La culture cellulaire tridimensionnelle

La culture cellulaire a été développée en 1907 par Harrison lorsqu’il a étudié le développement d’une fibre nerveuse du système central à la périphérie d’embryons . Du tissu indifférencié, prélevé à partir d’embryons de grenouille, a été placé dans une goutte de lymphe et déposé sur une lamelle stérile. Par cette méthode, il a pu observer en continu le développement et la différenciation du tissu. Il a ainsi mis en évidence qu’il est possible de maintenir en culture des cellules extraites du tissu d’origine pour son observation. La culture cellulaire consiste à maintenir ou à faire proliférer des cellules in vitro dans un environnement artificiel favorable après leur extraction d’un animal ou d’une plante. La culture de cellules de mammifères est un outil majeur très employé en biologie cellulaire et moléculaire et est utilisé pour un large panel d’applications allant de la compréhension de mécanismes biologiques sous-jacents au comportement des cellules in vivo au criblage de molécules thérapeutiques.

Pendant près d’un siècle, la culture cellulaire bidimensionnelle a été utilisée comme modèle in vitro pour étudier les réponses cellulaires aux stimuli biophysiques et biochimiques. Les cellules adhèrent et forment des monocouches sur des supports rigides en polystyrène ou en verre. Ces surfaces sont souvent recouvertes de molécules aux propriétés bioadhésives pour favoriser l’attachement des cellules au substrat. Dans cette configuration, les cellules reçoivent par diffusion la même quantité de nutriments et de facteurs de croissance, résultant ainsi d’une croissance cellulaire homogène. Ces monocouches cellulaires constituent la méthode de culture cellulaire dite conventionnelle ou traditionnelle. Cependant cette méthode de culture ne reproduit pas l’organisation des cellules in vivo. En effet au sein d’un organisme pluricellulaire, les cellules reposent sur une matrice extracellulaire et interagissent avec les cellules voisines par une signalisation biochimique et mécanique. Ainsi, les interactions cellule-cellule et cellule-matrice constituent un réseau tridimensionnel qui maintient la spécificité et l’homéostasie du tissu . L’incapacité des cellules en monocouche à établir une structure tridimensionnelle caractéristique des structures in vivo peut altérer les fonctions cellulaires telles que la viabilité, la prolifération, la différenciation ou encore l’expression des gènes…

Des différences en termes de morphologie cellulaire… 

Une différence majeure observée entre une culture cellulaire 2D et 3D est la dissimilarité de morphologie cellulaire. En monocouche, les cellules n’ont qu’un seul point d’attache au support contrairement aux systèmes 3D où les cellules présentent plusieurs points de contacts couvrant toute la surface de la cellule. Il a été montré que la surface d’étalement de la cellule a un impact sur la prolifération, l’apoptose et la différenciation cellulaire. Il a été observé également que des cellules mises en culture sur des surfaces planes deviennent progressivement aplaties, se divisent de manière aberrante et perdent leur capacité à se différencier.  Il en est de même pour les hépatocytes qui présentent une morphologie, une organisation du cytosquelette et une adhésion au support définitivement différentes lorsqu’ils sont en culture dans une matrice tridimensionnelle ou en 2D (Figure I. 1).

A contrario, il a été montré que l’organisation des cellules épithéliales de la glande mammaire en acini et leur sécrétion lorsque celles-ci sont mises en culture au sein d’un environnement tridimensionnel étaient similaires à celles in vivo que sur des surfaces planes.

Des différences en termes de polarité cellulaire … 

Les modèles de culture 3D ont également l’avantage de conserver la polarité cellulaire. Cette caractéristique est propre aux cellules épithéliales qui présentent une surface apicale et une surface basolatérale. La polarité est impliquée dans l’organisation des cellules formant le tissu et la direction de sécrétion de molécules bioactives. Cependant lorsqu’elles sont en culture dans des systèmes tridimensionnels, elles retrouvent alors cette caractéristique.

