lipides. Le taux de certaines enzymes impliquées dans la β-oxydation est 25 % fois plus élevé dans le muscle rouge que dans le muscle blanc. Ceci implique, dans le muscle rouge, un taux respiratoire maximal utilisant majoritairement les lipides comme source d’énergie comparé au muscle blanc (Glancy et Balaban, (2011)) .Lorsqu’on analyse la cellule musculaire de poisson par microscopie électronique à transmission, on constate que l’organisation et la composition sont identiques à une cellule musculaire de mammifères (Ayala et al., (2010)). On y retrouve les structures typiques de la fibre musculaire (Figure 4 ci-dessus), à savoir le sarcolemme (la membrane qui l’entoure), de nombreux noyaux, mitochondries et myofibrilles. Ces dernières sont composées d’unités juxtaposées appelées sarcomères. Chaque sarcomère est constitué de deux types de filaments : le filament épais, la myosine et le filament mince, l’actine. Les filaments minces d’actine sont liés à l’alpha-actinine, en particulier au niveau des disques Z. Ainsi, les extrémités (+) d’actine sont fixées aux sarcomères tandis que les extrémités (-) vont vers le centre du sarcomère. A la frontière entre deux sarcomères, la partie constituée uniquement d’actine est appelée bande I. Dans chaque sarcomère, les filaments d’actine et de myosine vont se chevaucher dans une zone dénommée bande A. Au centre de cette bande A, les filaments d’actine et de myosine ne se croisent plus ; c’est la zone H composée uniquement de myosine. Au centre du sarcomère, se situe la ligne M où sont localisés les filaments de myosine (Figure 4). Le poisson constitue un aliment riche en protéines avec une haute teneur en acides aminés essentiels et en acides gras polyinsaturés. Il possède ainsi une très bonne qualité nutritionnelle (Listrat et al., (2016)).
Composition du poisson La chair de poisson est une matrice constituée à la fois de composants solides et liquides. Les valeurs nutritionnelles constituent un paramètre de la qualité du poisson (Martinez et al., (1997)). Ces dernières dépendent de la composition du poisson. Par conséquent, la connaissance de la structure est primordiale pour comprendre les changements de qualité du poisson. La composition du poisson varie grandement selon l’espèce, le sexe, l’âge et les conditions physiologiques. En général, les principaux composants d’un poisson sont : l’eau, les protéines, les lipides, les glucides, les minéraux et les vitamines (Liu et al., (2013)). Le muscle contient également de la myoglobine et il est donc riche en fer (hème) qui est facilement assimilé par l’organisme (Listrat et al., (2016)). La chair de poisson est également connue comme étant une source importante d’acides gras, d’acides aminés essentiels, de minéraux et des vitamines A, E et B. Apres la mort de l’organisme, des changements biochimiques vont s’opérer et ceci même en cas de conservation à basse température. Ces changements vont avoir un impact sur la qualité sensorielle mais également sur la texture, le goût et l’odeur et in fine sur la fraîcheur

Les différentes phases d’altération biochimique du poisson post mortem

Les trois phases de la rigor mortis Classiquement, 3 phases sont discriminables post mortem. La première phase, pre rigor, a lieu dans les premiers instants après la mort. Le muscle est souple, détendu et élastique durant en moyenne 1 à 6 heures. Suivant l’espèce, les conditions de l’abattage et la température de conservation, intervient ensuite la deuxième phase : la rigor mortis. Durant ce stade, le muscle est tendu, dur et en contraction. Cet état de rigidité cadavérique dure en moyenne 24 heures ou plus selon l’espèce de poisson. La dernière phase, post rigor, apparaît ensuite. Le muscle redevient souple mais perd en élasticité par rapport à l’état de pre rigor. Il est conseillé habituellement de fileter le poisson soit en phase de pre rigor ou post rigor, la chair étant plus souple. En rigor mortis, le filetage est plus dur et peut engendrer des cassures ou déchirures du filet. De même, il est conseillé de cuire et consommer la chair de poisson une fois l’étape de rigor mortis finie. En effet, lorsqu’on cuit le filet à l’étape de pre rigor, la texture de la chair est molle et pâteuse. A l’étape de rigor mortis, elle devient dure mais pas sèche. Immédiatement après la mort, le muscle du poisson est souple et élastique. (Huss, (1999)). Ces étapes s’expliquent d’un point de vue biochimique. En effet, deux types d’altération vont se dérouler post mortem : l’altération autolytique endogène et l’altération bactérienne (Abbas et al., (2009)). Ces travaux de thèse ont pour but d’étudier des marqueurs moléculaires précoces de fraîcheur, autrement dit les changements de la physiologie cellulaire durant les premiers jours de conservation du filet de poisson. Par conséquent, ce chapitre décrira plus particulièrement les mécanismes connus de l’altération autolytique qui se déroulent durant les premiers jours de conservation post mortem du poisson.
