Soutenance mémoire
La contamination par le césium
Problèmes écologique et économique : bilan et état des lieux
Le 11 mars 2011 au Japon se produisait aux larges des côtes de l’océan pacifique, sur l’île d’Honshu, un tremblement de terre de magnitude 9.0 qui a provoqué un arrêt automatique des réacteurs des deux centrales nucléaires, Fukushima Daiichi et Fukushima Daini (Figure 1.1). Les dommages se sont par la suite aggravés avec l’apparition d’un tsunami qui a engendré des problèmes d’alimentation des systèmes de secours. C’est suite à cette difficulté de ne pouvoir refroidir avec efficacité les réacteurs endommagés à Fukushima Daiichi, qu’il y a eu une explosion d’hydrogène accumulé dans la cuve du réacteur qui a provoqué la libération massive de radionucléides tels que l’iode (131) et le césium (134 et 137) dans l’atmosphère, contaminant l’ensemble du territoire (villes, montagnes, campagnes…) dans le centre est du Japon (Kinoshita et al. 2011), ainsi qu’une partie de l’océan (Figure 1.2).
Cette catastrophe nucléaire a ensuite été classée au niveau 7 (c’est-à-dire avec des rejets majeurs et ayant des impacts sur la santé et l’environnement) sur l’échelle internationale des évènements nucléaires (INES), au même niveau de gravité que la catastrophe de Tchernobyl qui a eu lieu en 1986. L’évacuation de la population dans un rayon de 30 km autour des réacteurs s’est faite assez rapidement, avec abandon des animaux qui ont été ensuite abattus. Selon l’OMS, les doses reçues par la population restent faibles et rentrent dans les normes admises. Toutefois, dans les zones les plus contaminées, une augmentation des cancers de la thyroïde chez les nourrissons a été observée. Des niveaux d’iode et de césium radioactifs supérieurs aux limites réglementaires du Japon ont été détectés plusieurs mois après l’accident, ce qui a entraîné la mise en place de restrictions aux niveaux sanitaire et alimentaire, avec des seuils de radioactivité fixés pour chacun des aliments. L’iode 131, dont la demi-vie est de 8 jours, peut être inhalé ou ingéré à travers divers aliments contaminés.
Cet élément a tendance à s’accumuler dans la thyroïde, entrainant ainsi un risque de développement de cancer de la thyroïde. Ce risque est plus important chez les enfants compte tenu de la taille de leur glande thyroïde et de la nature de leur métabolisme. Le césium 137 se révèle également très néfaste à cause de sa forte toxicité pour l’environnement, sa forte dispersion, de la durée de sa persistance (demi-vie d’environ 30 ans) et de sa forte rétention par les argiles particulaires limitant sa migration vers les couches profondes du sol (Beck, 1966; Ivanov et al. 1997, Lepage et al. 2015; Smolders and Tsukada 2011). Par conséquent, c’est dans les dix premiers centimètres du sol que le césium se trouve le plus concentré avec des teneurs qui varient entre 10 et 50 pétabécquerels par kilogramme de sol (PBq/kg =1015Bécquerel/kg) réparties de façon très hétérogène (Figure 1.3). Du fait de sa demi-vie plus courte de 2 ans, le césium 134 représente une menace moins importante.
Mesures mises en place pour la gestion du risque
Pour ces raisons, le gouvernement Japonais a interdit la production agricole sur les sites contaminés qui présentaient une radioactivité supérieure à 5000 Bq kg-1 (Nakanishi et al. 2013). Par la suite, plusieurs mesures ont été mises en place, et notamment le retrait dans la plupart des fermes agricoles, des dix premiers centimètres du sol (White et al. 2003) ainsi que le remplacement de celui-ci. Bien que cela ait entraîné une réduction approximative de 75% de la teneur en césium, dans les horizons superficiels compris entre 0 et 30 cm, cette méthode de détoxification présente plusieurs désavantages en termes d’environnement et de sécurité sanitaire. En effet, le problème de stockage et de traitement des déchets radioactifs accumulés dans des sacs engendre d’énormes frais et le retrait de sol ne peut donc être envisagé que sur de petites surfaces (Zhu & Shaw, 2000).
