Soutenance mémoire
La diversité chez les champignons pathogènes des plantes
Les bananiers
Importance socio-économique
D’après les estimations 1998-1999, la production mondiale de bananes s’élève à environ 88 millions de tonnes (Lescot, 2000). Les bananes consommées à l’état frais (bananes de type «dessert ») représentent 54% de cette production, tandis que les bananes à cuire dont les variétés les plus connues appartiennent au sous-groupe des plantains (AAB) en constituent 46%. Ces dernières constituent un aliment de base essentiel pour de nombreuses populations de la zone tropicale. Toutes catégories de bananes confondues, avec 11 Mt (estimations 1998-1999) l’Inde est le premier pays producteur devant l’Ouganda (10 Mt), le Brésil (5.6 Mt) et l’Equateur (5.4 Mt).
Environ 14.5% de cette production mondiale fait l’objet d’exportations internationales, les «bananes dessert » en représentant la quasi totalité. Cultivées aussi bien dans des systèmes intensifs de type monocultural que dans des «jardins vivriers » extensifs (culture mixte), elles sont présentes tant en zone tropicale qu’en zone subtropicale où bien souvent elles constituent pour de nombreux pays, une importante source de devises. L’Equateur est le premier pays exportateur de « bananes dessert » avec 3.9 Mt, devant le Costa-Rica (2 Mt) et la Colombie (1.6Mt).
La banane de type « dessert » occupe ainsi le troisième rang de la production fruitière mondiale derrière les agrumes et les raisins, et le second, toujours après les agrumes, quant au volume échangé sur les marchés internationaux. Elle fait l’objet d’une âpre concurrence sur le marché international entre les pays de la zone dollar (essentiellement l’Amérique latine), ceux de la zone Europe, et les pays ACP (Afrique, Caraïbe, Pacifique). D’un intérêt économique extrêmement sensible, elle est au centre de dissensions maintenant chroniques entre l’OMC (Organisation Mondiale du Commerce) et l’OCMB (Organisation Commune des marchés de la Banane de la CE.E.) quant aux règles d’approvisionnement du marché européen.
Systématique et organisation génétique – Eléments de botanique
– Systématique – Organisation génétique
Originaires d’Asie du Sud-Est, les bananiers sont des monocotylédones qui appartiennent au genre Musa et la famille des Musaceae (Jenny et al., 1999). Les Musaceae constituent, avec les 3 familles proches que sont les Strelitziaceae, les Zingiberaceae et les Heliconiaceae, l’ordre des Zingibérales. Le genre Musa comprend 4 sections parmi lesquelles la section Eumusa qui comporte la majorité des bananiers comestibles car à fruits parthénocarpiques, et leurs ancêtre sauvages séminifères Musa acuminata et Musa balbisiana.
Par leur apport respectif d’un génome A ou d’un génome B, ces deux espèces M. acuminata et M. balbisiana sont considérées comme étant à l’origine d’une grande partie des clones cultivés pour leurs fruits comestibles, les espèces M. schizocarpa et celles de la section Australimusa fournissant respectivement les génomes S et T qui ne se retrouvent que chez de rares clones (Jenny et al., 1999). Les variétés cultivées sont parthénocarpiques et souvent fortement stériles. Leur reproduction est assurée par la voie végétative. Elles sont surtout triploïdes (AAA, AAB, ABB) ou diploïdes (AA et plus rarement AB ou BB). Dans de nombreuses régions du monde, les variétés de bananes de « type dessert » les plus utilisées sont celles faisant partie du sous-groupe Cavendish, avec en particulier les cultivars « Grande-Naine » et « Poyo ».
– Botanique
Herbes géantes pouvant atteindre 15 m de hauteur (figure 6), les bananiers ont un pseudo-tronc constitué par l’imbrication des longues gaines de leurs feuilles. Le méristème apical est localisé au centre de ce pseudo-tronc au niveau du collet de la plante (Stover et Simmonds, 1987).
Le bouquet foliaire est constitué de quinze à vingt feuilles au limbe allongé, et dont l’émission est relayée par la sortie de l’inflorescence ou régime. Celle-ci est d’abord composée de plusieurs rangées de fleurs femelles ou « mains » dont l’ovaire hyper-développé donnera le fruit consommé, la banane. Viennent ensuite des fleurs mâles formant ce que l’on appelle communément le bourgeon mâle ou « popotte ».