Altération autolytique Lorsque le poisson est vivant, celui-ci produit l’énergie nécessaire au fonctionnement de son organisme grâce à deux éléments essentiels : l’oxygène et le glucose. Le glucose est apporté par l’alimentation et l’oxygène par les branchies. Il existe deux voies possibles pour synthétiser la molécule riche en énergie qu’est l’adénosine triphosphate (ATP) par conversion de l’ADP : une voie aérobie et une voie anaérobie. L’étape anaérobie se déroule uniquement dans le cytosol des cellules. Le catabolisme du pyruvate et le cycle de Krebs sont impossibles. Toutefois, le glucose est transformé en pyruvate par une série de réactions en chaîne. Cette transformation appelée glycolyse ou voie d’Embden-Meyerhoff permet la synthèse de pyruvate, de deux molécules d’ATP et de deux molécules de NADH, H+ . Le pyruvate est ensuite transformé en lactate nécessitant un NADH, H +. Le rendement de la glycolyse anaérobie et donc du métabolisme anaérobie est faible car la dégradation d’une molécule de glucose en anaérobie génère seulement deux molécules d’ATP. Par contre, en condition aérobie, le pyruvate produit alimente le cycle de l’acide citrique (cycle de Krebs, (1970)) s’effectuant dans la matrice mitochondriale. L’ensemble des molécules produites dans le cycle de Krebs va ensuite participer à la chaîne respiratoire et la phosphorylation oxydative. Cette dernière va permettre la synthèse de trente-six molécules d’ATP, mais aussi d’eau et de dioxyde de carbone (Figure 5 ci-dessous). Le rendement du métabolisme aérobie est donc beaucoup plus important que le métabolisme anaérobie (36 ATP contre 2 ATP). Les flèches en noir gras indiquent les réactions qui subsistent après la mort de l’organisme (d’après Monin, (1988)) A la mort de l’organisme, il n’y a plus d’apport en oxygène et nutriments. Les seules voies possibles pour produire de l’énergie en condition anaérobie sont la dégradation du glycogène (glycolyse anaérobie), la réduction de la créatine-phosphate et la phosphorylation de l’ADP (Pawar et Magar, (1965)). Etant donné le rendement faible de ces trois voies et le non renouvellement du stock de glycogène, les ressources en ATP vont diminuer rapidement (10 mmoles/g à 1 mmole/g de tissu (Huss, (1999)) voire 1 à 2 µmol/g de tissu (Iwamato et al., (1988)). L’organisme entre ensuite en rigor mortis. Un poisson fatigué et mal nourri rentrera plus rapidement en phase de rigor mortis. Les filaments d’actine et de myosine vont s’interconnecter irréversiblement et former l’actomyosine inextensible (Adelstein et Eisenberg, (1980)). Le mécanisme qui aboutit à la fin de la rigor mortis est encore mal connu et reste à explorer. Toutefois, les cathepsines et les calpaïnes semblent jouer un rôle dans la fin de la rigor mortis en dégradant des protéines de fibres musculaires telles que l’actine et la myosine (Ladrat et al., (2003), Ayala et al., (2010), Ahmed et al., (2015)). L’accumulation de lactate post mortem due à la glycolyse anaérobie va provoquer une acidification du muscle et engendrer par la même occasion une diminution de la valeur du pH. Toutefois, cette diminution de pH reste faible chez le poisson étant donné les plus faibles quantités de glycogène présentes par rapport aux mammifères (Huss, (1995)). En phase de pre rigor, l’ATP va subir une série de dégradation par les ATPases. L’activité de ces dernières est augmentée par un milieu acide (baisse du pH) et une forte concentration de calcium dans le milieu intracellulaire. L’ATP va être successivement dégradée en adénosine diphosphate (ADP), adénosine monophosphate (AMP), inosine monophosphate (IMP), inosine (Ino) et hypoxanthine (Hx). L’Hypoxanthine est ensuite dégradée en xanthine et acide urique. La dégradation de l’ATP en IMP est très rapide et elle est classiquement attribuée aux enzymes endogènes du muscle. La synthèse de l’hypoxanthine à partir de l’IMP est, quant à elle, plus longue et elle est attribuée aux bactéries (Surette et al., (1988)). Toutefois, en condition stérile, il a été montré que la dégradation de l’IMP était identique (Uchiyama et Ehira, (1974), Tejada, (2009)). La vitesse de dégradation des divers catabolites de l’ATP dépend fortement de l’espèce de poisson. Le déclin de l’ATP va participer à l’inhibition des pompes calciques. Ceci va engendrer une perturbation de l’homéostasie du calcium provoquant une forte accumulation du calcium dans le sarcoplasme. Dans les conditions d’ischémie-reperfusion, il a été démontré que la perte de l’homéostasie du calcium joue un rôle important dans les lésions cellulaires (Dong et al., (2006)). Or, après la mort, la cellule se retrouve dans des conditions semblables à l’ischémie. Par conséquent, les mécanismes observés en ischémie peuvent être semblables à ceux retrouvées post mortem dans une cellule musculaire de filet de poisson. L’altération autolytique implique également des enzymes protéolytiques telles que les cathepsines, les calpaïnes, les oxydes de triméthylamine (OTMA) déméthylases et les collagénases. L’activité des calpaïnes et des cathepsines sont dépendantes des concentrations de calcium sarcoplasmique. Les fortes concentrations de calcium sarcoplasmique post mortem vont participer à l’activation des protéases calpaïnes et cathespines. La cathepsine L, en particulier, est connue pour digérer les protéines myofibrillaires (actomysine) et le tissu conjonctif (Huss, (1999)). Ceci engendre une dégradation du tissu et son relâchement. Les calpaïnes sont responsables de la digestion des protéines z des myofibrilles. Les calpaïnes de poisson sont également connues pour dégrader la myosine (particulièrement les hélices alpha des chaînes longues de myosine) à basse température. Les collagénases, quant à elles, sont impliquées dans la destruction du myotome durant un stockage de longue durée sous glace contribuant ainsi à une déchirure du filet (Hernández-Herrero et al., (2003)). L’OTMA déméthylase dégrade l’oxyde de triméthylamine (OTMA) en diméthylamine (DMA) et formaldéhyde. Ce dernier est responsable d’un durcissement de la chair et d’une perte de rétention d’eau (Gill et al., (1979)). La perturbation de l’homéostasie ionique (augmentation du calcium sarcoplasmique) et l’acidification du muscle vont également participer à l’altération des organites tels que les mitochondries, les lysosomes et le réticulum sarcoplasmique. L’altération de ces organites va mener à leur lyse et par conséquent à la libération d’ions (calcium par exemple) et de molécules qui vont participer à la lyse cellulaire (Ahmed et al., (2015)). Par exemple, dans le cas desmitochondries, tout comme dans les mécanismes d’ischémie, le calcium sarcoplasmique, en excès, va intégrer la matrice mitochondriale.Il perturbe ainsi les fonctions et l’intégrité mitochondriales en engendrant une perméabilisation des membranes aboutissant au gonflement des mitochondries. Ceci provoque la libération, dans le sarcoplasme, de facteurs induisant la mort cellulaire et d’ions calcium en excès (Dong et al., (2006)). Autre exemple, l’altération des membranes lysosomiques, due à l’acidification du milieu, va induire une augmentation de la libération de cathepsines