La microfluidique et le criblage

La microfluidique et le criblage 

Généralités

Le développement des microsystèmes fluidiques ces dernières années, avec leurs capacités d’intégration, de contrôle, de réduction des volumes consommés et d’accélération des mélanges ont apporté de réelles contributions dans le domaine du criblage et plus particulièrement des macromolécules biologiques comme les protéines, de la formulation de microvannes en polymère ou d’émulsions de taille contrôlée [1-3].

Le criblage est une méthode d’investigation mettant en jeu des milliers d’échantillons et autant de processus physico-chimiques visant à découvrir une molécule ou optimiser un processus. Elle est un enjeu industriel dans des domaines aussi divers que la fabrication de produits cosmétiques, médicaments, peintures ou matières plastiques. Nous pouvons citer comme exemple : la détermination des conditions favorables de cristallisation. Afin de réaliser cette caractérisation, un grand nombre d’essais sur des paramètres comme la température, la concentration des composants, la cinétique, le pH ou le temps est nécessaire. Cependant, avec des méthodes conventionnelles, une étude de diagramme de phase est une opération relativement longue (généralement plusieurs mois) et demande, pour des méthodes dites classiques comme le microbatch, la diffusion en phase vapeur ou la dialyse une grande consommation de produits .

En opérant dans des microcanaux, il est possible de réduire les volumes de produits utilisés de deux ordres de grandeur. Il est alors possible d’augmenter le nombre de tests effectués sur un même système, tout en consommant une quantité réduite de réactifs. De plus, les temps de mélange sont plus faibles que dans les systèmes traditionnels, du fait de la diminution du temps de diffusion résultant de la réduction de taille du système. Cela conduit, si les cinétiques en jeu ne sont pas trop lentes, à une réduction importante du temps de réponse du système d’analyse microfluidique. Actuellement, il existe deux grandes approches basées sur la technologie microfluidique : le criblage dans des microchambres ou le criblage dans des microgouttes. Elles impliquent une architecture souvent sophistiquée du microsystème ; elles possèdent chacune leurs avantages et leurs inconvénients selon les molécules ou matériaux à cribler [8, 9].

Quelques notions utiles dans le cadre de cette thèse sur la microfluidique

La microfluidique est une science relativement récente dont l’engouement est allé crescendo ces quinze dernières années. Elle s’intéresse aux écoulements de fluides à petite échelle (typiquement inférieure à 300µm) et généralement en petites quantités (de 10⁻⁹ à 10⁻¹⁸ L). Cette définition n’est aujourd’hui pas suffisante pour exprimer toute la diversité de la microfluidique. Autant science que technologie, elle englobe l’étude des phénomènes à l’échelle micrométrique et le développement de nouvelles méthodes de microfabrication ou de systèmes d’analyse pour la biologie ou la chimie. On peut d’ailleurs citer ici quelques innovations liées à la microfluidique comme les têtes d’imprimantes à jet d’encre, les refroidisseurs des microprocesseurs ou les puces pour analyse d’enzymes ou d’ADN [10].

Criblage dans des microchambres

Réaliser une expérience de criblage signifie remplir chaque chambre avec des concentrations variées et contrôlées de solutions. Cela exige un réseau de canaux d’alimentation dont la complexité est à la hauteur du nombre de microchambres. Afin de paralléliser et de réduire au maximum le nombre de canaux, quelques avancées technologiques ont été nécessaires (microvannes intégrées et multiplexeur). La contribution du groupe de Stephen Quake de l’Université de Stanford est d’avoir résolu les structures tridimensionnelles de certaines protéines que les méthodes classiques ne parvenaient pas à cristalliser [13].

Les microvannes intégrées

Une méthode pour réaliser une vanne dans un microsystème est d’exploiter la flexibilité d’un matériau comme le PDMS (module de Young environ 1MPa). Le principe, est le suivant : deux microcanaux se croisent à deux niveaux différents et sont séparés par une fine membrane de quelques dizaines de microns d’épaisseur. Le premier canal est celui d’actionnement. En augmentant suffisamment la pression, la membrane souple défléchit et vient obstruer le second canal fluidique et ainsi bloquer les flux qui y circulent [14].

