La génotoxicité de la radiothérapie dans le cancer du sein

Test du micronoyau

   La détermination du TCMN en culture a été réalisée sur les échantillons T0 et T2. Ces échantillons de sang héparinés, envoyés au laboratoire dans un délai de 2 heures, ont été utilisés pour l’établissement des cultures de lymphocytes. Un aliquot de sang total a été transféré dans des flasques et incubé à 37°C pendant 44 heures dans du X-Vivo 10 (Lonza Verviers, Sprl, Belgique) avec 1% d’héparine (Sigma Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France) et 1% de phytohématgglutinine. (Sigma Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France). Les cellules ont été traitées avec de la cytochalasine B (Sigma Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France) et incubées pendant 24 h à 37 °C. A la fin de l’incubation, les cellules ont été centrifugées (220 g, 10 min à 20 °C), puis traitées avec du KCl 0,075 mM et centrifugées à nouveau (150 g, 1 min à 20 °C) avant que le surnageant ne soit jeté. Les échantillons ont ensuite été traités avec un fixateur (méthanol : acide acétique 3 : 1) pendant 20 min à 4°C et centrifugés (300 g, 10 min, 20°C). Les culots cellulaires ont été remis en suspension dans un fixateur et stockés à 4°C. Les lymphocytes dans le fixateur frais ont été déposés sur des lames congelées, séchés à l’air et colorés dans du Giemsa à 2% (Sigma Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France). L’analyse MN a été réalisée en aveugle et en duplicata uniquement sur les lymphocytes avec cytoplasme préservé. Deux mille cellules binucléées (BN) ont été analysées pour chaque sujet. Les cellules ont été évaluées cytologiquement en utilisant l’approche cytomique pour évaluer le statut de viabilité (nécrose, apoptose), le statut mitotique (mononucléé, binucléé, multinucléé) et la présence demicronoyaux (23). L’indice de prolifération de la cytokinèse (CBPI) a été calculé selon la formule : CBPI = (M1 + 2M2 + 3M3) / N, où M1 – M3 représentent le nombre de cellules de 1 à 3 noyaux ou plus et N le nombre total de cellules viables analysées (à l’exclusion des cellules nécrotiques et apoptotiques). Les résultats sont rapportés sous forme de cellules MNBN / 1000 BN.

Validation de la méthode de quantification des granulocytes GPI déficients

    Les sélections successives de cellules d’intérêt nous ont permis de détecter et de quantifier la fréquence de granulocytes mutés au locus PIG-A. L’analyse d’un patient HPN (Figure 2F) et d’un volontaire sain (Figure 2G) nous ont permis d’obtenir des cytogrammes caractéristiques de suspensions cellulaires riches et pauvres en cellules mutées. Enfin, une expérience de dilution limite réalisée sur le prélèvement effectué sur le patient HPN nous a permis de démontrer que la mesure de la fréquence était stable jusque dans les dilutions où le nombre de cellules mutées sur le gène PIG-A était inférieur à 50.

Répétabilité du test

   Pour évaluer la répétabilité de la détermination de la fréquence des granulocytes GPIdéficients, des échantillons de sang sur T0 (avant le début de la radiothérapie) ont été réalisés en duplicata pour chaque patiente. Pour 4 patientes, les données n’étaient pas disponibles en raison d’un problème technique sur une des deux analyses. Les moyennes des variances et de l’écart-type étaient de 13,95 x 10-12 et 2,29 x 10-6, avec une répétabilité de la détermination de la fréquence des granulocytes GPI-déficients pour une patiente de 2,29 x 10-6.

CONCLUSION

   Malgré un test robuste, nos résultats suggèrent que le test PIG-A sur granulocytes ne permet pas de mettre en évidence un stress génotoxique radio-induit, dans une population de patientes traitées par radiothérapie externe à visée thérapeutique. La confirmation du caractère génotoxique de l’irradiation mammaire par le test du MN encourage à évaluer le test PIG-A dans d’autres contextes d’expositions génotoxiques ou dans d’autres cellules circulantes telles que les érythrocytes ou les réticulocytes, déjà utilisés chez les rongeurs.

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Table des matières

INTRODUCTION 
MATERIELS ET METHODES
Patientes
Radiothérapie
Prélèvements
Réactifs
Immunomarquage
Test de cytométrie de flux PIG-A
Test du micronoyau
Analyse statistique des résultats
RESULTATS
Validation de la méthode de quantification des granulocytes GPI déficients
Distribution de la dose de radiothérapie dans le volume osseux selon les groupes
Caractéristiques de la population
Evaluation clinique du test PIG A
Répétabilité du test
Stabilité des prélèvements dans le temps
Effet de la radiothérapie sur la fréquence de granulocytes GPI-déficients
Effet de la chimiothérapie avant le premier prélèvement sur la fréquence de granulocytes GPI-déficients
Effet du tabac (comparaison des fumeurs et non-fumeurs et relation avec la consommation en paquet-année) et effet de l’âge, sur la fréquence de granulocytes GPI-déficients
Test du micronoyau
Effet de la radiothérapie sur le TCMN
Effet de la chimiothérapie avant le premier prélèvement sur le TCMN
Effet du tabac (comparaison des fumeurs et non-fumeurs et relation avec la consommation en paquet-année) et effet de l’âge, sur le TCMN
DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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