dans le cytosol (Dutson, (1983)). Chez la daurade royale, la mitochondrie et le réticulum sarcoplasmique présentent un aspect gonflé au bout de 3 heures post mortem. A 24 heures, les crêtes mitochondriales sont altérées. Après 5 jours, les mitochondries ont des crêtes plus allongées et une matrice à l’aspect blanchâtre et clairsemé. Le réticulum présente de petits cristaux à la périphérie et des vacuoles autophagiques sont visibles (Ayala et al., (2010)). Ces changements sont également observables chez le bar commun 3 heures post mortem (Ayala et al., (2005)). Pour le thon rouge (Thunnus thunnus), après 5 jours de conservation à 4°C, les mitochondries sont gonflées, les crêtes ont disparu et la structure générale est altérée (Roy et al., (2012)).  La phase d’altération du muscle de poisson imputée à l’activité bactérienne va ensuite succéder aux altérations autolytiques.

Généralités sur les mitochondries

Histoire Le mot « mitochondrie » provient de la contraction de « mitos » qui signifie en grec « fil » et de « chondros » qui veut dire « grain ». Les mitochondries sont observées pour la première fois dans des cellules par Altman en 1890, mais il faut attendre la fin du 19ème siècle pour qu’elles soient reconnues comme des organites cellulaires. Leur fonction commencera à être précisée au milieu du 20ème siècle, en montrant leur rôle dans de nombreuses activités cataboliques comme le cycle du citrate (travaux de Krebs, (1970)), la bêta oxydation des acides gras ou la phosphorylation oxydative (travaux de Lehninger). De nouvelles données structurales seront apportées grâce aux premières photomicrographies à haute résolution de Palade, (1952) et Sjöstrand, (1956). Ces travaux ont décrit la mitochondrie comme un organite avec une double membrane: une membrane externe et un réseau de membranes internes encore appelées crêtes mitochondriales. Ils ont démontré que ces membranes délimitent respectivement l’espace intermembranaire et la matrice mitochondriale. Les travaux de Mitchell, (1961) intègrent à la fois les données métaboliques et structurales en proposant la théorie sur la présence d’un gradient chimio-osmotique dans les mitochondries. Ces travaux ont démontré le rôle central des mitochondries dans la synthèse et le stockage de l’énergie cellulaire (Nobel 1978). Les travaux de Boyer et Walker sur l’ATP synthase viendront compléter le rôle primordial des mitochondries dans l’énergétique cellulaire (Nobel 1998). Depuis ces dix dernières années, la mitochondrie est devenue l’organite cellulaire le plus étudié dépassant ainsi en terme d’articles scientifiques la recherche sur le noyau cellulaire (Picard et al., (2016)). Le rôle de la mitochondrie dans les mécanismes de mort cellulaire (Liu et al., (1996), Petit et al., (1996)) a participé à ce regain d’intérêt pour cet organite.
Origine Wallin, (1926) expose pour la première fois l’origine endosymbiotique des mitochondries. Cette théorie est communément admise de nos jours et a été renforcée par des études génomiques. La recherche actuelle supporte fortement l’idée que l’« ancêtre » de la mitochondrie serait une alphaprotéobactérie, apparentant à l’ordre des rickettsiales, qui aurait intégré un archéon il y a environ 2 milliards d’années (Gray, (2012), Yang, (1985)). Ainsi, outre l’aspect morphologique, des similarités entre mitochondries et bactéries ont été rapportées. À titre d’exemple, certaines protéines mitochondriales présentent des similitudes avec des toxines bactériennes et peuvent interagir avec leur hôte (Muchmore et al., (1996), Suzuki et al., (2000)).
