Soutenance mémoire
LA GREFFE CELLULAIRE
Caractéristiques de l’ischémie
L’ischémie rénale a été réalisée de façon unilatérale. Elle était réversible et transitoire. Les brebis du groupe I ont subi 30 minutes d’ischémie et les brebis du groupe III 45 minutes.
Technique de création de l’ischémie rénale à J0
La brebis a été anesthésiée et placée en décubitus dorsal. Les zones cutanées du creux de l’aine droit ou gauche ont été largement tondues et l’asepsie chirurgicale a été obtenue par lavages successifs à l’aide de désinfectants à base de povidone iodine (Bétadine®). Un seul rein a subi une ischémie. Un cathéter percutané (Set d’introduction percutanée de cathéter, diamètre 7F / 2,3 mm, longueur 11 cm, INPUT MEDTRONIC AVE®) a été placé dans l’artère et dans la veine fémorales. L’animal a reçu un traitement anticoagulant à la posologie de 0,5 mg / kgous avons ensuite placé un guide (diamètre 0,014’’(0,36mm), longueur 190 cm, sparta/core 14 guide wire GUIDANT®) le long du cathéter guide artériel jusque dans les ramifications de l’artère rénale au sein du parenchyme (cf. figure 3). Enfin, nous avons chargé un cathéter à ballonnet (cathéter de dilatation à ballonnet à échange rapide, longueur du cathéter 139 cm, diamètre du ballon 4,0 mm ; longueur du ballon 20 mm ; pression d’insufflation 12 atm ; compatible avec un guide de 0,014 (0,36 mm) Medtronic® AVE) sur le guide. Le ballon a été placé proximalement dans l’artère rénale et gonflé à l’aide d’un mélange équivolumique de Télébrix® et de NaCl (cf. figure 4). Le ballon a été maintenu gonflé à une pression optimale de 12 atmosphères à l’aide d’un insufflateur à manomètre. Une injection de liquide de contraste dans l’artère rénale en amont du ballonnet a permis de contrôler l’efficacité de l’occlusion. Le flux sanguin a été ainsi interrompu pendant 30 ou 45 minutes jusqu’au retrait du ballonnet. Un contrôle angiographique a permis en fin d’intervention de s’assurer du retour du flux sanguin dans l’artère rénale. De la même façon, un cathéter thermoformé par l’opérateur (sur la base d’un cathéter type JR 4 Vistabritetip® CORDIS®) a été placé dans la veine rénale. Le cathéter veineux a permis la prise de sang pour le dosage de l’activité rénine plasmatique dans la veine rénale du rein ischémié. Les cathéters et introducteurs ont été retirés et un point de compression artériel et veineux a été appliqué pendant 10 minutes aux zones de ponction afin d’éviter les hémorragies post opératoires.
Technique d’injection des CSM dans l’artère rénale à J15
La brebis a été anesthésiée et placée en décubitus dorsal. Les zones cutanées du creux de l’aine droit et gauche ont été largement tondues et l’asepsie chirurgicale a été obtenue par lavages successifs à l’aide de désinfectants à base de povidone iodine (Bétadine®). Un seul rein a été greffé. Pour les animaux du groupe I et III c’est le rein ischémié, pour les animaux du groupe II c’est un rein au hasard. Un cathéter percutané (Set d’introduction percutanée de cathéter, diamètre 7F / 2,3 mm, longueur 11 cm, INPUT MEDTRONIC AVE®) a été placé par voie percutanée dans l’artère fémorale. L’animal a reçu un traitement anticoagulant à la posologie de 0,5 mg / kg d’héparine (Héparine Choay, Choay®) par injection intra veineuse. Sous contrôle radioscopique un cathéter guide (diamètre 6F / 2,0 mm, 100 cm, type Jodkins Right 4, JR 4 Vistabritetip® CORDIS®) a été introduit jusque dans l’artère rénale. Un contrôle angiographique a été réalisé à l’aide d’une injection de 3 ml de produit de contraste radio opaque (Télébrix®) pour confirmer la perméabilité de l’artère rénale. Le cathéter guide a été alors rincé à l’aide de 20 ml de NaCl 0,9% pour éliminer les dépôts de liquide de contraste. Après préparation des CSM marquées au BrDU (5-bromo-2′-désoxyuridine) et au cmDiI (Chlorométhylbenzamido-dérivée du DiI), elles ont été mises en suspension dans 10 ml de PBS. L’homogénéisat cellulaire a été alors prélevé à l’aide d’une seringue de 10 ml et d’une aiguille de 18 gauges et injecté en respectant un temps d’injection de 2 minutes. Le cathéter guide a été à nouveau rincé une deuxième fois à l’aide de NaCl 0,9% pour le laver de son volume mort et ainsi terminer l’injection cellulaire. Le cathéter guide et l’introducteur ont été retirés et un point de compression artérielle a été appliqué pendant 10 min sur la zone de ponction afin d’éviter une hémorragie post opératoire.
