Soutenance mémoire
La capsule glomérulaire ou capsule de Bowman
L’INSUFFISANCE RENALE
On rencontre deux types d’insuffisance rénale, en fonction de leur mode d’apparition et de leur durée d’évolution ; l’insuffisance rénale aiguë et l’insuffisance rénale chronique.
L’insuffisance rénale aiguë
L’insuffisance rénale aiguë est un syndrome au cours duquel la fonction rénale est brutalement altérée.Ce syndrome, parfois réversible, se traduit par l’installation d’une oligo-anurie, responsable de troubles de l’équilibre acido-basique, de l’équilibre hydro-électrolytique et de la rétention des produits du catabolisme azoté.Le traitement de l’insuffisance rénale aiguë est avant tout étiologique, mais la correction des désordres hydro-électrolytiques est indispensable.On distingue trois formes d’insuffisance rénale aiguë (IRA) [8] :
– IRA pré-rénale ou fonctionnelle (hypoperfusion rénale d’origine systémique ou hypoperfusion rénale par lésions obstructives de l’artère rénale)
– IRA rénale ou parenchymateuse, caractérisée par des lésions massives d’évolution aiguë des deux reins (nécrose tubulaire post-ischémique, nécrose tubulaire toxique, néphropathie interstitielle ou néphropathie glomérulaire)
– IRA post-rénale ou obstructive (obstruction ou rupture des voies excrétrices).
La seconde partie, expérimentale, de cette thèse s’intéresse à un modèle particulier d’insuffisance rénale prérénale aiguë, l’ischémie transitoire du rein.
Cette forme d’insuffisance rénale aiguë, dite syndrome d’ischémie reperfusion, est fréquemment rencontrée chez l’homme comme chez l’animal, lors de thrombose partielle et transitoire de l’artère rénale ou lors de choc hypovolémique entraînant une hypoperfusion du rein. Il s’agit du même phénomène lors de la transplantation rénale ; en effet, la soustraction totale et prolongée du rein à la circulation lors du prélèvement du greffon entraîne des lésions de néphrose ischémique. [20]
Les lésions rénales provoquées par l’ischémie, ont été étudiées sur des modèles animaux, par clampage de l’artère rénale. Les zones les plus sensibles du néphron semblent être le segment S3 du tubule proximal, et à un moindre degré, la branche ascendante large de l’anse de Henlé [50]. Ces segments tubulaires se trouvent tous deux dans la médullaire externe du rein. Cette zone serait physiologiquement la moins vascularisée du rein [8]. Ainsi, alors que la pression partielle en oxygène est basse, les demandes métaboliques sont élevées (transports actifs des cellules épithéliales tubulaires). Un défaut de perfusion se traduit donc par un déséquilibre important « demande-fourniture » énergétique.
Suivant la durée et la sévérité de l’ischémie, les cellules tubulaires subissent soit des lésions irréversibles, nécrose ou apoptose, soit des lésions réversibles de dysfonctionnement cellulaire. La désorganisation de l’architecture cellulaire qui en résulte se traduit par un détachement des cellules de la membrane basale ; celles-ci sont évacuées dans la lumière tubulaire, obstruant alors les voies excrétrices. L’hémodynamique rénale est alors fortement perturbée.
La phase de reperfusion est caractérisée par une cascade d’événements successifs : production de radicaux oxydants, de médiateurs lipidiques, de cytokines et chémokines par les cellules endothéliales puis recrutement de leucocytes circulants, qui atteignent l’interstitium et vont à leur tour sécréter cytokines et radicaux oxydants. La libération des radicaux oxydants excède largement les capacités cellulaires de « tampon ». L’hypoxie favorise la production de collagène et diminue le renouvellement de la matrice extra-cellulaire. [20]
Ainsi, le syndrome d’ischémie reperfusion se traduit par une cascade de signaux (libération de cytokines pro-inflammatoires et pro-fibrosantes), l’activation des leucocytes et engendre des lésions principalement tubulaires. Un processus de réparation se met alors en place afin de remplacer les cellules dégénérées et restaurer la fonction rénale grâce notamment à la dédifférenciation de cellules voisines [50]. (figure 5)
Les cellules rénales saines migrent et se différencient pour reconstituer l’épithélium tubulaire lésé lors de l’ischémie-reperfusion.
Dans la majorité des cas, l’insuffisance rénale aiguë est réversible mais elle peut parfois évoluer, lorsque les lésions rénales sont étendues, vers une insuffisance rénale chronique.