Morphologie, distribution et structure des mitochondries La morphologie et le nombre de mitochondries varient suivant le type cellulaire et les besoins énergétiques (Mannella, (2008)). Classiquement, les mitochondries ont une forme sphérique ou de type haricot/bâtonnet. Concernant leur taille moyenne, la longueur est de l’ordre de 1 à 2 µm tandis que la largeur est comprise entre 0,1 et 0,5 µm (Frey et Mannella, (2000); Palade,(1952)). Tout comme pour la morphologie, la taille des mitochondries varie selon le type cellulaire. Chez les hépatocytes et les fibroblastes, une mitochondrie peut mesurer de 3 à 4 µm de long et 1 µm de diamètre (Scheffler, (2007)).  La distribution des mitochondries dans la cellule est liée aux zones de consommation d’énergie. Dans certains types cellulaires comme par exemple l’hépatocyte, les mitochondries sont réparties de façon uniforme et peuvent occuper jusqu’à 25% du volume cytoplasmique. Dans les cellules musculaires, les mitochondries sont disposées principalement entre les myofibrilles. La majorité des mitochondries présente une membrane externe et une membrane interne. Entre ces membranes, est défini un espace inter-membranaire d’une épaisseur de 4 à 7 nm. Les membranes mitochondriales sont composées majoritairement de lipides et de protéines. La membrane interne invaginée dans la matrice définit des crêtes dont la forme et le nombre dépendent de l’activité cellulaire et donc du type cellulaire. Leur forme est souvent de type lamellaire comme dans les cellules musculaires qui ont une haute activité, mais la forme tubulaire se retrouve aussi comme dans les cellules sécrétrices de stéroïdes (Scheffler, (2007)). La matrice mitochondriale renferme des mito-ribosomes, des systèmes enzymatiques et des acides nucléiques tels que de l’ADN circulaire contenant 37 gènes mis en évidence pour la première fois par Nass et al., (1965). L’ensemble des caractéristiques mitochondriales décrites ci dessus est retrouvé chez la totalité des organismes eucaryotes. Nos travaux étant axés sur les mitochondries de poisson, nous allons décrire quelques caractères et propriétés propres à cette espèce.

Les mitochondries de poisson

Morphologie, structure et distribution Les études menées sur les mitochondries de poisson abordent en grande partie une thématique de type éco-physiologique, éco-toxicologique ou encore génétique. Elles permettent de mettre en évidence des points communs avec d’autres organismes eucaryotes (humains, animaux tétrapodes, etc…). En effet, les analyses microscopiques de mitochondries de poisson exposées dans la littérature mettent en évidence une structure et une morphologie classique des organismes eucaryotes . Ces images microscopiques exposent des altérations structurales dans les mitochondries. Toutefois, l’ensemble des caractéristiques types sont discernables : double membrane, matrice, crêtes et forme de type sphérique ou bâtonnet. Les études axées sur les mitochondries ont permis également de mettre en évidence des caractéristiques atypiques des mitochondries de poisson. Chez toutes les espèces vertébrées, on estime que 30 à 50 % du muscle cardiaque est « occupé » par les mitochondries. Par conséquent, l’activité oxydative y est très forte. En parallèle, le contenu mitochondrial des fibres musculaires squelettiques est compris entre 1 et 10 % chez tous les tétrapodes (Moyes et Hood, (2003), Vock et al., (1996)). Chez le poisson, le contenu mitochondrial est beaucoup plus important et varie grandement selon les types cellulaires. Le nombre de mitochondries est cinq fois plus important dans le muscle rouge que dans le muscle blanc. En conséquence, la densité volumique mitochondriale dans le muscle rouge approche, voire excède celle retrouvée dans le cœur (Conley et al., (1995), Moyes et al., (1998), Moyes et Hood, (2003)). Le muscle rouge constitue ainsi une zone riche en mitochondries. Le foie, le cœur et le cerveau constituent également les principaux foyers de cellules riches en mitochondries. En effet, dans la plupart des études mitochondriales chez le poisson, les mitochondries sont extraites dans ces tissus. Les branchies constituent également une zone comportant des cellules riches en mitochondries (Jürss et Bastrop, (1995), Lin et Sung, (2003)).La distribution des mitochondries entre les myofibrilles des cellules musculaires de poisson diffèrent considérablement suivant les espèces et leur milieu de vie : on peut ainsi retrouver un réseau de mitochondries autour de myofibrilles disposé sous forme de ruban ou disposé en amas (Johnston et al., (1998)). Les capacités respiratoires des cellules musculaires peuvent dépendre de plusieurs propriétés : la densité volumique mitochondriale, la densité surfacique des crêtes mitochondriales, la composition en phospholipides et en acides gras insaturés des membranes et le contenu enzymatique mitochondrial (Guderley, (2004)).