De plus, toute la structure du sol ainsi que la rhizosphère ont été détruites. L’alternative employée a été de complémenter les sols en intrants contenant des cations, et plus précisément du K+, dans l’objectif de limiter l’adsorption du Cs+ par les argiles ainsi que l’absorption de Cs+ par les plantes. Parallèlement à ces mesures, diverses méthodes de détoxification peuvent être envisagées. On retrouve notamment la stratégie de phytoremédiation, qui consiste à dépolluer les sols par absorption et stockage du polluant dans des plantes. Pour cela il faudrait plutôt faire de la phytostabilisation, une méthode couramment utilisée pour protéger les sols pollués, et qui consiste à utiliser des plantes vasculaires afin de limiter la mobilité et la diffusion du polluant. Cependant, l’ensemble de ces méthodes requiert des plantes non dédiées à la consommation et de biomasse élevée. A l’inverse, une stratégie de type « safe food », dont l’objectif est de limiter l’entrée et l’accumulation du radiocésium dans la plante et les organes entrant dans la chaîne alimentaire, sera plus appropriée pour des plantes pouvant être consommées. Cet accident majeur a motivé le renforcement des études sur les méthodes possibles de décontamination des sols, et des programmes de recherche en agronomie, physiologie et génétique sur l’accumulation de radioactivité dans les plantes.
Les différentes formes de césium
Le césium est un métal alcalin de couleur argentée avec des reflets dorés, qui se présente sous différentes textures : molle, ductile, voir même liquide selon la température externe. En effet, avec un point de fusion de 28°C, il peut être à l’état liquide à température ambiante, une propriété qu’il partage avec le rubidium et le gallium. On retrouve le césium en solution sous forme de cation monovalent hydraté libre, avec peu ou pas de tendance à former un complexe dans le sol. Dans l’environnement, on le retrouve sous forme stable, sous la forme d’isotope 133, à des concentrations infimes, de l’ordre de 1 à 2 μM dans les roches riches en silice et en alumine. Il est très peu mobile, car il est adsorbé par les argiles particulaires (illites et fractions organiques), et reste donc localisé dans les horizons superficiels du sol. Toutefois, différents facteurs participent à sa mobilité et à son lessivage, comme par exemple l’érosion du sol, la variation de pH, la teneur en acides organiques ou encore la teneur en cations de la solution du sol. Par exemple, un sol à forte teneur en humus, aura tendance à avoir une biodisponibilité en Cs+ importante, du fait des concentrations en acides de ce sol. De plus, la présence de cations tels que le potassium ou l’ammonium dans le milieu a un impact majeur sur l’adsorption du césium par les argiles. En effet, ces ions rentrent en compétition avec le césium (Nielsen & Strandberg, 1988 ; Kir & Staunton, 1989). Ainsi, la proportion de césium disponible varie très fortement d’un sol à un autre. Les différents isotopes du césium, stables et radioactifs, ont les mêmes propriétés chimiques et se comportent de la même manière en termes de mobilité. On estime les concentrations en césium stable à 10-11 kg.g-1 dans l’eau de mer, 10-8 kg.g-1 dans les granites, 40.10-8g.g-1 dans les roches sédimentaires et à 1,34.10-8 kg.g-1 dans le charbon (Davis, 1963; Bowen, 1979; Coughtrey & Thorne, 1983). Le césium radioactif est, lui, produit par l’industrie et les centrales nucléaires, à travers des réactions de fission et de capture neutronique. Il existe deux formes de césium radioactif, comme décrit précédemment, le 134Cs et le 137Cs.
Les utilisations courantes du césium
Le césium est un élément qui n’avait été jusqu’à récemment que peu étudié, car il ne présente que peu d’intérêt, sauf pour les industries de traitement des déchets nucléaires. Ce n’est que suite aux accidents nucléaires qui ont eu lieu à Tchernobyl en 1986, puis à Fukushima en 2011, et face à la crainte grandissante d’une autre catastrophe nucléaire, que des études sur les isotopes radioactifs de cet élément, plus précisément le 137Cs, ont été lancées à grande échelle. Le radiocésium présente des intérêts chimiques, qu’il doit à sa grande capacité d’oxydation au contact du dioxygène de l’air, et sa faible énergie d’ionisation due à la faible liaison de son électron de valence. La désintégration du 137Cs entraîne l’apparition d’un isomère du baryum par désintégration béta, qui va ensuite émettre un rayonnement gamma, lors de son retour à l’état fondamental. Ce sont les rayons gamma qui sont utilisés dans plusieurs domaines dont l’agronomie afin de décontaminer les denrées, éliminer des insectes, ralentir la maturation des aliments destinés à l’exportation… Ou encore en médecine, où le radiocésium est utilisé comme traitement contre les cancers du col de l’utérus ou de la vessie. Cependant, l’utilisation de radiocésium chez l’homme soulève des polémiques non négligeables évoquées dans plusieurs études.
