Soutenance mémoire
La membrane nucléaire externe est essentielle au positionnement du noyau
La membrane nucléaire externe contient des ribosomes sur sa surface cytoplasmique. Elle a longtemps été admise comme identique, en composition protéique, à la membrane du réticulum endoplasmique rugueux, avec lequel elle est en continuité. Cependant, des données récentes suggèrent que la membrane nucléaire externe contient l’intégralité des protéines impliquées dans le positionnement nucléaire qui ne sont pas présentes au niveau du réticulum endoplasmique (Starr and Han, 2003). Parmi ces protéines, nous trouvons les produits de deux gènes, nesprine 1 et nesprine 2 (aussi appelées syne-1 et syne-2 ou encore Nuance ou Myne1 ou ENAPTIN ou ANC-1), qui codent pour des polypeptides contenant des répétitions de séquences de type spectrine (Young and Kothary, 2005; Zhang et al., 2001). Ces répétitions ont tout d’abord été identifiées au sein de grandes protéines, les mieux caractérisées étant des protéines cytoplasmiques comme la dystrophine et l’-actinine. La structure générale de ces protéines est : un domaine central contenant les répétitions impliquées dans l’auto-association de la protéine, une région Nterminale liant l’actine composée de deux domaines homologues à la calponine et une région C-terminale contenant un domaine fonctionnel distinct. Les régions C-terminales interviennent dans des activités telles que l’association aux membranes, la liaison aux filaments intermédiaires et aux microtubules. Dans le cas des nesprines, une initiation alternative de la transcription ainsi qu’un épissage alternatif de l’ARN génèrent de multiples isoformes avec des poids moléculaires qui s’étendent approximativement de 50 kDa (Nesprine-2) à 800 kDa (Nuance). Certaines isoformes de nesprines n’ont pas de région Cterminale. D’autres isoformes ont comme région C-terminale un domaine KASH (pour Klarsicht, Anc-1, Syne-1 Homology ou « Klarsicht-like domain», figure 3), constitué d’un passage transmembranaire suivi d’un segment de 35 résidus riche en proline.
Les nesprines peuvent diffuser latéralement dans la membrane du réticulum endoplasmique, mais alors que les petites isoformes sont capables d’atteindre la membrane nucléaire interne, les grandes isoformes sont exclues de cette membrane, probablement à cause de la taille restreinte des canaux des complexes des pores nucléaires (Soullam and Worman, 1995).
Les grandes isoformes de nesprine interagissent par leur domaine N-terminal avec le cytosquelette d’actine (figure 4) (Zhang et al., 2002). De plus, elles s’attachent par leur domaine C-terminal KASH aux domaines périnucléaires SUN des protéines de la membrane nucléaire interne telles que UNC84 (Lee et al., 2002b; Malone et al., 1999) et Matefin chez Caenorhabditis elegans et SUN1 et SUN2 (Hodzic et al., 2004) chez les mammifères. Un exemple en est la protéine ANC-1 de C. elegans contenant une répétition de séquences de type spectrine et un domaine périnucléaire qui interagit directement ou indirectement avec le domaine périnucléaire SUN de UNC84 (Starr and Han, 2002). Les plus petites isoformes s’associent dans le noyau avec l’émerine et les lamines A/C (Zhang et al., 2005). Enfin, certaines isoformes s’ancrent, de part leur segment transmembranaire, à la membrane d’organites autre que le noyau, comme le réticulum endoplasmique ou la mitochondrie (Starr and Han, 2002). D’autres protéines localisées à la membrane nucléaire externe contiennent un domaine KASH (Starr and Fischer, 2005). Ces domaines KASH s’associent aux domaines SUN des protéines de la membrane nucléaire interne et ancrent ainsi les protéines qui les possèdent à la membrane nucléaire externe (figure 5).