Modulation des structures et fonctions mitochondriales chez le poisson Chez le poisson, les fonctions et les structures mitochondriales dépendent de nombreux facteurs tels que : l’âge, l’alimentation, le milieu et le mode de vie du poisson.
a. Influence de l’âge :Le filet de poisson est composé de muscles rouges et de muscles blancs. Chez la daurade royale, les proportions de muscle rouge et blanc varient au cours de la croissance. Au stade larvaire (3 premières semaines), les proportions de muscle rouge sont les plus élevées (30 % de muscle rouge contre 70% de muscle blanc). A l’âge adulte, le muscle rouge ne représente plus que 5 %. Ces données sont corrélées au pourcentage de mitochondries retrouvées dans les fibres musculaires de muscles rouges. La diminution du pourcentage de muscle rouge et du contenu en mitochondries qui lui est associé à la fin de l’état larvaire coïncide avec le début de la respiration par les branchies dans la deuxième moitié du stade larvaire. Durant le stade larvaire, les activités mitochondriales du muscle rouge sont donc les plus élevées qu’à tout autre âge du poisson (Ayala et al., (1999)). Une approche génomique a également mis en évidence l’importance de l’âge du poisson dans les fonctions et l’intégrité mitochondriales en utilisant le modèle « turquoise killfish » Nothobranchius furzeri (Hartmann et al., (2011)). Dans cette étude, Il a été démontré que l’expression de gènes impliqués dans la biogenèse mitochondriale diminue avec l’âge menant à une diminution de la quantité des complexes III et IV de la chaîne respiratoire. Il en résulte une baisse de la respiration mitochondriale dans le muscle squelettique avec l’âge. D’autre part, cette étude a démontré que le nombre de copies d’ADN mitochondrial est 2 à 5 fois plus élevé dans le muscle, le foie, le cerveau en comparaison avec d’autres tissus comme lesbranchies ou la rate. Un lien étroit semble exister entre contenu en ADN mitochondrial et la demande en énergie des tissus (Hartmann et al., (2011)).
b. Influence du milieu de vie :Chaque espèce de poisson peut être caractérisée suivant la température de son milieu de vie. D’autre part, une même espèce peut être amenée à évoluer à différentes températures. Il est admis que les poissons vivant à des températures faibles présentent un contenu mitochondrial (crête, enzymes, nucléotides…) plus important que des espèces vivant dans des eaux chaudes (Guderley, (2004)). L’activité enzymatique (citrate synthase et cytochrome c oxydase) estplus importante chez les espèces antarctiques que les espèces d’eau tempérée (Crockett et Sidell, (1990)). Cependant, les capacités oxydatives et catalytiques des enzymes (comme l’oxydation du pyruvate) ne sont pas systématiquement différentes selon les conditions thermales du poisson. D’autre part, une espèce active aura une proportion de mitochondries plus importante dans le muscle qu’une espèce faiblement active comme certains poissonsbenthiques. Une expérience menée sur deux espèces de cyprinidés a démontré que l’entraînement physique augmentait la densité mitochondriale dans le muscle (Sänger, (1992)). On note également des changements mitochondriaux lorsque le milieu de vie du poisson est perturbé comme par exemple par un changement de température. Toutefois, l’adaptation phénotypique à ce changement de milieu de vie diffère selon les espèces. Chez certaines espèces, la densité volumique mitochondriale augmente alors que pour d’autres, elle ne se modifie pas. En effet, chez la truite arc-en-ciel par exemple, les acides gras des phospholipides mitochondriaux sont plus polyinsaturés durant l’hiver que l’été (12 % de degré d’insaturation supplémentaire). C’est donc un remodelage de la membrane mitochondriale qui permet une meilleure acclimatation au froid (Guderley et Johnston, (1996)). Une autre étude s’est intéressée à l’acclimatation d’espèces antarctiques suite à une élévation de la température durant 4 à 6 semaines. Il a été observé une acclimatation des capacités mitochondriales qui se traduit par des changements des taux de respiration à l’état 3 (voir paragraphe « Le contrôle respiratoire » page 72) pour les complexes respiratoires I (augmentation) et II (diminution). Toutefois, aucune modification significative de la composition en acides gras polyinsaturés