Bien que le modèle en 2D ait largement contribué à la compréhension de processus biologiques ou de pathologies, il demeure un facteur limitant dans de nombreuses applications. Jusqu’à aujourd’hui, le criblage de molécules thérapeutiques pour le développement de médicaments, débutait par des essais basés sur des modèles de culture cellulaire 2D suivis par des tests chez l’animal pour finir par les essais cliniques. Il a été montré que lorsqu’on procédait à l’extraction des cellules tumorales de leur niche naturelle, les cellules s’adaptaient à leur nouvel environnement. Cependant cette adaptation s’accompagne d’une modification des fonctions physiologiques au niveau de l’expression des gènes. Certains gènes, notamment ceux responsables de la prolifération sont souvent surexprimés. Ces différences de phénotypes observées entre les résultats collectés du modèle cellulaire et animal sont souvent critiques pour la prédiction des résultats lors des essais cliniques. En effet, seulement 10 % des candidats retenus lors des essais précliniques réussissent au moment des essais cliniques. La plupart des candidats échouent aux essais du développement clinique et spécialement en phase III, qui est l’étape la plus coûteuse du développement du médicament pour des raisons de sécurité et d’efficacité médicamenteuse. Ces échecs s’expliquent par le fait que les réponses cellulaires collectées des tests de culture en 2D sont biaisées par les conditions du microenvironnement qui ne reproduisent pas celles in vivo. Ainsi il est primordial d’établir des systèmes cellulaires qui mimeraient ces conditions pour mieux prédire les résultats aux test in vivo.

Un modèle d’étude cellulaire tridimensionnel : le sphéroïde

Les sphéroïdes cellulaires constituent un modèle relativement simple de culture cellulaire tridimensionnel, basé sur l’agrégation de cellules adhérentes. Ces sphéroïdes sont utilisés depuis les années 1950, mais l’appellation sphéroïde est plus récente et date des années 70 lorsqu’il a été observé que des cellules V79 issues de poumon de hamster ont formé un agrégat cellulaire de la forme d’une sphère. Par la suite, les biologistes se sont donc intéressés à l’utilisation de ce sphéroïde cellulaire comme modèle cellulaire.

Ces modèles de culture cellulaire émergents ont trouvé des applications principalement dans le développement de modèles physiopathologiques et le criblage de molécules médicamenteuse in vitro. La configuration du sphéroïde est assimilable à une tumeur cancéreuse. La grande majorité des tumeurs développent des régions d’hypoxie due à la fois à une déplétion en oxygène et à une insuffisance de vascularisation. En effet, les tumeurs sont souvent composées d’une population hétérogène : des cellules en surface et prolifératives et d’autres à l’intérieur de l’agrégat qui, à l’inverse, ne prolifèrent pas du fait d’un apport en oxygène trop faible. On distingue au sein de ces sphéroïdes tumoraux trois zones concentriques : un cœur nécrotique, une zone quiescente et une zone de prolifération (Figure I.2). Le sphéroïde présente une taille critique (de l’ordre de quelques centaines de µm), au delà de laquelle des phénomènes de nécrose peuvent apparaître. En fonction de leur localisation, les cellules ont une sensibilité différente aux traitements anti tumoraux.

Par ailleurs, la différenciation des cellules souches pluripotentes implique la formation d’une structure sphérique appelée corps embryonnaire qui constitue une étape importante dans l’étude in vitro de la différenciation cellulaire. Ainsi, les sphéroïdes constituent un modèle physiologique tridimensionnel pertinent pour l’étude du cancer et de la différenciation des cellules souches. Ils constituent un outil à haut potentiel dans la recherche du cancer et de la différenciation des cellules souches.

Les termes sphéroïdes et organoïdes sont souvent interchangeables en fonction de l’application ou de la thématique de recherche. Tous deux indiquent un agrégat cellulaire relativement de petite taille (< 200 µm) où de fortes interactions cellule-cellules sont établies. Cependant, les sphéroïdes tumoraux constituent l’exception. Ces sont des agrégats de taille plus grande qui, en leur sein, contiennent un corps nécrotique du fait de la déplétion en oxygène et nutriment. Le terme organoïde fait parfois référence à des agrégats où les structure cellulaires sont bien définies et similaires au tissu d’origine tels que des crypts intestinaux  des cystes de glandes mammaires ou encore les sinusoïdes du foie. Ce sont généralement des modèles basés sur des techniques plus complexes. Par ailleurs, les sphéroïdes sont toujours utilisés comme modèle pour la compréhension de mécanismes d’auto-assemblage qui se produit naturellement au cours de l’embryogenèse, la morphogenèse et l’organogenèse. Ils ont permis de mettre en évidence les acteurs moléculaires d’adhésion cellulaires impliqués dans ces mécanismes.