L’insuffisance rénale chronique
En France, à l’heure actuelle, environ 33 000 personnes souffrent d’insuffisance rénale chronique terminale [33]. L’incidence de l’insuffisance rénale terminale est croissante en raison du vieillissement de la population.En médecine vétérinaire, l’insuffisance rénale chronique représente la deuxième cause de mortalité dans les espèces canines et félines, après les tumeurs malignes .Une insuffisance rénale chronique peut être la conséquence d’une grande variété d’atteintes du parenchyme rénal, qui peuvent toucher initialement les glomérules, les vaisseaux ou les structures tubulaires et interstitielles. Les lésions rénales sont alors étendues, en général bilatérales et touchent ¾ des néphrons.Principales lésions responsables d’insuffisance rénale chronique chez le chien et le chat [13] :
– glomérulopathies (immunes, amyloïdose, néphroangiosclérose)
– néphropathies interstitielles chroniques
– pyélonéphrites chroniques
– tumeurs rénales
– anomalies héréditaires ou congénitales (maladie polykystique, dysplasie rénale, hydronéphrose bilatérale)
Les lésions rénales sont à l’origine d’une réduction progressive du nombre de néphrons fonctionnels, la diurèse est alors assurée par les néphrons non lésés.
La phase de compensation initiale est caractérisée par une hypertrophie glomérulaire des néphrons sains et par une hypertension capillaire glomérulaire, à l’origine d’une hyperfiltration. Ces mécanismes permettent de maintenir une filtration glomérulaire normale malgré la réduction néphronique.
La mise en jeu de ces mécanismes compensateurs induit des effets délétères, en particulier une sclérose glomérulaire, qui viennent s’ajouter aux lésions initiales. [13]
Ainsi, une fois établie, l’insuffisance rénale chronique évolue inexorablement et indépendamment de sa cause initiale vers l’insuffisance rénale terminale. [32, 48]
Chez l’homme comme chez l’animal, le diagnostic de l’atteinte rénale doit être précoce afin de retarder, par un traitement médical approprié, l’apparition du stade terminal de l’insuffisance rénale.
Le traitement médical et diététique vise à ralentir la progression de l’insuffisance rénale et à conserver au mieux l’état général du patient. Il s’agit de diminuer les signes cliniques liés à l’accumulation des déchets azotés et prolonger la durée de vie des néphrons sains en diminuant l’hypertension artérielle glomérulaire et le phénomène d’hyperfiltration à l’origine de la sclérose glomérulaire.Chez l’animal, des progrès déterminants ont été réalisés au cours de la dernière décennie dans la connaissance et le traitement médical de l’insuffisance rénale chronique [13]. Cependant, la prise en charge souvent tardive des animaux et la gravité du syndrome urémique accompagnant l’insuffisance rénale terminale amène le plus souvent le propriétaire à demander l’euthanasie de son animal. Aux Etats-Unis, en Angleterre et au Japon, la transplantation rénale est parfois réalisée, chez le chat. Cependant le coût de l’opération et le débat éthique suscité par les greffes en restreignent l’application.Chez l’homme, au stade terminal, un traitement substitutif ou de suppléance par dialyse ou transplantation est mis en œuvre. Cependant, la dialyse reste très contraignante pour les patients. La transplantation rénale, quant à elle, obéit à des contraintes strictes et comporte des risques qui en limitent l’application à un nombre restreint de malades, un traitement immunosuppresseur étant obligatoire. Le petit nombre de donneurs est également un obstacle important au développement de ces greffes.
Malgré les progrès réalisés en néphrologie, l’insuffisance rénale est encore aujourd’hui un problème majeur de santé publique. Il est nécessaire de développer des traitements préventifs visant à ralentir ou arrêter la progression de la maladie vers le stade terminal. Les néphrologues s’intéressent depuis peu à la thérapie cellulaire, qui donne des résultats encourageants dans d’autres domaines comme la cardiologie, l’orthopédie ou la neurologie.
LA THERAPIE CELLULAIRE
La thérapie cellulaire consiste à implanter des cellules, les cellules souches, au sein d’un organe ou d’un tissu lésé, afin de remplacer les cellules dégénérées, dysfonctionnelles ou absentes.
Notion de cellule souche
Une cellule souche est une cellule qui, placée dans un environnement approprié, est capable de se multiplier (capacité de prolifération) et de produire des cellules spécialisées, qui acquièrent une morphologie et une fonction spécifiques d’un tissu (capacité de différenciation). [Une cellule souche n’exprime aucune spécialisation, elle est « indifférenciée ».En thérapie cellulaire, deux catégories de cellules souches peuvent être utilisées (figure 6) :
– Les cellules souches embryonnaires, qui peuvent donner naissance à tous les types cellulaires d’un organisme (totipotence).