Les protéines à domaine KASH ont tout d’abord été identifiées chez Drosophila et C. elegans. En effet, des mutations au sein de ces protéines provoquaient un positionnement anormal du noyau. Plus récemment, les protéines à domaine KASH ont été montrées impliquées dans l’attachement du centrosome au noyau, la migration nucléaire et l’amarrage du noyau au cytosquelette d’actine. Comme pour la membrane nucléaire externe, l’espace périnucléaire entre les membranes nucléaires externe et interne a longtemps été considéré identique à la lumière du réticulum endoplasmique. On pourrait cependant imaginer que la composition de l’espace périnucléaire diffère du lumen de la plus grande partie du réticulum endoplasmique. Puisque des parties des protéines localisées et intégrées aux membranes, interne et des pores, dans la région luminale pourraient lier des protéines ne résidant pas à la membrane. En effet, des données récentes démontrent que des mutations au sein de la torsine A, une protéine luminale du réticulum endoplasmique impliquée dans la dystonia DYT1, provoquent la concentration de la protéine dans l’espace périnucléaire par liaison au domaine luminal de LAP1 (lamina associated polypeptide 1) (Goodchild and Dauer, 2005). Désormais, la membrane nucléaire externe et l’espace périnucléaire apparaissent comme des sous-domaines différentiés de la membrane du réticulum endoplasmique rugueux et du lumen.
Les pores nucléaires et le transport nucléo-cytoplasmique
Structures des pores
L’enveloppe nucléaire des cellules eucaryotes est perforée à intervalles réguliers par de volumineux complexes multiprotéiques, les pores nucléaires ou NPCs (Nuclear Pore Complexes). Ces complexes sont formés d’environ une cinquantaine de protéines différentes appelées les nucléoporines (Nup) (Cronshaw et al., 2002; Rout et al., 2000). Le nombre de pores nucléaires dépend de l’état fonctionnel de la cellule, il varie de 4000 à 6000 dans une cellule de mammifère. Un pore nucléaire apparaît à la surface des membranes comme un anneau d’une centaine de nanomètres de diamètre par microscopie électronique. Il comporte en fait deux anneaux, l’un cytoplasmique et l’autre nucléoplasmique, présentant chacun une architecture symétrique d’ordre huit (figure 6). Ces deux anneaux sont reliés par des rayons issus de chacune des huit sous-unités, l’ensemble formant une cage cylindrique (Suntharalingam and Wente, 2003).
Les sous-unités de l’anneau cytoplasmique émettent dans le cytoplasme huit fibrilles. Les sous-unités de l’anneau nucléaire émettent huit autres filaments plus longs qui se fixent sur un anneau distal de plus faible diamètre, formant un « panier ou cage nucléaire ». La région centrale du pore est localisée au centre de la cage cylindrique à laquelle elle est reliée par un anneau interne. L’ensemble de ces éléments est encastré dans l’enveloppe nucléaire à l’intérieur d’un anneau luminal et est stabilisé par des interactions avec différents types de protéines membranaires ainsi qu’avec les filaments intermédiaires du noyau. Les nucléoporines sont localisées dans les sous-unités des anneaux et sur les fibrilles et filaments. Elles interviennent dans la reconnaissance et le guidage des molécules transitant à travers les NPCs.