Le Complexe Parasitaire Racinaire des bananiers
Quelle que soit la zone de culture du bananier, on trouve associée au système racinaire une biocénose comprenant généralement des nématodes phytophages et des champignons telluriques: c’est le Complexe Parasitaire Racinaire (CPR). Ce CPR est quantitativement et qualitativement variable dans l’espace et dans le temps, du fait de la diversité des contextes pédo-climatiques dans lesquels sont cultivés les bananiers, et de celle des pratiques culturales.
Les nématodes endoparasites
Plusieurs genres et espèces de nématodes de biologie très différente sont à l’origine des peuplements nématologiques associés aux racines du bananiers (Gowen et Quénéhervé, 1990). Certains provoquent des lésions nécrotiques sur les racines et le rhizome des bananiers et à terme la chute des plants atteints. L’espèce endoparasite Radopholus similis (famille des Pratylenchideae) représente l’une des espèces de nématodes les plus dommageables pour le bananier.
Les champignons telluriques
– Fusarium oxysporum f. sp cúbense
La « maladie de Panama » est la plus grave maladie tellurique du bananier. Elle est due au complexe Fusarium oxysporum f. sp. cúbense. Après une phase purement tellurique, ces champignons pénètrent les racines et gagnent le xylème causant ainsi une trachéomycose qui entraîne le flétrissement de la plante. Cette maladie a détruit plus de 40000 ha de bananiers dans les années 1960, obligeant l’industrie bananière d’exportation a quasiment abandonner les triploïdes AAA du sous-groupe Gros-Michel, au profit de ceux du sousgroupe Cavendish (Ploetz et Pegg, 1999). Certaines races affectent cependant ces derniers (Bentley et al., 1998).
– Les pourridiés
Une seconde catégorie de champignons affectent le système souterrain des bananiers en occasionnant de véritables pourritures de racines ou de rhizomes, ou les deux à la fois. Ce sont essentiellement des Armillaires (Jones et Stover, 1999) et des Rosellinia spp. (Jones, 1999). Leur incidence n’a été rapportée que de façon occasionnelle et locale.
– Les champignons associés aux lésions nécrotiques racinaires (Root Rot Fungi) Une première catégorie de ces champignons est formée par ceux qui sont considérés comme des colonisateurs secondaires de nécroses (parasites de faiblesse) et ceux dont l’implication dans le déterminisme des nécroses est mal définie. Plusieurs inventaires dont la plupart sont déjà anciens en ont été réalisés (Goos et Timonin, 1962 ; Brun et Laville, 1965 ;
Stover, 1966 ; Loridat, 1989). En plus des Fusarium oxysporum non pathogènes qui sont des agents communs de la rhizosphère des bananiers, ce sont surtout Fusarium solani ainsi que Fusarium spp., Rhizoctonia spp., Cylindrocarpon musae qui sont cités, et plus rarement des pythiacées telles que Pythium et Phytophthora spp. Ces champignons sont impliqués aussi bien dans les nécroses affectant les racines primaires que dans celles qui occasionnent le noircissement et la mort des fines racines latérales nourricières (Jones et Stover, 1999).
Leur rôle exact dans l’étiologie des nécroses est d’autant moins défini, que leur présence est simultanée à celle de communautés plurispécifiques de nématodes phytophages, dont certaines espèces sont reconnues comme des parasites à part entière du système racinaire du bananier (Gowen et Queneherve, 1990). Ponctuellement, certains d’entre eux ont pu être désignés comme capables de générer des dégâts seuls, en l’absence de ces nématodes, mais dans des conditions particulières, comme sur de très jeunes plants (Stover, 1966). Dans d’autres cas comme par exemple dans celui de Cylindrocarpon musae, le statut de pathogène de blessure a pu clairement être établi (Booth et Stover, 1974). D’une manière générale, ces champignons sont essentiellement considérés comme des envahisseurs secondaires de nécroses générées par les nématodes endoparasites du bananier, leur action étant plus décrite comme un facteur d’extension supplémentaire des nécroses, que comme un facteur causal (Blake, 1961 ; Mateille et Folkertsma, 1991). Leur effet serait renforcé dans les sols très argileux, de structure compacte, ou en situations hydromorphes (Jones et Stover, 1999).
D’après Mateille et Folkerstma (1991), l’association dans une même nécrose d’une espèce donnée de champignons et d’une espèce particulière de nématodes serait aléatoire.
