La bioremédiation par les bactéries

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La biologie du sol

Le sol est un milieu vivant dans lequel se développe une multitude d’organismes variés appartenant aux règnes animal et végétal. La qualité biologique des sols fait référence à l’abondance, à la diversité et à l’activité des organismes hébergés dans le sol. Les microorganismes telluriques contribuent à la mise en équilibre de l’écosystème terrestre puisqu’ils assurent des fonctions essentielles comme la dégradation des matières organiques, la production de nutriments pour les plantes, la fixation d’azote, la dégradation des polluants, etc. (Lemanceau et Heulin, 1998).
Le sol, bien que pouvant être restauré et plus ou moins reconstitué, reste une ressource non renouvelable en raison de la longue période nécessaire aux processus de sa formation. Cette propriété le rend particulièrement sensible aux agressions anthropiques telles que les pollutions.

Les polluants du sol

Le sol est dit contaminé lorsqu’il contient des composés susceptibles de causer des altérations (biologiques, physiques ou chimiques) de l’écosystème. Au-delà d’un certain seuil, le polluant présent dans le sol induit des impacts négatifs sur tout ou partie de l’environnement en général (Chassin et al., 1996). En fonction de la durée de dégradation, les polluants sont classés comme suit : les polluants récalcitrants ou persistants et les polluants biodégradables. Un contaminant est persistant lorsque son élimination biologique est très lente ou impossible. Un polluant biodégradable par contre, est un composé qui peut être facilement décomposé par des organismes vivants.

Synthèse bibliographique

Les polluants du sol sont très diversifiés. Ils peuvent être inorganiques, organiques ou radioactifs et sont pour la plupart du temps issus des activités anthropiques.

Polluants radioactifs

Les polluants radioactifs sont les déchets nucléaires qui proviennent des centrales nucléaires, des sites d’extraction de minerais et des hôpitaux. Les polluants radioactifs sont des polluants persistants et durant sa désintégration, ces composés émettent des rayonnements nocifs pour l’homme. Les éléments radioactifs présents dans le sol peuvent être absorbés par les végétaux, ingérés ou inhalés par les animaux. Par conséquent, les polluants radioactifs s’intègrent dans la chaîne alimentaire, entraînant ainsi malformations, mutations génétiques et cancers chez l’homme (Jammet et al.,1968).

Polluants inorganiques

Les polluants inorganiques sont principalement les métaux lourds (plomb, mercure, zinc, cadmium, nickel, arsenic). Ils proviennent des sites d’enfouissement, des déchets domestiques et industriels, des sites d’extraction de minerais. Les métaux lourds sont à l’état de trace dans le sol mais ces composés peuvent s’accumuler dans l’environnement puisqu’ils sont très persistants. Lorsqu’ils se retrouvent en grande quantité dans la nature, ils deviennent nocifs et peuvent modifier la fertilité des sols. Ils peuvent également contaminer les cours d’eau et des réserves souterraines (Lemière et al., 2001).

Polluants organiques

Parmi les polluants organiques, il y a les matières organiques mortes (fumier), les hydrocarbures (pétrole et dérivés) et les produits organiques persistants (POP) comme les solvants, les pesticides et les insecticides. En faible quantité, ces éléments s’incorporent facilement dans l’environnement. Toutefois, l’utilisation en grande quantité de ces contaminants amène une saturation du sol et induit une toxicité chez les organismes telluriques et l’homme (Christian, 1996).

Les pesticides

Les pesticides ou produits phytosanitaires désignent l’ensemble des produits chimiques, naturels ou de synthèse, destinés à repousser ou détruire les nuisibles (microbes, animaux ou végétaux). Certains pesticides sont des composés solubles dans l’eau et certains se transforment en d’autres métabolites toxiques, une utilisation excessive induit l’accumulation de ces produits toxiques dans le sol. Les microorganismes telluriques se trouvent donc affectés par cette accumulation, entrainant ainsi la diminution de la productivité du sol (Hayo, 1997).

