La famille des Anacardiaceae

La famille des Anacardiaceae

Partie expérimentale:

Méthodes chromatographiques analytiques:

Chromatographie sur couche mince (CCM) Le criblage phytochimique pour P. atlantica, S. lanatus et E. confusum a été réalisé sur des plaques CCM commerciales composées d’un support en aluminium sur lequel a été étalée une fine couche de silice (Silicagel 60) avec un indicateur de fluorescence F254 comme phase stationnaire (Merck). Les échantillons ont été déposés sous forme de trait d’un centimètre à une quantité de 250 µg pour les extraits bruts et 100 µg pour les produits purifiés à 1,5 cm du bout de la plaque. La plaque CCM est développée dans des cuves en verre (Camag), dont l’atmosphère aura préalablement été saturée en vapeurs de la phase mobile (30 à 60 min). La phase mobile est un mélange binaire ou ternaire ou quaternaire de solvants, adaptée au type de séparation ou classe phytochimique recherchée.

Les analyses par CCM ont été aussi conduites pour la recherche des phases mobiles qui seront utilisées pour l’isolement et la purification des produits à partir des extraits bruts de P. atlantica, S. lanatus et E. confusum sur colonne ou CCM préparative. Dans ce cas en plus de la phase stationnaire citée ci-dessous, une fine couche d’un milieu de sorption la silice (Silicagel 60) modifiée chimiquement par greffage de résidus octadécyliques (C-18 ou RP18) sur les groupes silanols (phase inverse) avec un indicateur de fluorescence F254 a été utilisée comme phase stationnaire (Merck). Ce type de plaque est développé uniquement par un système de solvants binaires MeOH-H2O dans notre travail.

Chromatographie liquide à haute performance couplée à la détection UV-visible à barrettes de diodes (HPLC-DAD-UV):

Le détecteur spectroscopique Ultraviolet-visible (UV-vis) est considéré comme un détecteur universel pour n’importe quel système de HPLC. La détection par PDA (photodiode array) est une technique avancée de détecteur UV-vis, qui peut être couplée à une HPLC pour former le couplage de la technique HPLC-PDA, également connue sous le nom LC-PDA. Au cours des deux dernières décennies, la détection en ligne par PDA a été employée pour l’analyse d’extraits bruts de produits naturels d’origines diverses. Une HPLC-PDA est extrêmement utile pour l’analyse des produits naturels contenant des chromophores comme les composés phénoliques, y compris les flavonoïdes, les isoflavonoïdes, les coumarines, les ptérocarpanes, etc. Un détecteur de PDA peut aider à analyser les pics individuels de l’HPLC après que l’élution soit terminée, et à obtenir le spectre UV-vis complet des composés individuels. L’ensemble du chromatogramme à plusieurs longueurs d’onde peut être récupéré à partir des fichiers de données après analyse. Le temps de rétention de l’HPLC et le spectre UV-vis de n’importe quel composé (LC pic) peuvent être des caractéristiques de certains composés. Un détecteur de PDA permet également la génération de données 3D UV, typiquement constituées par les spectres d’absorption UV de 190 à 500 nm, pour chaque point le long du chromatogramme HPLC. Les données peuvent être visualisées rapidement pour les régions d’absorption uniques en corrélation avec des composés spécifiques ou des groupes fonctionnels. Les chromatogrammes indépendants peuvent également être construits pour chaque longueur d’onde pour augmenter la sélectivité des données. Les données UV peuvent être complétées par les données sélectives de la MS (mass spectrometry) ou la RMN (résonance magnétique nucléaire). Le choix de la phase mobile de l’HPLC est crucial pour le fonctionnement de l’HPLC-PDA et doit être fait en fonction de sa propre absorption de l’UV, de sorte que toute interférence de la phase mobile peut être évitée. Les systèmes HPLC-PDA modernes sont gérés par un logiciel sophistiqué qui permet de construire des bibliothèques spectrales pour des composés de référence et la recherche automatisée des composés (Sarker et Nahar, 2006).

Chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse (HPLC-API-ES-MS):

Aujourd’hui, une variété de spectromètres de masse est disponible. En raison de la complexité des métabolites en ce qui concerne la variabilité de leurs propriétés chimiques et physiques ainsi que leur concentration, aucune plate-forme analytique ne peut répondre à toutes les questions. Néanmoins, MS est un outil puissant qui gagne de plus en plus d’importance. La fonctionnalité d’un spectromètre de masse peut être considérée comme un processus en quatre étapes, l’entrée de l’échantillon, le transfert en phase gazeuse par la source d’ions, l’analyseur de masse et finalement le détecteur. Cela conduit à différents fragments qui sont importants pour l’utilisateur. L’entrée de l’échantillon et la source d’ions définissent les exigences pour la concentration de l’échantillon, la matrice, et le prétraitement. Le détecteur de masse et les systèmes d’analyse sont définis par le fabricant du spectromètre de masse et ne sont normalement pas interchangeables.