– Les cellules souches adultes, qui sont, pour leur part, déjà engagées dans un programme tissulaire spécifique. Elles peuvent conduire à la formation ou à la régénération de tissus distincts (multipotence), mais limités dans leur variété.
Les cellules souches embryonnaires
On distingue deux types de cellules souches embryonnaires :
– Les cellules issues des premières divisions de l’œuf fécondé (jusqu’au quatrième jour), sont les seules à permettre le développement d’un individu complet.
– Les cellules du blastocyste (cinquième au septième jour après la fécondation) peuvent former tous les tissus de l’organisme (plus de 200 types cellulaires). Elles pourraient constituer un réservoir permanent de cellules pour la thérapie cellulaire.
Pour des raisons éthiques (statut juridique de l’embryon et avortement), l’utilisation des cellules souches embryonnaires est controversée et soumise à des contrôles très stricts.
Les états membres de l’Union Européenne ont adopté des positions très différentes [33]. En France, la loi de bioéthique de 1994 interdisait toute recherche sur l’embryon humain. La révision de cette loi en juillet 2004 autoriserait la recherche sur les embryons humains surnuméraires, notamment le prélèvement de cellules souches embryonnaires humaines, sous des conditions bien définies, et pour une période dérogatoire de cinq ans. La conception in vitro d’embryon humain à des fins de recherche ou à des fins commerciales, ainsi que le clonage thérapeutique et reproductif demeurent interdits.
Les cellules souches adultes
Les cellules souches adultes participent au renouvellement d’un organe ou un tissu, en remplaçant les cellules mortes. D’une part, à l’état quiescent, en se multipliant à l’identique, elles constituent un réservoir de cellules souches. D’autre part, elles peuvent se différencier, acquérant ainsi les caractéristiques du tissu à réparer.
1. Localisation
Certaines de ces cellules souches sont situées au sein même des organes (cellules souches résidentes), par exemple les cellules des cryptes qui contribuent au renouvellement de l’épithélium intestinal. D’autres pourraient être circulantes, se localisant à distance du tissu à réparer, comme les cellules souches mésenchymateuses, situées au sein de la moelle osseuse, qui semblent participer à la régénération de différents organes (cellules souches circulantes). [19, 30]
Les cellules souches adultes résidentes suivantes ont été identifiées avec certitude chez l’homme : cellules souches nerveuses [17, 27], hématopoïétiques [46], épidermiques [47], intestinales [9], osseuses [7], pancréatiques [14], hépato-biliaires [14], rénales [38], musculaires lisses et musculaires squelettiques [45].
Certains auteurs pensent même actuellement que des cellules souches seraient présentes dans tous les organes de l’adulte, et que leurs « niches » n’auraient pas été identifiées. [1, 57]
2. Recrutement
D’une part, les cellules souches participent au renouvellement physiologique des organes (« turn over ») ; les cellules souches de trois tissus (sang, peau, intestin) fonctionnent en permanence, pour renouveler régulièrement l’ensemble des cellules différenciées qui ne se divisent plus et ont une durée de vie limitée. Ce processus serait présent dans tous les organes, dans une certaine mesure.
D’autre part, lors de lésion spécifique d’organe, les cellules souches présentes ou circulantes seraient recrutées et activées préférentiellement.
3. Potentiel de différenciation
Certaines cellules souches adultes sont unipotentes, c’est-à-dire qu’elles n’engendrent qu’un seul type de cellules différenciées. Ces cellules, dites précurseurs, sont issues des divisions des cellules souches, mais se sont déjà engagées dans une voie de différenciation et ont acquis un certain degré de spécialisation, par exemple les hépatocytes, les kératinocytes ou les myoblastes.
D’autres cellules souches adultes sont dites multipotentes : elles peuvent produire des cellules de morphologie et de fonction très différentes. C’est le cas des cellules souches hématopoïétiques, qui produisent toutes les cellules sanguines. C’est aussi le cas des cellules souches nerveuses, qui produisent les neurones, mais aussi les cellules accessoires du système nerveux (astrocytes, oligodendrocytes). Enfin, les cellules souches mésenchymateuses, localisées dans la moelle osseuse, produisent des cellules osseuses, cartilagineuses, musculaires, stromales adipocytaires et peut-être nerveuses. [14, 42, 52, 58].