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Table des matières
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES ABREVIATIONS
CONTEXTE
CHAPITRE I – INTRODUCTION
I.1 Contexte de l’étude : l’accident nucléaire de Fukushima
I.1.1 Problèmes écologique et économique : bilan et état des lieux
I.1.2 Mesures mises en place pour la gestion du risque
I.2.Le césium
I.2.1. Les différentes formes de césium
I.2.2. Les utilisations courantes du césium
I.2.3. La contamination par le césium
I.3. Le riz
I.3.1. Importance
I.3.2 Origine et diversité
I.3.3 Le génome du riz
I.3.4 Développement et reproduction
I.3.4 Systèmes de culture
I.4. L’architecture racinaire
I.4.1. Mise en place et développement du système racinaire
I.4.2. Plasticité et diversité du système racinaire
I.4.3. Phénotypage du système racinaire
I.4.4. Bases génétiques de l’architecture du système racinaire
I.5. Absorption d’ions par les racines
I.5.1. Principes généraux
I.5.2. Rôle du potassium et son transport chez les plantes
I.5.3. Transport du césium chez les plantes
I.5.4. Systèmes de transport perméables à K+, potentiellement perméables à Cs+
I.5.4.1. Description des canaux Shakers
I.5.4.2. Description de la famille HKT/TRK
I.54.3. Description de la famille HAK/KUP/KT 7
I.6. Présentation du sujet de thèse
CHAPITRE II-MATERIEL ET METHODES
II.1 Matériel végétal
Lignées porteuse d’une insertion ADN-T dans le gène DRO1
Lignée isogénique IR64 NIL DRO1
Autres variétés utilisées dans notre étude
II.2 Méthodes de culture du riz
II.2.1 Culture en terrines
II.2.2 Culture en pots individuels
II.2.3 Culture hydroponique
II.2.4 Culture in vitro en boîtes de Petri carrées
II.2.5 Culture des plantes sur la plateforme de phénotypage racinaire (Rhizoscope)
II.2.6 Culture des plantes sur sol de rizière en tubes PVC pour le traitement Césium
II.2.6.1 Contamination et équilibrage des horizons du sol
II.2.6.2 Conditions de culture
II.2.6.3 Mesures des paramètres morphologiques et physiologiques des plantes
II.3 Transformation du riz via Agrobacterium tumefaciens
II.3.1 Etape d’induction des cals de riz à partir du scutellum d’embryon mature
II.3.1.1 Stérilisation des grains
II.3.1.2 Induction des cals
II.3.2 Etape de co-culture avec Agrobacterium tumefaciens
II.3.2.1 Préparation des agrobactéries
II.3.2.2 Co-culture des agrobactéries avec les cellules de riz
II.3.2.3 Première étape de sélection des cals résistants
II.3.2.4 Seconde étape de sélection des cals résistants
II.3.2.4 Etape de régénération des cales en jeunes plantules
II.3 Mutagenèse du riz par la technologie CRISPR/Cas9
II.4 Biologie moléculaire
II.4.1 Extraction d’ADN nucléaire
II.4.1.1 Méthode MATAB (Gawel et Jarret, 1991)
II.4.1.2 Extraction d’ADN à l’aide du tampon de dilution du Phire® Plant Direct PCR Kit
II.4.2 Extraction de l’ADN plasmidique
II.4.3 Préparation des ADNc
II.4.3.1 Extraction d’ARN de pointes racinaires
II.4.3.2 Rétro-transcription
II.5 Méthodes d’analyse des acides nucléiques
II.5.1.1 Migration des acides nucléiques par électrophorèse
II.5.1.1 Analyses des fragments d’ADN sur gel d’agarose par électrophorèse
II.5.1.2 Gel d’électrophorèse des ARN
II.6 Les différentes PCR
II.6.1 PCR « classique »
II.6.2 La Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR)
II.6.3 La RT-PCR quantitative (qRT-PCR)
II.7 Méthodes de clonage
II.7.1 Les enzymes de restriction
II.7.3 Insertion d’un fragment d’ADN dans un vecteur plasmidique par clonage
II.8 Caractérisation phénotypique des lignées
II.8.1 Réponse gravitropique de la racine séminale
II.8.2 Mesures des contenus en Cs+ et K+
II.8.2.1. Extraction et dosage de cations
II.8.2.2 Détermination de la concentration en cation d’un échantillon
II.8.3 Cinétique d’influx de K+ et de Cs+ in planta
II.8.4 Accumulation de K+ et de Cs+ in planta après différents traitements
II.9 Expérimentations en levures
II.9.1 Milieux de culture des levures
II.9.2 Transformation des levures
II.9.3 Insertion de mutations aléatoires
II.9.4 Criblage de mutants de levures
II.9.5 Les tests en gouttes
II.9.6 Cinétiques d’influx de K+ en levures
II.9.7 Cinétiques d’influx de Cs+ en levures
II.9.8 Cinétiques d’accumulation de Cs+ en levures
II.9.9 Extraction d’ADN plasmidique des levures