Une diversité fongique dimensionnée à l’échelle de la planète
Selon les spécialistes de la diversité fongique, il existerait aujourd’hui sur terre environ 1,5 millions d’espèces différentes de champignons (Hawksworth, 1991 ; Rossman, 1994). Seules 74000 d’entre elles, soient moins de 5 % des espèces existantes, seraient connues (Hawksworth, 2001). Chez ces dernières, le taxon des Ascomycètes est le plus important non seulement en termes de nombre d’espèces, mais aussi en termes d’applications médicales, pharmaceutiques, ou nutritionnelles (Hawksworth et Mouchacca, 1994). Estimant que le ratio espèce / genre est le même chez les Ascomycètes décrits que chez les Ascomycètes non décrits, Hawksworth et Mouchacca (1994) jugent qu’il existerait donc chez ce seul groupe, 62000 genres et 669000 espèces non encore décrits. Evaluant à environ 1700 le nombre d’espèces fongiques décrites chaque année par les systématiciens, ces auteurs indiquent qu’il faudrait donc pas moins de 390 ans pour décrire les seuls Ascomycètes ! Même si ces chiffres sont nécessairement entachés de biais liés à la définition même du concept d’espèces chez les champignons ou à des déterminations erronées (cas des taxa similaires sur le plan morphologique), ils témoignent bien de l’immensité du monde connu et inconnu des champignons.
Une diversité omniprésente chez les champignons parasites des plantes
Le nombre d’espèces fongiques connues pour être des agents pathogènes des plantes est estimé à 8000 par Agrios (1988). Price (1987) indique qu’à l’instar des autres microorganismes phytoparasites, les champignons ont par leur temps de génération courts et leurs effectifs larges mais variables (dans le temps et dans l’espace), un potentiel évolutif rapide qui a probablement facilité la divergence des populations et la spéciation.
La plante hôte représente pour une espèce fongique phytopathogène aussi bien un habitat qu’une source de nourriture, et les stratégies de parasitisme développées pour l’exploiter sont diverses. Burdon (1993) distingue par exemple 3 grandes catégories de champignons parasites : Il y a les «killers» qui tuent rapidement la plante par des fontes de semis (Pythium spp., Rhizoctonia spp.) ou des trachéomycoses. Il y a ensuite les champignons qui affectent la fécondité de la plante en infectant principalement les inflorescences et les organes reproducteurs, ce sont les «castrators» comme les charbons floraux ou l’ergot des céréales. Et enfin, il y a ceux qui l’affaiblissent de façon chronique («debilitators») avec des lésions limitées, comme les mildious et la plupart des rouilles.
Cette diversité fongique se retrouve également au niveau de la spécificité de la relation entre l’hôte et son parasite. Dans certains cas cette relation est hautement spécialisée et qualifiée de « gène pour gène » (Flor, 1956). A l’opposé, chez les champignons de genres comme Colletotrichum, il y a souvent absence de spécificité fine, et on a affaire des espèces parasites avec un large spectre d’hôtes. Sur le plan trophique, la relation Hôte/Parasite se décline également sur des modes variables allant du biotrophe (strict ou facultatif) au nécrotrophe. En cas d’interaction compatible, elle génère différents types d’infection allant de celle qui est systémique, à celle qui reste très localisée et ne touche que certains tissus ou organes végétaux.
Les origines de la diversité fongique
Les mutations spontanées et la recombinaison – sexuée ou somatique – sont les 2 processus majeurs introduisant de la variabilité génétique chez les champignons phytopathogènes , leur action étant complémentée par celle de la migration et du « flux de gènes » qui en résulte (Burdon et Silk, 1997).
Les mutations spontanées peuvent être à l’origine de l’apparition de nouveaux variants dans une population et pas dans une autre. Elles sont d’origine génique, mais sont aussi fréquemment liées aux réarrangements chromosomiques (Zolan, 1995). Leur contribution à la diversité fongique est liée à leur taux d’apparition (taux de mutation), au niveau de ploïdie du pathogène, à la taille de la population considérée, ainsi qu’à l’avantage sélectif conféré par le phénotype mutant (Burdon et Silk, 1997). La recombinaison s’effectue d’une part au travers de la méiose pendant la reproduction sexuée, et d’autre part grâce à l’hybridation somatique. La recombinaison sexuée provoque à chaque génération une augmentation significative de la diversité génotypique, en produisant de nouvelles combinaisons de gènes (et/ou d’allèles) comme par exemple de nouveaux pathotypes capables de contourner les gènes de résistance de l’hôte déployés par l’homme dans le cadre de la sélection variétale. La recombinaison consécutive à l’hybridation somatique génère quant à elle de la variation génétique grâce à la mise en commun de noyaux de nature différent par hétérocaryose après anastomose des hyphes fongiques.