Transport nucléo-cytoplasmique
Les pores nucléaires sont perméables aux petites molécules (tels les ions et les nucléotides) d’un poids moléculaire inférieur à 5 kDa qui diffusent passivement. Les molécules d’un poids moléculaire de 5 à 50 kDa diffusent à une vitesse proportionnelle à leur taille (diffusion facilitée). Les molécules d’un poids moléculaire supérieur à 50 kDa (tels que les sous-unités des ribosomes, les ARN, ou les composants du réplisome) sont transportées par un mécanisme actif et sélectif. Par exemple, dans une cellule de mammifère en prolifération, un million de molécules par minute transitent à travers les NPCs. La prise en charge des protéines et des ARN, parfois sous forme de ribonucléoprotéines, par une molécule transporteur dépend de la présence de séquences d’importation nucléaire appelées Signal de Localisation Nucléaire (NLS : Nuclear Localisation Signal) formées de 4 à 8 acides aminés basiques. Ces séquences peuvent être organisées en deux blocs séparés par une dizaine d’acides aminés. Elles peuvent être activées et inactivées par phosphorylation et déphosphorylation. L’exportation dépend de la même façon de séquences signal appelées Signal d’Exportation Nucléaire (NES : Nuclear Export Signal). Suite à la formation des complexes entre transporteurs et molécules «cargo» (à transporter), il y a interaction entre ces complexes et les nucléoporines (figure 7). La vectorisation du transport (noyau vers cytoplasme ou inversement) dépend tout d’abord de la distribution asymétrique des différents types de nucléoporines sur les faces nucléaire et cytoplasmique du pore. Les karyophérines (Kap) sont une famille de transporteurs qui reconnaissent des séquences NLS ou NES spécifiques : les importines assurent le transfert du cytoplasme dans le noyau, et les exportines exercent la fonction inverse. Plus d’une vingtaine de ces transporteurs ont été identifiés dans les cellules humaines. Ces molécules fixent par leur domaine C-terminal la molécule « cargo », et par leur domaine N-terminal la protéine RanGTP/GDP qui joue un rôle clef dans l’adressage nucléaire ou cytoplasmique du « cargo ». La molécule Ran appartient à la famille des petites protéines G à fonction GTPase, capables d’hydrolyser le GTP en GDP. Le sens du transfert dépend du gradient de concentration des Ran-GTP/Ran-GDP et de l’affinité différentielle des exportines et importines pour ces deux conformations. Le recyclage de Ran est essentiel au maintien de ces deux formes entre noyau et cytoplasme.
➢ Les importines fixent leur cargo dans le cytoplasme selon un mécanisme qui dépend de Ran-GDP. Après transfert dans le noyau, elles le libèrent après conversion de la conformation Ran-GDP en Ran-GTP par l’action d’une enzyme de phosphorylation (RCC1).
➢ Les exportines, au contraire fixent leur cargo dans le noyau sous l’effet de Ran-GTP. Après transit à travers les pores nucléaires, elles le libèrent suite à l’activation de l’activité GTPase de Ran qui convertit Ran-GTP en Ran-GDP. Dans le cytoplasme, cette activité GTPasique est induite par un activateur appelé GAP (GTPase Activating Protein) localisé sur la face cytoplasmique du pore.
Interactions des pores nucléaires avec la lamina
Dans les cellules de vertébrés, des études ont été menées sur la stabilité du réseau formé par les pores nucléaires (Suntharalingam and Wente, 2003). Une fois assemblés, les NPCs se présentent comme immobiles en interphase, dans le plan de l’enveloppe nucléaire (Daigle et al., 2001). Un postulat a été émis selon lequel les lamines associées à la membrane nucléaire interne serviraient d’ancre aux NPCs dans l’architecture intranucléaire. Cette hypothèse a été étayée par les études dans S. cerevisiae où il n’y a pas de lamina nucléaire. Ces études indiquent que la mobilité latérale des NPCs dans les levures est plus importante (Belgareh and Doye, 1997; Bucci and Wente, 1997). De même, chez la drosophile, en l’absence de lamina sauvage, les NPCs se regroupent en foyer sur l’enveloppe nucléaire (Lenz-Bohme et al., 1997). Il a aussi été montré que les nucléoporines Nup153 et Nup53 interagissent avec les lamines et qu’elles pourraient ainsi participer à l’ancrage des pores dans la lamina (Hawryluk-Gara et al., 2005; Smythe et al., 2000).