Les solvants organiques

Les solvants organiques sont des composés qui ont le pouvoir de former avec d’autres substances une solution homogène. Ils sont utilisés instantanément ou en association avec d’autres agents chimiques pour dissoudre des matières premières. Ils sont aussi utilisés comme agents de nettoyage ou comme correcteurs de viscosité. D’une manière générale, les solvants sont des substances potentiellement toxiques pour l’homme, il s’avère aussi que la microflore du sol se trouve affectée par cette toxicité, ce qui contribuera à la détérioration de la qualité du sol (Mousel et al., 1985).

Les hydrocarbures

Les hydrocarbures sont des molécules organiques formées uniquement d’atomes de carbone et d’hydrogène de formule brute : CnHm où n et m sont des entiers naturels. Ces molécules organiques peuvent être linéaires ou cycliques, présentant des ramifications ou non. D’une manière générale, les hydrocarbures sont regroupés en deux types de molécules : les aliphatiques et les aromatiques (Fingas et al., 2009). Selon la nature de leur liaison chimique, les hydrocarbures peuvent être saturés ou insaturés et sont classés parmi les groupes suivants : les alcanes, les alcènes et alcynes et les composés aromatiques.
Bien que certains hydrocarbures soient issus de formation biologique, les hydrocarbures les plus polluants sont ceux qui sont issus d’une formation géochimique, il s’agit ici de produits pétroliers qui sont constitués à 80% d’hydrocarbures saturés et aromatiques. Leur présence dans le sol est liée aux industries de raffinage, de transformation, de stockage et de distribution de pétrole. Certaines pollutions sont aussi issues des sous-produits pétroliers rejetés (notamment les huiles moteurs usagées) (Tarayre 2012).
Par ailleurs, la structure moléculaire des hydrocarbures influe sur leurs propriétés physico-chimiques. En d’autres termes, plus le nombre d’atomes de carbone est important, plus la solubilité, la volatilisation et surtout la biodégradabilité diminuent (Tarayre, 2012). Les sous-produits pétroliers obtenus en fonction du domaine d’ébullition sont annexés dans l’annexe 4.

Les alcanes

Les alcanes sont des hydrocarbures aliphatiques saturés caractérisés par la présence de liaisons simples entre les atomes de carbone. De formule brute CnH2n+2 où n est un entier naturel, les alcanes forment deux grands groupes : les hydrocarbures à chaîne ouverte (linéaires ou ramifiés) et les cyclanes à chaîne fermée.
Chez l’homme, la plupart des alcanes à chaîne linéaire n’induisent aucun effet toxique (Fiches de toxicologie de l’INRS : Institut National de la Recherche Scientifique). Cependant, il existe des molécules cycliques, comme l’hexane qui peut provoquer des tumeurs pulmonaires. Par ailleurs, la volatilité des alcanes diminue avec le nombre d’atome de carbone. Il est à noter que les dérivés pétroliers contiennent 36 à 42 % d’alcanes.

Les alcènes et alcynes

Les alcènes et les alcynes sont des hydrocarbures non saturés caractérisés respectivement par la présence d’une double et d’une triple liaison entre deux atomes de carbone.
De formule brute CnH2n, les alcènes sont obtenus par craquage thermique des hydrocarbures pétroliers ou aussi par hydrogénation des alcynes. L’alcène le plus courant est l’éthylène qui est utilisé dans le domaine agroalimentaire pour la maturation des fruits ou pour éviter la germination des tubercules (Saada et al., 2003).
D’autre part, les alcynes, de formule brute CnH2n-2 sont issus de la déshydrogénation thermique des alcanes à haute température. L’alcyne le plus utilisé est l’acéthylène qui est un composé inflammable utilisé en tant que combustible.
La plupart des alcènes et des alcynes sont des composés organiques volatiles (COV), ce qui signifie que ces composés ne présentent aucun danger vis-à-vis du sol. D’ailleurs, ces composés sont biodégradables avec une demi-vie allant de 90 à 220 jours (Saada et al., 2003).

