La microscopie de fluorescence super-résolue

La microscopie de fluorescence super-résolue

Principe de la fluorescence 

Une molécule qui absorbe un photon (lumière) passe de l’état fondamental S0 à un état excité Sn (avec n ⩾ 1) .

En quelques picosecondes, cette absorption est généralement suivie de processus de relaxation non radiatifs très rapides (conversions internes et relaxations vibrationnelles). La molécule se retrouve dans l’état excité de plus basse énergie (S1). Il existe alors 2 voies possibles de désexcitation de l’état S1 avec 2 constantes cinétiques kr et knr, respectivement de façon radiative et non radiative. La fluorescence représente la voie radiative, les transitions de type conversion interne (S1 vers S0) et de type croisement inter-systèmes (S1 vers T1) constituent la voie non radiative. Ces 2 voies sont associées à des constantes de vitesse nommées kr (fluorescence), kic (conversion interne) et kisc (croisement inter-système) qui sont liées selon les relations écrites en équation (1).

k = kr + knr avec knr = kic + kisc  (1)

Caractéristiques des sondes fluorescentes 

Il existe différentes caractéristiques importantes pour une sonde fluorescente. Elles vont régir le choix des paramètres d’une expérience de microscopie de fluorescence. Tout d’abord, la gamme spectrale de la sonde [16], généralement caractérisée par son maximum d’absorption (λabs) et son maximum d’émission de fluorescence (λem), séparés par le déplacement de Stokes [4] ou « Stokes shift » .

Le coefficient d’absorption molaire (ελ en L.mol-1 .cm-1 ) dépend de la longueur d’onde d’excitation et caractérise la probabilité qu’un photon soit absorbé par une molécule. Il est le plus souvent défini par la loi de Beer-Lambert, où Aλ représente l’absorbance, l le trajet optique (en cm) et C la concentration (en mol.L-1 ) de l’échantillon, voir équation (2). Il permet de définir la section efficace (σ, « cross section »), qui représente une surface d’absorption (en cm²), voir équation (2).

Aλ = ελ × l × C et σλ = 3,82. 10⁻²¹ × ελ  (2)

Le rendement quantique de fluorescence (ϕF), caractéristique de l’efficacité du phénomène de fluorescence [18], correspond au nombre de photons émis par rapport au nombre de photons absorbés. Il indique le ratio entre la relaxation par voie radiative et la relaxation par voie non radiative de l’état S1. Il peut être défini suivant l’équation (3).

ϕF = kr / kr + knr  (3)

Les sondes fluorescentes classiques pour l’imagerie 

De nombreuses sondes fluorescentes sont utilisées dans le domaine de l’imagerie biologique. Elles peuvent prendre la forme de protéines, de petites molécules organiques ou de nanocristaux inorganiques (QDs).

La GFP (Green Fluorescente Protein) [23] est la protéine fluorescente la plus connue dans le domaine de la bio-imagerie. Elle émet de la fluorescence dans le vert et possède une brillance (Tableau 1) d’environ 39 000 L.mol-1 .cm-1 . Les protéines fluorescentes sont parfaitement biocompatibles, généralement de faibles poids moléculaires (26,9 kDa pour la GFP) et de tailles de quelques nanomètres, ce qui en fait de très bons candidats pour imager de petites structures (ex. pores nucléaires de 150 nm) sans dénaturer le milieu cellulaire. De plus, elles peuvent être encodées génétiquement, notamment via des méthodes de transfection cellulaire [3]. Associées à une séquence d’adressage spécifique, elles vont pouvoir être dirigées au travers de la cellule étudiée, sans être limitées par le passage au travers des membranes biologiques. En revanche, leur fonctionnalisation reste un problème en raison de leur complexité structurale et de leurs longueurs d’ondes d’excitation dans l’UV et le bleu, qui favorisent l’autofluorescence des structures biologiques [24]. De plus, un marquage génétique de la cellule ciblée génère une expression massive de la protéine fluorescente, ce qui conduit à de l’imagerie de haute densité et peut rendre très difficile des études de quantification.