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
CHAPITRE 1 : L’ENVELOPPE NUCLEAIRE, STRUCTURE ET FONCTIONS
I. LA MEMBRANE NUCLEAIRE EXTERNE EST ESSENTIELLE AU POSITIONNEMENT DU NOYAU
II. LES PORES NUCLEAIRES ET LE TRANSPORT NUCLEO-CYTOPLASMIQUE
1. Structures des pores
2. Transport nucléo-cytoplasmique
3. Interactions des pores nucléaires avec la lamina
III. LES PROTEINES DE LA MEMBRANE NUCLEAIRE INTERNE
1. Le LBR
2. Les LAPs
3. L’émerine
4. MAN1
IV. LA LAMINA NUCLEAIRE
1. Les gènes des lamines
2. Le rôle des lamines
A. Les lamines déterminent la taille et la forme du noyau
a – La forme du noyau
b – La taille du noyau
c – Résistance à la déformation
B. Association des lamines avec l’ADN et la chromatine
C. La dynamique des lamines pendant le cycle cellulaire
a – Dynamique en interphase
b – Dynamique pendant la mitose
3. La structure
A. Structure primaire
B. La polymérisation des lamines
C. Structure tridimensionnelle
4. Les modifications post-traductionnelles des lamines
5. Les laminopathies
A. Les myopathies
B. Les lipodystrophies
C. Neuropathie périphérique
D. Les syndromes de vieillissement prématuré
a – Les progérias
b – La dysplasie acromandibulaire
c – Dermopathie restrictive
E. Les mécanismes des laminopathies
V. ENVELOPPE NUCLEAIRE ET REGULATION DE LA TRANSCRIPTION
1. Les lamines, régulatrices de la transcription
A. Lamine, LAP2 et Rb
B. Les lamines de type A et SREBP1
2. LAP2 sert d’intermédiaire à la répression des gènes
3. L’émerine interagit avec des régulateurs de la transcription
4. MAN1, les lamines et les R-Smads : rôle de l’enveloppe nucléaire dans la transduction du signal
A. Rappels sur les protéines R-Smads
B. Lamines et Smads
C. MAN1 dans la transduction du signal
CHAPITRE 2 : ANALYSE DE LA REGION C-TERMINALE NUCLEOPLASMIQUE DE MAN1 HUMAINE
I. INTRODUCTION
II. CARACTERISATION STRUCTURALE DE LA REGION C-TERMINALE DE MAN1
1. Résultats préliminaires non publiés
A. Le premier domaine est replié d’après le Dichroisme Circulaire
B. L’ensemble de la région C-terminale contient un seul domaine structuré
2. Articles publiés
A. The carboxyl-terminal nucleoplasmic region of MAN1 exhibits a DNA binding winged helix domain
B. Lettre to the Editor: 1H, 13C and 15N resonance assignments of the region 655-
775 of human MAN1
3. Résultats complémentaires non publiés
A. La conservation en séquence de la région C-terminale de MAN1
B. Modélisation du domaine UHM
C. Essais de cristallogenèse
D. Modélisation du complexe MAN1/R-Smads
E. Essais de production et de purification du domaine MH2 de Smad3
CHAPITRE 3 : CARACTERISATION DES INTERACTIONS DE LA LAMINE A/C ET SES PARTENAIRES
I. INTRODUCTION
II. INTERACTION DE LA PARTIE « QUEUE » DES LAMINES A/C AVEC SES PARTENAIRES
1. Analyse de séquence du domaine de type immunoglobuline
2. Caractérisation structurale en solution de la partie « queue »
3. Analyse de l’interaction entre la lamine de type A et l’émerine
A. Mise au point des conditions d’expression de l’émerine 1-187
a – Les constructions issues de la plate-forme
b – La construction TEV#1
B. Caractérisation structurale de l’émerine : étude par RMN
C. Interaction émerine-lamine par pulldown
4. Analyse de l’interaction entre la lamine de type A et SREBP1
A. Interaction in vitro par pulldown
B. Cartographie de l’interaction lamine/SREBP1
III. CARACTERISATION D’UN MUTANT DES LAMINES DE TYPE A : R439C
1. Article: The FPLD-associated R439C LMNA mutation causes lamin oligomerisation that interferes with DNA binding (submitted to Human Mutation)
2. En cours : à la recherche des ponts disulfures de la lamine in vivo
CHAPITRE 4 : CONCLUSIONS
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