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Guide du mémoire de fin d’études avec la catégorie CULTURE ET MARQUAGE CELLULAIRE |
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Table des matières
1 INTRODUCTION
2 DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES
3 OBJECTIFS DU TRAVAIL
4 MATERIEL ET METHODE
4.1 MATERIEL
4.1.1 Les animaux
4.1.1.1 Caractéristiques
4.1.1.2 Recrutement et inspection sanitaire
4.1.1.3 Identification des brebis
4.1.1.4 Hébergement des brebis
4.1.1.5 Répartition des groupes, chronologie des actes chirurgicaux et des prélèvements biologiques
4.1.2 Les cellules
4.2 METHOD
4.2.1 Le prélèvement de moelle osseuse
4.2.1.1 Anesthésie
4.2.1.2 Technique de ponction de moelle osseuse
4.2.2 Culture et amplification cellulaire
4.2.2.1 Produits utilisés.
4.2.2.2 Démarrage de la culture
4.2.2.3 Passage
4.2.3 Le marquage cellulaire
4.2.3.1 Sélection des marqueurs cellulaires
4.2.3.2 Coloration au cmDiI (Chlorométhylbenzamido-dérivée du DiI
4.2.3.3 Coloration au DAPI (4′-6-diamidino-2-phénylindole)
4.2.3.4 Coloration au BrdU (5-bromo-2′-désoxyuridine)
4.2.3.5 Evaluation in vitro des marqueurs
4.2.3.5.1 Expériences de dilution (principe)
4.2.3.5.2 Expérience de recaptage (principe)
4.2.3.6 Contrôle du marquage avant greffe cellulaire
4.2.4 Modèle expérimental d’ischémie rénale
4.2.4.1 Caractéristiques de l’ischémie
4.2.4.2 Technique de création de l’ischémie rénale à J0
4.2.5 Technique d’injection des CSM dans l’artère rénale à J15
4.2.6 Technique d’injection intraparenchymateuse des CSM à J15
4.2.7 Sacrifice, prélèvement des animaux
4.2.8 Traitement des reins prélevés
4.2.8.1 Evaluation macroscopique
4.2.8.2 Evaluation microscopique
4.2.8.2.1 Evaluation microscopique des lésions d’ischémie rénale.
4.2.8.2.2 Repérage : évaluation microscopique de l’ensemencement du parenchyme rénal par les CSM injectées
4.2.8.2.3 Identification cellulaire
4.2.9 Traitement des prélèvements sanguins
4.2.9.1 Réalisation des dosages d’urée et de créatinine plasmatique
4.2.9.2 Réalisation des dosages de l’activité rénine plasmatique (ARP)
4.2.10 Méthode statistique
5 RESULTATS
5.1 MODELE D’ISCHEMIE RENALE
5.1.1 Résultats des dosages d’urée et de créatinine plasmatique
5.1.2 Résultats du dosage de l’activité rénine plasmatique
5.1.3 Résultats de l’évaluation anatomopathologique des lésions rénales
5.2 CULTURE ET MARQUAGE CELLULAIRE
5.2.1 Culture cellulaire
5.2.2 Le marquage cellulaire
5.2.2.1 Résultats du contrôle du marquage des cellules avant greffe
5.2.2.2 Expérience de dilution
5.2.2.3 Expérience de recaptage
5.3 RESULTATS DE LA GREFFE CELLULAIRE
5.3.1 Résultats de la méthode de greffe par voie intra artérielle
5.3.1.1 Repérage des cellules
5.3.1.2 Identification des cellules
5.3.2 Résultats de la méthode de greffe par voie intra-parenchymateuse
6 DISCUSSION
6.1 CHOIX DE LA POPULATION DES CS
6.2 LA VOIE DE GREFFE CELLULAIRE
6.3 CHOIX DES MARQUEURS
6.4 NOMBRE DE CELLULES INJECTEES
6.5 MODELE D’ISCHEMIE REPERFUSION
6.6 DEVENIR CELLULAIRE
6.6.1 Rendement de la greffe cellulaire
6.6.2 Recrutement préférentiel des CSM par le rein lésé
6.6.3 Différenciation des CSM en cellules rénales
7 CONCLUSION
8 PERSPECTIVES DU TRAVAIL
9 REFERENCES
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