Les molécules organiques fluorescentes sont classées selon plusieurs familles. Les molécules organiques comme les Cyanines, les Rhodamines ou les BODIPYs sont très utilisées en ingénierie moléculaire pour le développement de nouvelles sondes aux propriétés spécifiques. Les molécules de la famille des Xanthènes [25] possèdent de bonnes propriétés spectroscopiques (Tableau 1). Les principaux représentants de cette famille sont les rhodamines (RhB et Rh6G) qui émettent une fluorescence dans le vert-jaune. Elles possèdent des rendements quantiques de fluorescence proches de 1 et sont hydrosolubles ce qui les rend compatibles avec les milieux biologiques. De plus, leur émission de fluorescence est fonction du pH, c’est pourquoi ces sondes sont principalement utilisées dans les études in vitro. Les molécules de la famille des Polyméthines sont également très utilisées dans le domaine de la microscopie de fluorescence. Les Cyanines (Cy3 et Cy5) sont les sondes fluorescentes les plus connues. Elles sont hydrosolubles et, contrairement aux Xanthènes, elles fluorescent à une longueur d’onde plus proche du rouge, mieux adaptée aux études in vivo. Les BODIPYs (Bore-dipyrométhene) [26] forment une famille de molécules possédant un rendement quantique de fluorescence proche de 1, ce qui leur confèrent une forte brillance (Tableau 1). Ces molécules sont peu sensibles à la polarité et au pH de leur environnement. De plus, elles présentent une gamme d’émission de fluorescence modulable [27], ce qui les rend très adaptables au matériel expérimental (optiques et filtres) et permet de faire de l’imagerie multicolore, en combinant différents BODIPYs.

Enfin, les QDs sont des nanocristaux inorganiques semi-conducteurs (de taille 2 – 10 nm). Les plus connus sont composés d’un cœur de séléniure de cadmium (CdSe) et d’une coquille de sulfate de zinc (ZnS) [33]. Ils possèdent des temps de vie de fluorescence de plusieurs dizaines de nanosecondes et sont généralement employés pour leur grande photostabilité (plusieurs minutes) [34]. Ils présentent de bons rendements quantiques de fluorescence (0.5 à 1) et de fortes brillances (60 000 à 600 000 L.mol-1 .cm-1 ), qui varient en fonction de leurs tailles [33, 35]. Leurs gammes d’émission de fluorescence peuvent être modulées, de 400 à 1400 nm, en faisant varier la nature de leurs composés de cœur et de surface [36, 37]. De plus, ils possèdent la propriété intrinsèque de clignoter. En revanche, afin de compenser leur hydrophobicité et de limiter leur cytotoxicité, il est nécessaire d’effectuer des modifications de surface via des polymères [38] qui conduisent à des nanoparticules de tailles finales de l’ordre de 15 – 25 nm [39]. Les QDs sont donc des nanoparticules possédant des propriétés très attractives dans le domaine de l’imagerie biologique. Cependant, leur cytotoxicité, causée par les molécules de cœur [40], constitue un inconvénient majeur lors d’études répétées ou prolongées.

Cette diversité de sondes fluorescentes permet notamment de pouvoir s’adapter à une multitude de conditions expérimentales. Elles tendent à être remplacées par des nanoparticules organiques, qui présentent une forte biocompatibilité et de grandes possibilités de fonctionnalisation [5]. De plus, l’utilisation simultanée de sondes possédant des gammes spectrales d’émission de fluorescence différentes, permet de réaliser des images multicolores.

Processus photo-induits intermoléculaires

Un transfert d’énergie entre une molécule à l’état excité et une molécule à l’état fondamental peut se produire soit de façon radiative via l’émission d’un photon par le donneur (D) et son absorption par l’accepteur (A), soit de façon non radiative. Dans ce dernier cas, deux processus différents peuvent avoir lieu : un échange d’électrons (mécanisme de Dexter) ou une interaction dipôle-dipôle (mécanisme de Förster) (Figure 6), aussi appelée FRET (Förster Resonance Energy Transfer) [41, 42]. Quand le FRET est possible entre deux molécules identiques on parle alors d’homo-FRET ou « hopping ».

Le mécanisme de Dexter implique un recouvrement des orbitales moléculaires des deux molécules, son efficacité diminue de façon exponentielle avec la distance D-A. Il se produit donc majoritairement à très faible distance (< 2 nm). Le mécanisme de Förster dépend du recouvrement entre le spectre de fluorescence du donneur et le spectre d’absorption de l’accepteur. Son efficacité (E) est également fonction de la distance entre les sondes D-A (voir équation (6)), où R (en Å) correspond à la distance D-A et R0 (en Å) au « rayon de Förster ». Le « rayon de Förster » est la distance caractéristique pour deux sondes fluorescentes données dans un environnement donné pour laquelle la probabilité de transfert d’énergie est égale à 50 % (E = 0,5).