dans les membranes mitochondriales n’a été observée (Strobel et al., (2013)). Le poisson est donc capable de modifier et de moduler ses caractéristiques mitochondriales en fonction de l’environnement, autrement dit le milieu de vie dans lequel il évolue. Les changements de la composition en acides gras insaturés et en phospholipides impactent sur la flexibilité, la perméabilité des membranes mitochondriales et la respiration. Un degré d’insaturation membranaire plus élevé rend la membrane plus fluide, perméable et augmente ainsi le mouvement de l’oxygène vers les membranes et permet d’augmenter la respiration mitochondriale (Guderley, (2004)). Il a aussi été démontré que les membranes mitochondriales sont plus flexibles, perméables et labiles chez le poisson que chez le rat suite à des changements de température ou d’osmolarité (Richardson et Tappel, (1962)). Les conditions de vie et de reproduction chez le poisson peuvent se situer à des températures allant de 0°C à 40°C selon l’espèce tout comme les conditions d’osmose variant de 200 mOsm à 1000 mOsm pour les espèces d’eau de mer. Ainsi, il est important de prendre en considération ces données lors des étapes d’extraction. Cela concerne notamment la composition du milieu d’extraction. En effet, il faut faire en sorte que celui-ci respecte les conditions d’osmose les plus adaptées selon l’espèce afin d’optimiser au mieux la conservation des mitochondries isolées (Ballantyne, (1994)). Il ressort de ces études que les poissons ont des caractéristiques mitochondriales très variables suivant l’espèce et ses conditions de vie.
c. Importance de l’alimentation et de la ressource énergétique associée :Les ressources en glycogène dans une cellule musculaire de filet sont étroitement liées à la diète du poisson. Ainsi, un poisson bien nourri bénéficiera d’un stock de glycogène important. Or, plus le stock en glycogène est important, plus la production d’ATP post mortem par glycolyse anaérobie est importante. Or, quand la chaîne de transport d’électrons est perturbée, l’ATP synthase fonctionne dans « le sens inverse » en hydrolysant l’ATP produit par glycolyse anaérobie afin de préserver le potentiel membranaire mitochondrial (St-Pierre et al., (2000)). A partir d’un modèle in vivo, Scheffler et al., (2015) ont montré que le maintien des fonctions mitochondriales impacte positivement le métabolisme post mortem. Ce dernier limite la perte d’ATP, la dégradation du glycogène, l’accumulation du lactate et le déclin du pH. La quantité de glycogène participe donc grandement au maintien des fonctions mitochondriales post mortem et donc au maintien des fonctionnalités cellulaires du filet (Huss, (1999)). Pour une même espèce de poisson, l’étude des fonctions et de l’intégrité mitochondriales chez deux groupes à l’alimentation riche ou pauvre pourrait donner des résultats complétement différents. Le stress à l’abattage impacte également les stocks en glycogène dans la cellule musculaire. En effet, un poisson stressé lors de l’abattage consomme davantage de glycogène, et diminue ainsi ces stocks en se débattant. En conséquence, la production d’énergie post mortem serait potentiellement plus faible et les fonctions et l’intégrité mitochondriales pourraient être impactées. En parallèle, la rigor mortis surviendrait plus tôt et la chute du pH est plus rapide. Différentes méthodes d’abattage existent : asphyxie à température ambiante, asphyxie en hypothermie dans de l’eau glacée à 1,4 + 1°C et plus récemment l’immersion et l’asphyxie dans de la glace liquide (- 2,2°C). D’après les données actuelles obtenues chez la daurade royale, les méthodes d’abattage qui retardent le temps nécessaire à l’étourdissement du poisson ont un effet négatif sur l’apparition de la rigor mortis et sur la qualité du poisson en général sans pour autant impacter la conformation protéique et la structure du muscle (Mendes, (2018)). Nous avons vu chez le poisson que de nombreux facteurs peuvent influencer les fonctions et l’intégrité mitochondriales au sein d’une même espèce. Pour ces raisons, il nous a semblé judicieux de réaliser l’étude des fonctions et de l’intégrité mitochondriales chez des individus issus de l’aquaculture afin de minimiser l’impact des variables telles que : la pression, la température et l’osmolarité de l’eau.