En règle générale, une classification en hors-ligne (off-line) comme l’infusion directe par spectrométrie de masse (DIMS: direct-infusion mass spectrometry), MALDI-MS et le couplage en ligne de la chromatographie à la MS comme l’HPLC-MS est possible. En HPLCMS ce qu’on appelle la source d’ion accomplit le transfert des analytes à partir de la solution à la pression atmosphérique à la phase gazeuse à la pression du vide avec l’ionisation simultanée (Stecher et al., 2011).

Méthodes chromatographiques séparatives:

Depuis la découverte de la chromatographie par M.S. Tswett il ya plus d’un siècle, des progrès remarquables ont été observés dans ce domaine. La chromatographie s’est développée de façon significative à travers le travail révolutionnaire d’Archer J. Porter Martin et Richard L.M. Synge durant les années 1940-1950 sur les principes fondamentaux et les méthodes de base de la chromatographie de partage. De la première utilisation de papier filtre pour examiner les pigments végétaux au développement des plus modernes colonnes de haute performance et les gels d’affinité, la chromatographie continue à jouer un rôle important dans la séparation des composés de mélanges complexes, tels que des extraits de produits naturels. Avant les années 1970, il n’y avait que quelques méthodes chromatographiques fiables disponibles dans le commerce. Pendant les années 1970, la plupart des séparations chimiques utilisaient une variété de techniques incluant la chromatographie sur colonne ouverte (CC), la chromatographie sur papier, et la CCM. Le concept de la chromatographie liquide à pression qui consiste à économiser le solvant d’élution et par conséquent réduire le temps de purification des composés étant isolés par CC, a commencé à se tourner vers la réalité (Reid et Sarker, 2012).

Conclusion & perspectives :

Au cours de ce travail, ayant pour objectif de rechercher des extraits de plantes présentant une activité inhibitrice de l’acétylcholinestérase (AChE), trois extraits bruts provenant de trois plantes médicinales Pistacia atlantica Desf., Solenanthus lanatus A.DC. et Echium confusum de Coincy. ont été évalués par le test de bioautographie et l’essai en solution par la méthode d’Ellman. Les trois plantes se sont révélées actives de façon significative .

Dans cette étude, le fractionnement bioguidé a été entrepris pour ces trois plantes et a permis l’isolement de vingt produits. Dans un premier temps, le fractionnement de l’extrait aqueux de P. atlantica, en suivant son activité inhibitrice de l’AChE, a permis la purification
et l’identification principalement des dérivés de l’acide gallique et de la quercétine (produits I-VIII). Le fractionnement bioguidé de l’extrait éthanolique de S. lanatus a conduit à l’isolement et à la caractérisation de quatre alcaloïdes pyrrolizidiniques, produits IX, X, XI et XII dont un nouveau produit naturel: 7-angeloylechinatine N-oxyde (produit X). A notre connaissance, ces alcaloïdes pyrrolizidiniques ont été caractérisés pour la première fois dans le genre Solenanthus. De même, le fractionnement bioguidé de l’extrait éthanolique d’E. confusum a conduit à l’isolement et à la purification de huit alcaloïdes pyrrolizidiniques, produits XIII-XX. Les alcaloïdes pyrrolizidiniques se retrouvent dans un grand nombre de plantes supérieures, et sont surtout très présents dans la famille Boraginaceae.

Les plantes étudiées dans le présent travail, ainsi que les divers produits naturels isolés ont montré des potentialités intéressantes. Dans ce contexte, l’étude des genres Pistacia, Solenanthus et Echium est encourageante pour la recherche de nouvelles molécules actives. Les travaux effectués ont donc permis de mettre en évidence la présence de produits inhibant l’activité de l’AChE dans les plantes étudiées. Les molécules isolées appartiennent à deux classes phytochimiques: polyphénols et alcaloïdes. Il est possible que ces produits possèdent un mode d’action différent. Ce travail ouvre de nouvelles perspectives quant à l’utilisation de molécules naturelles dans le traitement de la MA.