Pour réaliser une vanne étanche, il est indispensable que le canal fluidique soit arrondi à l’endroit de la vanne et présente une surface de membrane suffisamment conséquente (parfois la largeur du canal fluidique doit être agrandie à l’endroit de l’écrasement). Ce détail implique des étapes supplémentaires lors de la fabrication d’un microsystème en plus de la conception sur deux niveaux de canaux.  ces vannes peuvent servir de pompes péristaltiques pour faire avancer des fluides dans un microcanal [15]. Mises en parallèles , elles peuvent adresser un canal particulier lors d’un embranchement multiple.

Le multiplexeur

Lorsque l’on désire remplir indépendamment une centaine de microchambres en contrôlant chacun de volumes et des concentrations impliqués comme c’est le cas pour une expérience de criblage, il n’y a qu’une méthode possible : adresser chaque chambre à l’aide de vannes. Il est donc nécessaire pour une centaine de chambres d’avoir un nombre équivalent de vannes ce qui est déraisonnable du point de vue de la conception et la fabrication du microsystème. C’est pour simplifier ce problème et rendre réalisable ce type de microsystème compliqué qu’intervient le multiplexeur. L’astuce présentée consiste à grouper chaque vanne indépendante avec certaines de ses voisines et de les contrôler ensemble.

Un exemple de criblage microfluidique : la cristallisation de protéines

Le diagramme de phase d’une protéine et de son agent cristallisant 

Cristalliser une protéine est difficile car il n’existe pas de méthode pour prédire les conditions de cristallisation. Déterminer l’agent cristallisant le plus adapté (du point de vue de la viscosité, tension de surface, force ionique ou pH) est la première étape que réalise un microsystème baptisé “formulateur” [17]. Ensuite, il faut affiner ces conditions jusqu’à obtenir le cristal recherché. C’est le rôle d’un microsystème basé sur le principe de la diffusion libre de l’interface [18]. Quand les conditions de criblage les plus favorables sont finalement déterminées (plus d’un millier de tests et d’essais), on les applique dans un troisième microsystème qui permet de reproduire l’expérience en obtenant des cristaux de plus grande taille directement utilisables sous les rayons X pour en déterminer leur structure tridimensionnelle [19].