Les hydrocarbures aromatiques

Les hydrocarbures aromatiques sont des composés organiques qui possèdent un ou plusieurs cycles à doubles liaisons alternées. Le noyau aromatique peut être du benzène ou des dérivés benzéniques (toluène, xylène, etc.) (Vollhardt et Schore, 2004). Les hydrocarbures aromatiques sont produits en quantité importante dans l’activité humaine, notamment dans les processus de pyrolyse et de combustion mis en œuvre dans l’industrie, le transport et le chauffage (Técher, 2011). Cependant, une grande fraction des hydrocarbures aromatiques polycycliques présents dans la nature proviennent des dérivés pétroliers.
Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) sont des molécules potentiellement toxiques, dus au faite que ces molécules sont tumorigènes, tératogènes et cancérigènes (Bouchez et al., 2001). Les hydrocarbures présents dans le sol sont susceptibles de contaminer d’autres milieux tels que les nappes phréatiques, les lacs et les rivières.
La biodégradabilité des HAP diminue avec le nombre de cycles de la molécule. En d’autres termes, les composés ayant un faible poids moléculaire sont plus solubles et plus volatils. En revanche, les composés de poids moléculaires élevés sont très persistants et par conséquent bioaccumulables (Kanaly et Harayama, 2000). La demi-vie des HAP peut aller de 20 jours à 3 ans selon le nombre de cycle (INERIS, 2014)
De façon générale, la plupart des HAP sont pratiquement insolubles dans l’eau. Cependant, leur solubilisation peut être favorisée par des biosurfactants (rhamnolipide) produits par des bactéries ou des solvants organiques (acétone, alcool) (Cooper et al., 1980).

La bioremédiation par les bactéries

Définition

La bioremédiation est un processus biologique qui consiste à réduire le niveau de pollution présent dans l’air, dans l’eau ou dans le sol. La biotransformation et la biodégradation font partie de la bioremédiation. L’objectif de la biotransformation est d’augmenter l’hydrosolubilité des substances toxiques afin d’accélérer sa dégradation. Tandis que la biodégradation consiste surtout en la décomposition du polluant en divers éléments dépourvus d’effets néfastes sur le milieu naturel. D’une manière générale, durant la bioremédiation, les polluants organiques sont transformés en molécules moins polluantes (en termes de persistance et de toxicité) (Bocard, 2006). Les bactéries prennent une part importante dans cette décontamination naturelle, du fait de leurs capacités à s’adapter à la toxicité des polluants en développant une machinerie enzymatique permettant de dégrader et/ou d’utiliser ce polluant pour leur survie et leur développement.

Les technologies utilisées dans la bioremédiation

Afin que la bioremédiation soit efficace, la bactérie utilisée doit avoir une aptitude à dégrader les composés organiques présents dans le site à dépolluer. Il est aussi important que la bactérie présente une tolérance face au pouvoir toxique du polluant. En outre, les bactéries utilisées peuvent être indigènes, déjà présentes dans la zone polluée, ou d’origine exogène, ajoutées au milieu pollué (El Fantroussi et Agatos, 2005).
Les technologies les plus utilisées dans la bioremédiation sont les suivantes :
• La bio-augmentation : les bactéries sélectionnées sont mises en culture au laboratoire sous forme de suspension puis réintroduites dans le sol contaminé. La culture peut comprendre une ou plusieurs espèces de microorganismes endogènes ou exogènes. La bio-augmentation est largement utilisée pour décontaminer les sites contenant des hydrocarbures (Lens et al., 2005).
• la bio-stimulation : cette technique consiste à stimuler l’activité des populations microbiennes endogènes par apport de nutriments et par ajustement des conditions du milieu (potentiel d’hydrogène, humidité) (El Fantroussi et Agatos, 2005). La bio-stimulation est surtout utilisée dans les cas des traitements in-situ.

