La flore et les champignons de Guyane

Préparation des échantillons pour les études moléculaires

Les 80 échantillons de carpophores secs ont été réduits en poudre, de façon stérile, puis broyés dans l’azote liquide. Les 27 échantillons de souches pures (mycélium pur) ont été broyés également avec l’azote liquide. Nous avons placé ensuite 100 mg de poudre fine obtenue de chaque échantillon de carpophore ou de mycélium pur dans un tube Eppendorf stérile de 1,5 mL. Ils ont été stockés au congélateur à -80°C pour les étapes ultérieures. 2.2.2. Extraction de l’ADN fongique.
La méthode d’extraction de l’ADN par le protocole de Kit Invitrogen(1) « Pure Link Plant Total DNA Purification Kit » (http://www.invitrogen.com/) pour les plantes a été choisi pour cette étude. Ce protocole permet d’obtenir un culot clair et sans pigments. Le kit Invitrogen contient : du tampon de resuspension R2 (EDTA, sodium chlorite et TRIS), du SDS à 20%, de l’ARNase (20mg/ml), du tampon de précipitation N2, du tampon de liaison B4 (Guanidine, HCL 7,5ml, 11,25ml d’éthanol), du tampon de lavage W4 qui contient du thiocyanate, du tampon de lavage W5 (10 ml de W4 avec 40ml d’éthanol ajouté) et du tampon d’élution E1. Cette étape dure environ 2h (le protocole d’extraction est présenté en Annexe 1). Tous les ADN totaux après cette extraction ont été stockés au congélateur à -20°C. 2.2.3. La quantification de l’ADN total Après l’extraction de l’ADN total, l’ADN est quantifié par un spectrophotomètre SHIMATZU (Figure 9). Il donne directement la valeur de la concentration en ADN de l’échantillon pour une lecture immédiate du résultat. Il mesure la concentration et la pureté de l’ADN extrait avec 3μl d’échantillon en indiquant un ratio d’absorbance à 260nm et 280nm. Ce ratio 260/280 doit se rapprocher de 1,8 pour qualifier les échantillons de pur. Des valeurs inférieures à 1.8 indiqueraient la présence d’impuretés ou de protéines absorbantes aux environ des mêmes longueurs d’ondes.

La Polymérase Chain Reaction (PCR): amplification de l’ITS de l’ADNr nucléaire

C’est une réaction enzymatique qui permet l’amplification en chaîne d’une région spécifique de l’ADN. La PCR permet la réplication in vitro d’un fragment spécifique de l’ADN avec l’obtention en grande quantité un fragment spécifique d’ADN à partir d’une quantité initiale en ADN très faible (Mullis et Faloona, 1987). Cette méthode a été décrite initialement par Kary Mullis en 1985.
Les PCR ont été effectuées dans un volume réactionnel de 50 μL contenant 5 μL de matrice ADN, 10 μL de tampon de réaction 5 X (7,5mM de MgCl2
Il est à noter que nous avons utilisé 2 types de Taq différents, Go Taq et Taq Phusion(2U/μl à volume 50μl, FINNZYMES), pour évaluer leur efficacité respective. ,FINNZYMES), 2 μL de solution de chaque amorce : ITS4-myc et ITS1-myc (Ecerofins MWG Operon), 4 μl de solution de dNTPs (10μl de produit mère de chaque dNTP: dATP, dCTP, dGTP et dTTP 100mM dans 360μl d’eau millipore), 0,30μL de Taq polymérase thermostable, et de l’eau millipore 26,70μl pour compléter jusqu’à 50 μL. Des témoins sans ADN sont réalisés pour tester la présence d’éventuelles contaminations dans les réactifs et les tampons. L’amplification a été réalisée à l’aide d’un thermocycleur Eppendorf (Eppendorf Mastercycler). Tous les travaux de PCR ont été faits à l’aide du matériel réservé uniquement à la PCR.

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Table des matières

Préface
Remerciement
Table des matières
Liste des figures
Liste des tableaux
Liste des abréviations
I. Introduction
1.1. Présentation du projet CIRAD
1.2. Intérêt et objectif du projet
1.3. Objectif du stage
1.4. Etat de l’art
1.4.1. La flore et les champignons de Guyane
1.4.2. Les champignons
1.4.2.1. Caractères généraux
1.4.2.2. Les champignons lignivores
a. La pourriture cubique ou brune
b. La pourriture fibreuse ou blanche
c. La pourriture molle
1.4.3. Les régions moléculaires spécifiques étudiées
II. Matériels et méthodes
2.1. Matériel biologique
2.1.1. Echantillons et lieux d’étude
2.2.2. La récolte des champignons lignivores en Guyane
2.2.3. La conservation des échantillons au laboratoire
2.2. Méthode moléculaire
2.2.1. Préparation des échantillons pour les études moléculaires
2.2.2. Extraction de l’ADN fongique
2.2.3. Quantification de l’ADN total par spectrophotométrie
2.2.4. La PCR : Amplification de l’ITS de l’ADNr nucléaire
2.2.5. Analyse des produits de PCR à partir de gel d’électrophorèse
2.2.6. Séquençage
2.2.7. Analyse et alignement des séquences
2.2.8. Analyse des séquences par comparaison (BLAST) avec les banques de données (GENBANK)
2.2.9. Constitution d’un fichier de séquences de référence
III.Résultats et discussions
3.1. Extraction de l’ADN fongique et les résultats de quantification de l’ADN total
3.2. La PCR et l’analyse des produits de PCR à partir de gel d’électrophorèse
3.3. Le séquençage
3.4. Analyse et alignement des séquences
3.5. Analyse des séquences par comparaison (BLAST)
IV.Conclusions et perspectives
Références bibliographiques
Les annexes
Résumé et abstact