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Table des matières

INTRODUCTION
LA MICROFLUIDIQUE ET LE CRIBLAGE
1.1. GÉNÉRALITÉS
1.2. QUELQUES NOTIONS UTILES DANS LE CADRE DE CETTE THÈSE SUR LA MICROFLUIDIQUE
1.2.1. L’hydrodynamique à bas nombre de Reynolds
1.2.2. Le transport des fluides
1.3. CRIBLAGE DANS DES MICROCHAMBRES
1.3.1. Les microvannes intégrées
1.3.2. Le multiplexeur
1.3.3. Un exemple de criblage microfluidique : la cristallisation de protéines
1.4. CRIBLAGE DANS DES GOUTTES
1.4.1. La microfluidique digitale appliquée au criblage
1.4.2. Les systèmes de criblage mis en œuvre par la microfluidique digitale
1.5. CRIBLAGE PAR PERVAPORATION
1.5.1. Principe de la pervaporation
1.5.2. La pervaporation microfluidique
1.5.3. Le criblage dans des doigts
1.5.4. Le criblage couplant gouttes et pervaporation
1.6. OBJECTIFS DU TRAVAIL DE THÈSE
LE SYSTÈME EXPÉRIMENTAL
2.1. CONCEPTION D’UN OUTIL DE CRIBLAGE MICROFLUIDIQUE
2.1.1. La formation de gradients de concentration dans les microsystèmes
2.2. LE DIMENSIONNEMENT DU SYSTÈME DE CRIBLAGE
2.2.1. Définition de la hauteur des canaux de travail
2.2.2. Définition de la membrane
2.2.3. Caractérisation des chambres de pervaporation
2.2.4. Dimensionnement des vannes étanches
2.2.5. Le réseau de formation du gradient
2.2.6. Conception du microsystème de criblage
2.3. LA MICROFABRICATION
2.3.1. Les méthodes de fabrications employées lors de cette thèse
2.3.2. Les procédés de lithographie douce
2.3.3. Le protocole de gravure humide sur silicium
2.3.4. Le moulage du PDMS
2.4. PROTOCOLE D’UNE EXPÉRIENCE DE CRIBLAGE PAR PERVAPORATION
2.4.1. Le remplissage du microsystème
2.4.2. Le démarrage de la pervaporation
2.5. EXPÉRIENCES DE CARACTÉRISATION
2.5.1. Caractérisation des états de surface des parois des canaux
2.5.2. Mesure de la vitesse de pervaporation et validation du microsystème
LE RÉFRACTOMÈTRE INTÉGRÉ
3.1. INTRODUCTION
3.2. LES MÉTHODES DE MESURE DE CONCENTRATION DANS DES MICROSYSTÈMES
3.2.1. Mesure de la concentration à l’aide de traceurs fluorescents en solution
3.2.2. Mesure de la concentration d’une solution dans un capillaire par réfractométrie
3.2.3. Estimation de la concentration dans un microcanal par diffraction d’un laser
3.2.4. Système de mesure de la concentration à l’aide d’une puce MEMS
3.3. MESURES DE LA CONCENTRATION IN SITU EN TEMPS RÉEL : LE PRINCIPE DU RÉFRACTOMÈTRE INTÉGRÉ
3.4. MODÈLE THÉORIQUE SIMPLIFIÉ DU RÉFRACTOMÈTRE INTÉGRÉ
3.5. LES INSTRUMENTS OPTIQUES DE VISUALISATION UTILISÉS
3.5.1. La loupe binoculaire
3.5.2. Le microscope
3.5.3. Le macroscope
3.5.4. Résumé des caractéristiques des appareils
3.6. MODÉLISATION NUMÉRIQUE DU RÉFRACTOMÈTRE INTÉGRÉ
3.6.1. Description du programme de modélisation numérique
3.6.2. Variation de contraste simulé pour une loupe binoculaire
3.6.3. Variation de contraste simulé pour un microscope ou un macroscope
3.7. MESURE PRATIQUE DU CONTRASTE DES IMAGES OBSERVÉES
3.8. EVALUATION DE LA CONCENTRATION D’UNE SOLUTION À PARTIR D’UNE MESURE DE CONTRASTE
3.9. COMPARAISON ENTRE LA THÉORIE, LA MODÉLISATION NUMÉRIQUE ET L’EXPÉRIENCE
3.9.1. Expériences effectuées sur un canal à parois obliques avec différents instruments optiques
3.9.2. Etude de la forme des parois d’un canal sur le signal de réfractométrie
3.10. UNE APPLICATION DU RÉFRACTOMÈTRE : MESURE DU MÉLANGE ET DE LA DIFFUSION DANS UN CANAL TRAPÉZOÏDAL
3.10.1. Mélange de glycérol avec de l’eau
3.11. CONCLUSION
APPLICATIONS AU CRIBLAGE DE DIFFÉRENTS SYSTÈMES
4.1. ETUDES DE SURSATURATION DE SOLUTIONS IONIQUES
4.1.1. Expériences avec une solution binaire : NaCl et H2O
4.1.2. Sursaturation et vitesse de pervaporation
4.1.3. Diagramme de phase d’une solution ternaire : NaCl, NH4Br et H2O
4.2. ETUDES DE FLUIDES COMPLEXES
4.2.1. Solution ternaire composée d’un polymère et un sel : PEG200, PEG3350, (NH4)2SO4 et H2O
4.2.2. Etudes d’une solution binaire avec un surfactant : AOT et H2O
4.3. LE CRIBLAGE DE PROTÉINES
4.4. CONCLUSION
CONCLUSION
ANNEXES

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