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Table des matières

Avant-propos
Résumé
Abstract
Remerciements
Table des matières
Liste des figures
Liste des tableaux
Liste des annexes
Liste des abréviations
Valorisation des travaux de thèse
Introduction
Etude bibliographique
I. Ressources aquatiques aux échelles mondiale et française
A. Les situations mondiale et française des pêches et de l’aquaculture
B. Consommations mondiale et française de poisson
C. Importations et exportations du poisson en France
D. Développement de l’aquaculture
E. Réglementation européenne concernant l’étiquetage des produits de la mer et d’eau douce
F. Bilan
II. Aspects biologiques et évolution post mortem du poisson
A. Les aspects biologiques du poisson
B. Les différentes phases d’altération biochimique du poisson post mortem
C. Altération bactériologique du poisson post mortem
D. Evolution structurale post mortem chez le poisson
III. Les techniques actuelles d’analyses du poisson
A. Méthodes sensorielles
B. Méthodes chimiques et microbiologiques
C. Méthodes physiques
IV. La mitochondrie, potentiel marqueur précoce de l’altération ?
A. Généralités sur les mitochondries
B. Les mitochondries de poisson
C. Les voies métaboliques de la mitochondrie
D. Chaîne respiratoire et phosphorylation oxydative
E. Régulation de la phosphorylation oxydative
F. Le potentiel membranaire mitochondrial
G. Les transporteurs mitochondriaux
H. Mitochondries et mort cellulaire
V. Synthèse de l’étude bibliographique
Matériels et méthodes
I. Modèles d’étude
A. La lignée cellulaire SAF-1
B. Les filets de daurade royale (Sparus aurata)
C. La souche bactérienne : Escherichia coli
II. Etude structurale des mitochondries par microscopie électronique à transmission (MET)
III. Extraction des mitochondries
A. Extraction de mitochondries de cellules de la lignée SAF-1
B. Extraction de mitochondries de filets de daurade royale
C. Dosage des protéines mitochondriales
IV. Evaluation de la respiration mitochondriale par oxygraphie
V. Evaluation du potentiel membranaire par fluorimétrie
A. Evaluation du potentiel membranaire mitochondrial (ΔѰm) des cellules SAF-1
B. Evaluation du potentiel membranaire mitochondrial (ΔѰm) de mitochondries isolées
C. Evaluation du potentiel membranaire bactérien (ΔѰ) à l’aide de sondes fluorescentes
VI. Détermination de la viabilité bactérienne
VII. Analyses statistiques 
Travaux de recherche
I. Analyse morphologique des cellules SAF-1 et des tissus de daurade royale par microscopie électronique à transmission 
A. Lignée cellulaire SAF-1
B. Cellules musculaires de filets de daurade royale
II. Evaluation du potentiel membranaire mitochondrial (ΔѰm) sur cellules entières
A. Microscopie à fluorescence
B. Cytométrie en flux

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