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Table des matières

INTRODUCTION
Partie 1 : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I. Le sol et ses polluants
1. Description
2. La biologie du sol
3. Les polluants du sol
3.1 Polluants radioactifs
3.2 Polluants inorganiques
3.3 Polluants organiques
a. Les pesticides
b. Les solvants organiques
c. Les hydrocarbures
c-1 Les alcanes
c-2 Les alcènes et alcynes
c-3 Les hydrocarbures aromatiques
II. La bioremédiation par les bactéries
1. Définition
2. Les technologies utilisées dans la bioremédiation
3. Dégradation des hydrocarbures
3.1 Facteurs influençant la dégradation des hydrocarbures
3.2 Métabolisme des hydrocarbures
a. Cas des alcanes
b. Cas des alcènes et des alcynes
c. Cas des Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques
III. Pseudomonas putida
1. Position systématique
2. Description
3. Facteurs de croissance
3.1 Besoins nutritifs
a. Source de carbone
b. Source d’azote
Table des matières
c. Autres éléments nutritifs
3.2 Facteurs physico-chimiques
a. Température
b. Humidité et activité de l’eau
c. pH
Partie 2: MATERIELS ET METHODES
I. Matériels
I-1. Matériels d’expérimentation
I-2. Matériels de laboratoire
I-3. Milieux de culture
II. Méthodes
II-1. Prélèvement de l’échantillon de sol
II-2. Isolement bactérien
II-2.1 Préparation de la suspension mère
II-2.2 Ensemencement
II-2.3 Caractérisation des colonies isolées
II-3. Purification
II-4. Conservation
II-5. Identification
II-5.1 Etude des caractères morphologiques et culturaux
II-5.1.1 Examen macroscopique
II-5.1.2 Examen microscopique
II-5.1.3 Observation à l’état frais
II-5.1.4 Observation après coloration Gram
II-5.2 Etude des caractères physiologiques
II-5.2.1 Détermination du type respiratoire
II-5.2.2 Recherche de l’oxydase
II-5.3 Etude des caractères biochimiques
II-5.3.1 Test sur milieu HAJNA-KLIGLER
II-5.3.2 Test sur milieu CITRATE DE SIMMONS
II-5.3.3 Test sur milieu MANNITOL-MOBILITE-NITRATE
II-5.3.4 Test sur milieu LYSINE-FER
II-5.3.5 Auxanogramme du carbone
II-5.3.6 Test à la gélatine
III. Essai de traitement biologique
III-1.Mise en place du dispositif expérimental
III-1.1 La préculture
III-1.2 La préparation du sol
III-1.3 L’inoculation
III-2.Méthodes analytiques
III-2.1 Dosages des hydrocarbures résiduels dans le sol
III-2.2 Suivi de l’évolution de la population bactérienne
III-2.2.1 Préparation de la suspension mère
III-2.2.2 Dilutions
III-2.2.3 Culture bactérienne
III-2.2.4 Mode de calcul pour le cas du dénombrement bactérien
III-2.3 Traitement des résultats en régime discontinu
III-2.3.1 Vitesse de dégradation du substrat Rs
III-2.3.2 Vitesse spécifique de dégradation du substrat QS
III-2.3.3 Vitesse de production de biomasse RX
III-2.3.4 Vitesse spécifique de croissance μx
III-2.3.5 Temps de génération G
Partie 3: RESULTATS ET INTERPRETATIONS
1. Isolement
2. Purification et conservation
3. Identification des souches
3.1 Caractères culturaux
3.2 Caractères morphologiques
3.3 Caractères physiologiques
3.4 Caractères biochimiques
3.5 Classification des souches
4. Essai biologique
4.1 Teneurs en hydrocarbures résiduels
4.2 Evolution de la population bactérienne
4.3 Traitement des résultats obtenus
Discussions
Conclusion et perspectives
Références bibliographiques
Annexes

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