4. Mise en culture et capacité de prolifération in vitro
Certaines cellules souches adultes se multiplient très efficacement en culture, en conservant intact leur potentiel de différenciation : les cellules souches nerveuses, épidermiques ou mésenchymateuses, appartiennent à cette catégorie. D’autres n’ont pas ce pouvoir, soit parce qu’elles perdent leur potentiel de différenciation en se divisant (cellules souches hématopoïétiques), soit qu’elles prolifèrent très peu in vitro (cellules souches musculaires). Ce comportement in vitro n’est pas prédictif de leur potentiel prolifératif in vivo mais est essentiel pour leur manipulation dans un but thérapeutique.
5. La moelle osseuse : source de cellules souches
La moelle osseuse est l’un des principaux réservoirs de cellules souches. En effet, celle-ci contient des cellules souches résidentes à l’origine du renouvellement du tissu osseux et cartilagineux, mais aussi des cellules souches qui peuvent être circulantes, les cellules hématopoïétiques, et les cellules mésenchymateuses.
Exemples d’application de la thérapie cellulaire
Les applications de la thérapie cellulaire dépendent de l’organe ciblé. D’une part, elles sont liées à sa complexité structurale : plus l’architecture de l’organe est complexe, plus la réparation par thérapie cellulaire semble difficile à mettre en œuvre. D’autre part, plus les lésions de l’organe sont massives et étendues, plus il sera difficile de recoloniser les territoires abîmés.
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Table des matières
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
I. ANATOMIE ET PHYSIOLOGIE RENALE
A. Embryologie et histologie topographique
1. Développement embryologique
2. Architecture générale
3. Agencement néphronique
B. Histologie rénale
1. Le corpuscule de Malpighi
1.1. Le glomérule
1.2. La capsule glomérulaire ou capsule de Bowman
2. La partie tubulaire du néphron
3. Vascularisation des néphrons
C. Fonctions du rein
1. Fonction urinaire
a. Filtration glomérulaire
b. Sécrétion et réabsorption tubulaire
2. Fonction endocrine
II. L’INSUFFISANCE RENALE
A. L’insuffisance rénale aiguë
B. L’insuffisance rénale chronique
III. LA THERAPIE CELLULAIRE
A. Notion de cellule souche
B. Les cellules souches embryonnaires
C. Les cellules souches adultes
1. Localisation
2. Recrutement
3. Potentiel de différenciation
4. Mise en culture et capacité de prolifération in vitro
5. La moelle osseuse : source de cellules souches
D. Exemples d’application de la thérapie cellulaire
IV. LA THERAPIE CELLULAIRE EN NEPHROLOGIE
A. Modèles animaux
1. Animaux sains
2. Animaux malades
B. Chez les patients transplantés
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL PERSONNEL BUT DE L’ETUDE PROTOCOLE
I.MATERIEL ET METHODE
A. Matériel
1. Les animaux
1.1 Caractéristiques des brebis
1.2 Conditions d’élevage des brebis
1.3 Répartition des groupes, chronologie des actes chirurgicaux et des prélèvements biologiques
2. Les cellules
B. Méthode
1. Prélèvement de moelle osseuse
1.1 Anesthésie
1.2 Technique de ponction de moelle osseuse
2. Culture et amplification cellulaire
2.1 Produits utilisés
2.2 Technique
3. Marquage cellulaire
4. Modèle expérimental d’ischémie rénale
5. Technique d’injection des CSM dans l’artère rénale
6. Sacrifice des animaux et prélèvement des reins
7. Etude des reins prélevés
7.1 Evaluation macroscopique
7.2 Evaluation microscopique
8. Traitement des prélèvements sanguins
8.1 Dosage de l’urée et la créatinine plasmatique
8.2 Dosage de l’activité rénine plasmatique (ARP)
9. Méthode statistique
II. RESULTATS
A. Modèle d’ischémie rénale
1. Résultats des dosages d’urée et de créatinine plasmatique
2. Résultats du dosage de l’activité rénine plasmatique (ARP)
3. Résultats de l’évaluation anatomo-pathologique des lésions rénales
B. Culture et marquage cellulaire
1. Culture cellulaire
2. Résultats du contrôle de marquage des cellules avant greffe
C. Résultats de la greffe cellulaire
1. Ensemencement des glomérules :
2. Ensemencement des tubules :
3. Etude de la différenciation des CSM par la révélation de marqueurs spécifiques de cellules rénales
III. DISCUSSION
A. Les cellules souches mésenchymateuses : intérêt, mise en culture et marquage
B. Le modèle ovin d’ischémie reperfusion
C. Interprétation des résultats de l’étude
D. Perspectives
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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