Les marqueurs moléculaires
Considérés comme sélectivement neutres, les marqueurs moléculaires correspondent à des régions de l’ADN que l’on exploite à l’aide d’outils appropriés de la biologie moléculaire pour révéler et mesurer la variabilité génétique. L’une de leurs caractéristiques majeures est qu’au contraire des marqueurs morphologiques ou de tout autre marqueur traditionnel, ils révèlent du polymorphisme génétique directement au niveau de l’ADN. Ils sont donc indépendants de l’environnement ou du milieu de culture fongique. Ils sont par ailleurs bien plus nombreux que les marqueurs phénotypiques et permettent une mesure précise de la diversité génétique (Nei et Li, 1979 ; Maclean et al., 1993). Ils ont quatre domaines majeurs d’application : la systématique et la phylogénie, le diagnostic des maladies et la détection des champignons pathogènes (dans les plantes ou le sol), la structure génétique des populations et l’épidémiologie, et enfin, les études sur les bases moléculaires de l’interaction hôte / parasite ou sur l’héritabilité et la cartographie de locus. Quoique complémentaires et pouvant faire appel à des marqueurs moléculaires de même nature, les objets de ces champs d’application sont fondamentalement différents (Milgroom et Fry, 1997).
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Table des matières
Chapitre 1 : Introduction – Revue bibliographique
1. Le genre Cylindrocladium Morgan et ses espèces : visite d ’un taxon en constante
réévaluation
1.1 Une distribution géographique large, des gammes d’hôtes variées, un impact économique
certain
1.2 Principales caractéristiques morphologiques et biologiques, pouvoir pathogène et méthodes de
lutte
1.2.1 Principales caractéristiques morphologiques et biologiques
1.2.2 Pouvoir pathogène
1.2.3 Méthodes de lutte contre les Cylindrocladioses
1.3 Une délimitation taxinomique du genre longtemps controversée
1.4 L’identification des espèces : un problème récurrent au sein du genre
1.4.1 La période I (1892 à 1990) : L’époque des espèces morphologiques
1.4.2 La période II (1990 à 1994) : la parution de deux monographies de référence sur la systématique des espèces de Cylindrocladium
1.4.3 La période III (1994 à 1997) : Le recours aux marqueurs moléculaires et la remise en cause des espèces morphologiques
1.4.4 La période IV (1997 à nos jours) : La demande pour de nouveaux marqueurs discriminants et faciles à mettre en oeuvre
2. Le statut des champignons du genre Cylindrocladium au sein du Complexe Parasitaire Racinaire (CPR) des bananiers
2.1 Les bananiers
2.1.1 Importance socio-économique
2.1.2 Systématique et organisation génétique – Eléments de botanique
2.2 Le Complexe Parasitaire Racinaire des bananiers
2.2.1 Les nématodes endoparasites
2.2.2 Les champignons telluriques
2.3 L’interaction Cylindrocladium / bananier / sol
2.3.1 Le contexte agronomique des premières mentions de Cylindrocladium chez les bananiers
2.3.2 La méconnaissance des espèces impliquées chez les bananiers
2.3.3 Symptomatologie et conséquences pour le bananier
2.3.4 Données fragmentaires sur le processus infectieux et le cycle biologique
2.3.5 Distribution spatiale en fonction des types de sols – réceptivité des sols à Cylindrocladium sp
2.3.6 Autres facteurs influençant le développement des nécroses racinaires à Cylindrocladium
2.3.7 Méthodes de lutte
3. La diversité chez les cham pignons pathogènes des plantes : distribution, origines, et
outils d ’évaluation
3.1 Une diversité fongique dimensionnée à l’échelle de la planète
3.2 Une diversité omniprésente chez les champignons parasites des plantes
3.3 Les origines de la diversité fongique
3.4 Les marqueurs phénotypiques, outils traditionnels d’évaluation de la diversité fongique
3.4.1 Les caractères culturaux et morphologiques
3.4.2 Les marqueurs physiologiques et biochimiques
3.4.3 Spécificité d’hôtes et spectres de virulences, résistance aux fongicides