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Table des matières

Introduction
I. La culture cellulaire tridimensionnelle
I.1 Un modèle d’étude cellulaire tridimensionnel : le sphéroïde
I.2 Les méthodes conventionnelles de la culture cellulaire 3D
I.2.1 Les cultures cellulaires sans échafaudage : Scaffold free cell culture
I.2.1.1 Technique ultra low attachment (ULA)
I.2.1.2 Technique de la goutte pendante
I.2.1.3 Technique de la suspension cellulaire
I.2.2 Les cultures cellulaires avec échafaudage : Scaffold based cell culture
I.2.2.1 Les hydrogels et ses principales applications en biologie cellulaire
I.2.2.2 Les supports matriciels solides
I.2.2.3 Des propriétés majeures des hydrogels pour la culture cellulaire
I.3 Des systèmes microfluidiques : les organ on chip
I.4 L’encapsulation
I.4.1 Présentation de la technologie
I.4.2 Formation de gouttes
I.4.3 Des gouttes aux particules solides
I.4.4 La microfluidique appliquée à la culture 3D
I.5 Formation des capsules d’alginate par fragmentation d’un jet composé
I.5.1 Le principe du procédé
II. Matériels et méthodes
II.1 Matériels
II.1.1 Le dispositif expérimental
II.1.2 Matériaux
II.1.2.1 Collagène
II.1.2.2 Alginate
II.1.2.3 Hydroxyéthylcellulose (HEC) et polyéthylène glycol (PEG)
II.1.3 Préparation des fluides de biopolymères
II.2 Méthodes
II.2.1 Procédé d’encapsulation par co-extrusion
II.2.1.1 Formation d’un jet composé
II.2.1.2 Fragmentation d’un jet composé
II.2.2 Méthodes physico-chimiques de caractérisation
II.2.2.1 Spectroscopie UV-Visible
II.2.2.2 Rhéologie
II.2.2.3 Marquage par fluorescence
III. Ecoulement et encapsulation de suspensions denses
III.1 Dispersion convective dans un écoulement segmenté
III.1.1 Introduction
III.1.2 Materials and Methods
III.1.3 Results and discussion
III.1.4 Conclusion
III.2 Instabilités d’un jet composé d’une suspension cellulaire dense
III.2.1 Battement du jet libre
III.2.2 Fragmentation du jet composé
III.2.2.1 Extrusion simple
III.2.2.2 Co-extrusion
IV. Formation de capsules possédant une matrice de collagène
IV.1 Les suspensions colloïdales et les protéines
IV.1.1 Les forces qui régissent les suspensions colloïdales
IV.1.2 Les protéines
IV.2 Le collagène
IV.3 Reconstruction d’un hydrogel de collagène
IV.3.1 Le mécanisme de fibrillogenèse in vitro
IV.3.2 L’influence des paramètres physico-chimiques sur l’agrégation du collagène
IV. 4 De la co-extrusion des fluides à la formation de capsules à cœur solide
IV.4.1 Un co-écoulement perturbé : description des phénomènes observés
IV.4.2 Origine de ces instabilités
IV.4.2.1 Une origine viscoélastique ?
IV.4.2.2 Réduire l’instabilité viscoélastique ?
IV.4.2.3 Formation d’agrégats lors de la neutralisation de la solution de collagène ?
IV.4.3 Maintenir la solubilité du collagène en suspension
IV.4.4. Fragmentation d’un jet composé des fluides de collagène et d’alginate
V. Développement de micros tissus de cellules épithéliales au sein des capsules à cœur de collagène
V.1 De l’épithélium in vivo aux modèles in vitro
V.1.1 L’épithélium intestinal
V.1.2 Les modèles in vitro
V.2 Une matrice solide de collagène pour la culture des Caco-2
V.2.1 Matériels et méthodes
V.2.1.1 Culture cellulaire
V.2.1.2 Méthodes de caractérisation des structures cellulaires
V.2.2 Une couche d’hydrogel hybride pour la formation d’une monocouche cellulaire
V.2.3 Une matrice de collagène au cœur des capsules
V.2.4 Implémentation d’une monocouche d’hydrogel hybride pour stabiliser la matrice de cœur
V.2.5 Formation d’organoïdes
V.2.6 Des cellules Caco-2 polarisées formant des épithéliums
V.2.7 Des cellules sécrétrices de mucus
V.3 Une matrice solide de collagène pour le développement des cholangiocytes
V.3.1 Formation de structures cellulaires en épithélium
V.3.2 Des cellules fonctionnelles sécrétrices
Conclusion

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