PARTIE I- Rôle du gène OsHAK1 dans le transport de K+ et de Cs+
CHAPITRE III- Identification d’un système de transport majeur d’absorption du Cs+ en présence de faibles concentrations chez le riz
III.1 Introduction
III.2 Analyse de la perméabilité à Cs+ de transporteurs de la famille HKT
III.2.1 Perméabilité à Cs+ d’OsHKT2;1, OsHKT2;2 et OsHKT2;4 dans l’ovocyte de xénope
III.2.2 Comparaison de l’absorption racinaire de Cs+ chez Nipponbare, Pokkali et Nona Bokra résentant des différences d’équipement en transporteurs HKT de types 2;1/2;2
III.2.3 Analyse du rôle d’OsHKT2;1 dans l’absorption de Cs+ par la racine de riz à l’aide d’une lignée mutante perte de fonction
III.3 Choix du transporteur d’intérêt au sein de la famille HAK/KUP du riz: Analyse des deux transporteurs majeurs OsHAK1 et OsHAK5
III.3.1 Analyse de la perméabilité à Cs+ d’OsHAK1 et d’OsHAK5 exprimés dans la levure
III.3.2 Sélection de lignées insertionnelles pertes de fonction pour OsHAK1 et OsHAK5
III.3.3 Comparaison du rôle d’OsHAK1 et d’OsHAK5 dans l’absorption de Cs+ par la racine de riz
III.4 Discussion
CHAPITRE IV- Production de lignées mutantes pertes de fonction pour OsHAK1 par la technologie Crispr-Cas9
IV.1 Introduction : Utilisation de la technologie CRIPR-Cas9 pour l’inactivation ciblée de gènes
IV.2 Choix des séquences cibles
IV.3 Clonage des sgRNA et transformation
IV.4 Evaluation des plantes T0 transformées
IV.4.1 Analyse par q-PCR du nombre de transgènes
IV.4.2 Analyse des mutations dans le gène OsHAK1
IV.4.3 Croissance et fertilité des lignées Crispr-Cas9
IV.5 Discussion
CHAPITRE V- Rôle du gène OsHAK1 dans l’absorption de K+ et de Cs+ chez le riz
V.1 Présentation de l’article
V.2 Article
CHAPITRE VI- Production de variants d’OsHAK1 avec une perméabilité K+/Cs+ améliorée
VI.1 Introduction
VI.2 Génération de mutants d’OsHAK1 par mutagénèse aléatoire
VI.3 Criblage des mutants dans la levure
VI.3.1 Criblage de mutants moins sensibles à Cs+ par tests en gouttes
VI.3.2 Validation des mutants sélectionnés : analyses de leurs cinétiques de transport de K+ et Cs+
VI.3.3 Caractérisation moléculaire des mutants sélectionnés
VI.4 Edition du gène OsHAK1 par la technique Crispr-Cas9
VI.5 Discussion
PARTIE II- Influence de l’architecture racinaire sur le prélèvement en césium dans les couches superficielles du sol
CHAPITRE VII- Caractérisation des lignées affectées dans le gène DRO1
VII. 1. Introduction
VII.2 Caractérisation moléculaire de la lignée AVRE12
VII.2.2 Analyses de la courbure gravitropique
VII.3 Analyse de l’architecture racinaire au rhizoscope
VII.3.1 Analyse de l’architecture racinaire des variétés
VII.3.2 Analyse de l’architecture racinaire des lignées dro1 et NIL DRO1
VII.3.3 Conclusion
CHAPITRE VIII- Influence de l’architecture racinaire sur l’absorption de césium disposé dans les couches superficielles du sol
VIII.1 Introduction
VIII.2 Première expérimentation en tubes PVC
VIII.2.1 Mise en place et ajustement du dispositif
VIII.2.2 Collecte des échantillons
VIII.2.3 Analyses des différents paramètres de biomasse Appareil aérien
Biomasse de la partie racinaire
VIII.2.4 Analyses des teneurs en Cs+ dans les différents tissus 8
Teneur en Cs+ des parties aériennes
Teneur en Cs+ des parties racinaires
VIII.2.5 Conclusions
VIII.3 Seconde expérimentation en tubes PVC
VIII.3.1 Mise en place du dispositif
VIII.3.2 Indicateurs physiologiques
VIII.3.3 Analyses des différents paramètres de biomasse
Biomasse de la partie aérienne
Biomasse de la partie racinaire
VIII.3.4 Analyses des teneurs en Cs+ dans les différents tissus
Teneur en Cs+ dans les parties aériennes
Teneur en Cs+ dans les parties racinaires
CHAPITRE IX- Effet de la diversité d’architecture racinaire sur l’accumulation de Cs+ : Discussion
CHAPITRE X : Conclusions et perspectives
ANNEXES
Annexe 1 : Amorces de génotypage, de RT-PCR et de qPCR
Annexe 2 : Amorces utilisés pour la création des lignées Crispr affectées dans le gène OsHAK1.
Annexe 4 : Milieux de culture des Levures
Annexe 5 : Milieux de transformation du riz
Annexes 6 : Schéma de randomisation des lignées sur le dispositif de phénotypage
REFRERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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