 

 

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Table des matières

Chapitre 1: Introduction générale 
Chapitre 2: Etude bibliographique
2.1. Plantes étudiées
2.1.1. La famille des Anacardiaceae
2.1.1.1. Introduction
2.1.1.2. Classification systématique, description botanique et distribution
2.1.1.2.1. Taxonomie et phylogénie
2.1.1.2.2. Description botanique
2.1.1.2.3. Distribution
2.1.1.3. Importance économique
2.1.1.4. Utilisations médicinales et effets biologiques et pharmacologiques
2.1.1.5. Toxicité
2.1.1.6. Principaux métabolites secondaires isolés de la famille Anacardiaceae
2.1.2. Le genre Pistacia (Pistachier)
2.1.2.1. Présentation
2.1.2.2. Utilisations médicinales et effets biologiques et pharmacologiques
2.1.2.3. Etudes phytochimiques antérieures et principaux métabolites secondaires isolés
2.1.2.4. Pistacia atlantica Desf.
2.1.2.4.1. Description botanique, distribution et habitat
2.1.2.4.2. Utilisations médicinales
2.1.2.4.3. Propriétés biologiques et pharmacologiques
2.1.2.4.4.Etudes phytochimiques antérieures et principaux métabolites secondaires isolés
2.1.3. La famille Boraginaceae
2.1.3.1. Introduction
2.1.3.2. Classification systématique, description botanique et distribution
2.1.3.2.1. Taxonomie et phylogénie
2.1.3.2.2. Description botanique
2.1.3.2.3. Distribution
2.1.3.3. Importance économique
2.1.3.4. Utilisations médicinales et effets biologiques et pharmacologiques
2.1.3.5. Toxicité
2.1.3.6. Principaux métabolites secondaires isolés de la famille Boraginaceae
2.1.4. Le genre Echium (Vipérine) ix
2.1.4.1. Présentation
2.1.4.2. Utilisations médicinales et effets biologiques et pharmacologiques
2.1.4.3. Etudes phytochimiques antérieures et principaux métabolites secondaires isolés
2.1.4.4. Echium confusum de Coincy
2.1.4.4.1. Description botanique, distribution et habitat
2.1.4.4.2. Utilisations médicinales
2.1.4.4.3. Propriétés biologiques et pharmacologiques
2.1.4.4.4. Etudes phytochimiques antérieures et principaux métabolites secondaires isolés
2.1.5. Le genre Solenanthus (Solenanthes)
2.1.5.1. Présentation
2.1.5.2. Utilisations médicinales et effets biologiques et pharmacologiques
2.1.5.3. Etudes phytochimiques antérieures et principaux métabolites secondaires isolés
2.1.5.4. Solenanthus lanatus A.DC.
2.1.5.4.1. Description botanique, distribution et habitat
2.1.5.4.2. Utilisations médicinales
2.1.5.4.3. Propriétés biologiques et pharmacologiques
2.1.5.4.4.Etudes phytochimiques antérieures et principaux métabolites secondaires isolés
2.2. Maladie d’Alzheimer: diagnostic, neuropathologie, et stratégies thérapeutiques
2.2.1. Historique
2.2.2. Diagnostic
2.2.2.1. Les manifestations cliniques
2.2.2.2. Tests neuropsychologiques
2.2.2.3. L’imagerie cérébrale
2.2.3. Neuropathologie
2.2.3.1. Le peptide amyloïde-beta
2.2.3.2. Dégénérescences neurofibrillaires
2.2.3.3. Altération des systèmes de neurotransmetteurs
2.2.3.3.1. Les cellules du système nerveux
2.2.3.3.2. Transmission synaptique
2.2.3.3.3. Atteinte des systèmes de neurotransmetteurs
2.2.3.4. Pathologie liée à l’altération de l’homéostasie du calcium
2.2.4. Causes et facteurs de risque de la maladie d’Alzheimer
2.2.4.1. Facteurs génétiques
2.2.4.2. Facteurs biologiques et environnementaux
2.2.4.2.1. L’âge
2.2.4.2.2. Le sexe
2.2.4.2.3. L’hypertension
2.2.4.2.4. La glycémie et le diabète
2.2.4.2.5. L’alimentation
2.2.4.2.6. Le cholestérol
2.2.4.2.7. L’obésité
2.2.4.2.8. Les œstrogènes
2.2.4.2.9. Infection virale
2.2.4.2.10. Traumatisme crânien
2.2.4.2.11. Métaux
2.2.5. Traitements et pistes thérapeutiques de la maladie d’Alzheimer x
2.2.5.1. Régulation du calcium
2.2.5.2. Inhibition de la formation du peptide Aβ
2.2.5.2.1. Inhibition des sécrétases
2.2.5.2.2. Vaccination contre le peptide Aβ
2.2.5.2.3. Inhibition de l’agrégation du peptide Aβ
2.2.5.3. Réduire les dégénérescences neurofibrillaires
2.2.5.4. Anti-inflammatoires non-stéroïdiens