3.4.4 Les types de compatibilité sexuelle et les groupes de compatibilité végétative
3.5 Les marqueurs moléculaires
4. Brève revue des apports des marqueurs moléculaires à la systématique des champignons phytopathogènes
4.1 Un support approprié aux méthodes de classification basées sur la taxinomie numérique
4.2 La confirmation de l’origine polyphylétique des « champignons » (sensu lato) au sein du monde vivant
4.3 Le réexamen des taxa fongiques supérieurs et de leurs origines phylétiques
4.4 Une dimension phylogénétique à la définition de l’espèce chez les champignons
4.5 Une résolution des espèces fongiques phytopathogènes jamais atteinte auparavant
4.6 L’identification moléculaire des espèces fongiques phytopathogènes : de la systématique
au diagnostic des maladies
Problématique et Présentation du sujet
Chapitre 2 : Analyse de la diversité phénotypique et biologique d’isolats de Cylindrocladium issus de la rhizosphère du bananier
1. Introduction
2. Matériel et Méthodes
2.1 Origine des isolais
2.1.1 Isolats de Cylindrocladium non identifiés provenant de la rhizosphère du bananier ou de nécroses racinaires d’héliconia
2.1.2. Isolats de référence provenant de mycothèques internationales
2.2 Isolement, clonage monoconidien et conservation des isolats
2.3 Caractéristiques morphologiques, culturales et physiologiques étudiées
2.3.1 Etude morpho-taxinomique en microscopie photonique
2.3.2 Caractères culturaux et morphologie des colonies
2.3.3 Vitesse de croissance mycélienne et optima thermiques de croissance
2.4 Compatibilité sexuelle des isolats
2.5 Traitement des données et analyses statistiques
2.5.1 Descripteurs de la diversité phénotypique
2.5.2 Optima thermiques de croissance
3. Résultats
3.1 Discrimination des descripteurs de la variabilité morphologique
3.2 Analyse globale de la diversité phénotypique
3.2.1 Identification de cinq morphotypes (Mti) en bananeraies
3.2.2 Comparaison phénotypique des Mti avec des espèces de référence
3.2.3 Distribution géographique des morphotypes
3.3 Identification des optima thermiques de croissance chez les différents morphotypes, et
comparaison avec ceux d’isolats de référence
3.4 Compatibilité sexuelle intra et inter morphotypes
4. Discussion – Conclusions
Chapitre 3 : Analyse du polymorphisme des espaceurs de PADNr chez le genre Cylindrocladium et développement d’une méthode de diagnostic moléculaire de ses espèces- Application à la caractérisation génétique des taxa identifiés en bananeraies
1. Introduction
2. Matériel et méthodes
2.1 Extraction de l’ADN génomique fongique, amplification PCR, séquençage, et analyse des
séquences nucléotidiques de la région ITS de l’ADNr
2.2 Amplification PCR et étude du polymorphisme de restriction de l’espaceur IGS de l’ADNr par
PCR-RFLP (CAPS)
2.3 Etablissement de la séquence complète de la région IGS chez Cylindrocladium
3. Résultats
3.1 Analyse du polymorphisme de séquences de la région ITS chez le genre Cylindrocladium ;
intérêt pour le diagnostic
3.2 Prospection du polymorphisme de site de la région IGS par PCR-RFLP et développement
d’une méthode de diagnostic moléculaire des espèces de Cylindrocladium ; application aux taxa
identifiés en bananeraies et sur héliconias
3.2.1 Développement et validation de la méthode ; application à la détermination des haplotypes IGS des morphotypes MTI et MT2 BAN – Publication n°l
3.2.2 Comparaison des haplotypes IGS entre isolats MT2HEL et MT2BAN – corrections
taxinomiques
3.2.3 Détermination des haplotypes IGS des morphotypes MT3, MT4 et MT5 – autres corrections
taxinomiques
3.3 Premières informations sur le polymorphisme de séquences de l’espaceur IGS chez
Cylindrocladium
4. Discussion
Chapitre 4 : Etude du pouvoir pathogène des espèces de Cylindrocladium inventoriées en bananeraies et de leur variabilité génétique intraspécifique
1. Introduction
2 Article n°2 soumis à publication
Chapitre 5 : Conclusion générale – Perspectives
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