Les processus photo-induits intermoléculaires peuvent également conduire à la formation d’espèces chimiques appelées excimères. Le mot excimère provient du terme anglais « excimer » qui est la contraction de « excited dimer », désignant un dimère à l’état excité. Ils sont formés par collision d’une molécule excitée M* et d’une molécule de même type non excitée M (Figure 8). Leurs longueurs d’ondes d’émission de fluorescence sont déplacées vers le rouge, parfois de plusieurs centaines de nanomètres, comparé au monomère [45] (Figure 8). Leurs temps de vie de fluorescence diffèrent de ceux de la molécule d’origine et peut parfois être plus courts [46]. Il a également été montré que l’agrégation moléculaire, ou « π-stacking», favorise la formation d’excimères [47].

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Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
CHAPITRE I ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
I.1 Introduction
I.2 La microscopie de fluorescence super-résolue
I.2.1 Principe de la fluorescence
I.2.2 Caractéristiques des sondes fluorescentes
I.2.3 Les sondes fluorescentes classiques pour l’imagerie
I.2.4 Processus photo-induits intermoléculaires
I.2.5 La microscopie de fluorescence
I.2.6 Limite de diffraction de la lumière
I.2.7 L’imagerie de super-résolution
I.2.7.1 Clignotement et photo-activation des sondes
I.2.7.1 L’imagerie de super-résolution en microscopie confocale
I.2.7.2 L’imagerie de super-résolution en champ large
I.2.7.3 L’importance des paramètres photo-physiques
I.2.8 Conclusion
I.3 Super-résolution de haute densité en champ large
I.3.1 Méthodes de multi-localisation
I.3.2 Méthodes de déconvolution
I.3.3 Méthode couplant localisation et déconvolution
I.3.4 Quelle méthode choisir ?
I.3.5 Méthodes statistiques
I.3.6 Conclusion
I.4 Nanoparticules organiques pour la super-résolution
I.4.1 Nanoparticules organiques photo-commutables
I.4.2 Nanoparticules organiques avec clignotement
I.4.2.1 Extinction de fluorescence induite par agrégation
I.4.2.2 Emission de fluorescence induite par agrégation
I.4.2.3 Limitation de l’agrégation des molécules encapsulées
I.4.2.4 Clignotement par transfert d’exciton
I.5 Conclusion
CHAPITRE II CARACTERISATION SPECTROSCOPIQUE D’ENSEMBLE DE NANOPARTICULES POLYMERES A FORTE CONCENTRATION DE BODIPYS
II.1 Introduction
II.2 Conditions expérimentales
II.2.1 Structure des NPFs
II.2.2 Solvants
II.2.3 Spectroscopie d’absorption UV-visible stationnaire
II.2.4 Spectroscopie de fluorescence stationnaire
II.2.5 Spectroscopie d’absorption transitoire femtoseconde
II.2.6 TCSPC en solution
II.3 Résultats de l’étude des NPFs en solution
II.3.1 Détermination de la taille des NPFs
II.3.2 Spectres stationnaires UV-visible
II.3.3 Temps de vie de fluorescence
II.3.4 Anisotropie de fluorescence résolue dans le temps
II.3.5 Absorption transitoire femtoseconde
II.3.5.1 Comparaison BDPMA et NPF
II.3.5.1 Etude en fonction de l’énergie d’excitation (BDPMA)
II.3.5.1 Etude en fonction de l’énergie d’excitation (NPF)
II.4 Conclusion
CHAPITRE III CARACTERISATION DES NPFS PAR SPECTROSCOPIE DE PARTICULES UNIQUES
III.1 Introduction
III.2 Conditions expérimentales
III.2.1 Solvants
III.2.2 Préparation des échantillons
III.2.3 Source laser femtoseconde
III.2.4 Microscope de fluorescence résolue en temps
III.2.5 Caractérisation du microscope confocal
III.3 Etude par spectroscopie de particules uniques de l’émission des NPFs
III.3.1 Observation des NPFs uniques
III.3.2 Evolution de l’intensité en fonction du temps
III.3.3 Temps de vie
III.4 Conclusion
CHAPITRE IV TRAITEMENT D’IMAGES FLUORESCENTES DE HAUTE DENSITE
IV.1 Introduction
IV.2 Simulations d’images
IV.2.1 Détail du programme
IV.2.2 Les simulations de données de haute densité
IV.3 MAPping PIXel dissimilarity (MAPPIX)
IV.3.1 Principe
IV.3.2 Calcul de dissimilarité
IV.3.3 Discussion
IV.4 Etude sur données simulées
IV.4.1 Résultats
IV.4.2 Discussion
IV.5 Etude sur données réelles
IV.5.1 Préparation d’échantillons biologiques
IV.5.2 Conditions expérimentales
IV.5.3 Résultats
IV.6 Conclusion
CONCLUSION GENERALE

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