2.2.5.5. Les antioxydants
2.2.5.6. Composés réduisant le niveau du cholestérol
2.2.5.7. Les inhibiteurs de la monoamine oxydase
2.2.5.8. Thérapie par remplacement hormonal
2.2.5.9. Les inhibiteurs de l’acétylcholinestérase
2.2.5.9.1. Les cholinestérases
2.2.5.9.2. Traitements actuels de la maladie d’Alzheimer basés sur l’inhibition
de l’acétylcholinestérase
2.2.5.9.3. Méthodes de détection des inhibiteurs de l’acétylcholinestérase
Chapitre 3: Partie expérimentale
3.1. Matériel végétal et extraction
3.2. Méthodes chromatographiques analytiques
3.2.1. Chromatographie sur couche mince (CCM)
3.2.2. Chromatographie liquide à haute performance couplée à la détection
UV-visible à barrettes de diodes (HPLC-DAD-UV)
3.2.3. Chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de
masse (HPLC-API-ES-MS)
3.3. Méthodes chromatographiques séparatives
3.3.1. Partage liquide-liquide
3.3.2. Chromatographie liquide sur colonne ouverte (CC)
3.3.2.1. Chromatographie d’adsorption
3.3.2.2. Chromatographie d’exclusion
3.3.3. Chromatographie liquide basse pression (LPLC)
3.3.4. Chromatographie flash (FC)
3.3.5. Chromatographie sur couche mince préparative (PTLC)
3.4. Méthodes physico-chimiques
3.4.1. Pouvoir rotatoire ([α]D)
3.4.2. Spectrométrie de masse (MS)
3.4.3. Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN)
3.5. Tests de l’activité inhibitrice de l’acétylcholinestérase
3.5.1. Méthode bioautographique au Fast Blue B
3.5.2. Méthode d’Ellman par spectrométrie
3.6. Dosage des polyphénols totaux
3.7. Dosage des flavonoïdes
3.8. Analyse statistique
3.9. Constantes physiques et données spectrales des produits isolés
Chapitre 4: Résultats et discussion
4.1. Préparation des extraits bruts
4.2. Investigation phytochimique de l’extrait aqueux des feuilles de P. atlantica xi
4.2.1. Analyses CCM de l’extrait aqueux des feuilles de P. atlantica
4.2.2. Analyses HPLC-DAD-UV et HPLC-API-ES-MS de l’extrait aqueux et
fractions issus des feuilles de P. atlantica 1
4.2.2.1. Extrait aqueux
4.2.2.2. Fraction acétate d’éthyle 1
4.2.2.3. Fraction n-butanol
4.2.2.4. Fraction aqueuse
4.2.3. Fractionnement bio-guidé de l’extrait aqueux des feuilles de P. atlantica et
isolement des produits I-VIII 170
4.2.3.1. Fractionnement bio-guidé de la fraction aqueuse et isolement des produits
I-III 172
4.2.3.2. Fractionnement bio-guidé de la fraction acétate d’éthyle et isolement des
produits II, IV-VIII
4.3. Investigation phytochimique de l’extrait éthanolique de la plante entière de
S. lanatus et E. confusum
4.3.1. Analyses CCM de l’extrait éthanolique de la plante entière de S. lanatus et
E. confusum
4.3.2. Fractionnement bio-guidé de l’extrait éthanolique de la plante entière de
S. lanatus et isolement des produits IX-XII
4.3.3. Interprétations des spectres et détermination de la structure des produits IX-XII
4.3.3.1. Détermination de la structure du produit IX
4.3.3.2. Détermination de la structure du produit X
4.3.3.3. Détermination de la structure du produit XI
4.3.3.4. Détermination de la structure du produit XII
4.3.4. Fractionnement bio-guidé de l’extrait éthanolique de la plante entière
d’E. confusum et isolement des produits XIII-XX
4.4. Activité inhibitrice de l’acétylcholinestérase des extraits bruts, fractions et
produits des plantes étudiées
4.4.1. Test de l’activité inhibitrice de l’acétylcholinestérase par bioautographie
4.4.1.1. Extrait aqueux, fractions et produits purifiés de P. atlantica
4.4.1.2. Extrait éthanolique, fractions et produits purifiés de S. lanatus
4.4.1.3. Extrait éthanolique, fractions et produits purifiés d’E. confusum
4.4.2. Test de l’activité inhibitrice de l’acétylcholinestérase par dosage
spéctrophotométrique
4.5. Quantification des polyphénols totaux dans les extraits des plantes étudiées
4.6. Quantification des flavonoïdes totaux dans les extraits bruts des plantes étudiées
Conclusion et perspectives

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