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Répartition géographique
L’infection par le VIH est un problème majeur de santé publique. L’Afrique subsaharienne est la région la plus touchée avec plus de 25 million de personnes vivants avec le VIH (18). Selon l’OMS, on estime à plus de 36 million le nombre de décès attribué à la maladie. En 2015, le nombre de décès lié au VIH était estimé à plus d’un million. En 2017, environ 20,9 million de personnes bénéficiaient d’un traitement antirétroviral (19).
Depuis 2010, les nouvelles infections par le VIH chez les adultes ont diminué d’environ 11%, passant de 1,9 million à 1,7 million en 2016. Ce succès est le résultat des énormes efforts consentis par les programmes nationaux de lutte contre le VIH, avec l’appui de la société civile et de divers partenaires du développement (17)
Cycle de vie du VIH-1
La connaissance des différentes étapes du cycle réplicatif des VIH est essentielle pour la compréhension de la physiopathologie de l’infection, chacune de ces étapes étant une cible potentielle des thérapeutiques antivirales. Les différentes phases de la réplication sont :
l’attachement, la pénétration, la décapsidation, la reverse transcription, l’intégration, la traduction, l’assemblage, le bourgeonnement et la libération du virus.
Le virus pénètre dans la cellule en mettant en jeu des récepteurs cellulaires tels que la molécule CD4 présente à la surface des lymphocytes T CD4+ qui sont les principales cibles du VIH (21).
Les corécepteurs CCR-5 et CXCR-4 sont des récepteurs de chimiokines coopérant avec les CD4 pour permettre l’entrée du virus dans la cellule (22). Il s’en suit la transformation de l’ARN viral en ADN double brin qui est transporté du cytoplasme vers le noyau de la cellule sous forme de complexe de pré-intégration. L’intégration du provirus dans le chromosome cellulaire se fait grâce à l’intégrase virale : l’infection de la cellule est définitive car le provirus est une forme virale très stable au sein du génome cellulaire.
Modes de transmission
Le VIH se transmet essentiellement à l’occasion de rapports sexuels (anaux ou vaginaux), la contamination sanguine existe par le partage de matériel d’injection contaminé par du sang chez les usagers de drogues et la transmission verticale lors de la période périnatale (accouchement, allaitement).
Clinique
Phase aigüe ou primo-infection
C’est la première phase de l’infection après contamination ; son diagnostic est essentiel dans un but de prise en charge précoce et de prévention de la transmission. Cette phase s’accompagne souvent de symptômes aspécifiques survenant sur une période de 2 à 6 semaines après contamination. Elle est caractérisée par une fièvre, des adénopathies, des algies diffuses, un rash cutané, une dysphagie douloureuse, des ulcérations buccales ou génitales, des manifestations neurologiques, etc (23).
Phase chronique
C’est la phase la plus longue de l’histoire de la maladie. La réplication virale est constante, en particulier dans les organes lymphoïdes. Un syndrome de lymphadénopathie généralisée est observé chez 20% à 50% des patients. On peut assister aussi à des manifestations cliniques qui témoignent d’une atteinte débutante mais significative du système immunitaire. Il peut s’agir de manifestations cutanéomuqueuses (d’origine fongique ou virale), de manifestations hématologiques (thrombopénie, anémie, leucopénie) et des manifestations générales (altération de l’état général, fièvre, sueurs, diarrhées…) (23).
Stade SIDA
Ce stade correspond à l’ensemble des manifestations cliniques, immuno-virologiques et psychosociales résultant d’une destruction progressive profonde des cellules du système immunitaire. Le degré d’immunodépression conditionne le risque de survenue d’infections opportunistes permettant de classer les malades en différents stade de du SIDA.
Diagnostic biologique
Le développement et l’utilisation généralisée subséquente de tests diagnostiques précis, sensibles et relativement peu coûteux pour l’infection VIH ont été d’une importance cruciale pour initier ou suivre le traitement antirétroviral. En dehors des tests moléculaires, les tests de diagnostic rapide, l’ELISA et les tests d’immunochromatographie (western blot) sont les deux principaux tests de diagnostic et de confirmation de l’infection par le VIH.
La méthode immunoenzymatique (ELISA)
Le test ELISA utilise des plaques où sont préalablement fixés des antigènes de synthèse des enveloppes et des protéines internes des VIH-1 et VIH-2. En cas de présence d’anticorps dans le sérum du patient, ceux-ci vont se fixer sur l’antigène du test. Cette liaison antigène-anticorps sera ensuite révélée par différentes techniques enzymatiques.
Test immunochromatographiques
Ces sont des tests de diagnostic rapide permettant de détecter les sous-types connus du VIH. Ils permettent le diagnostic de l’infection à l’échelle individuelle. Leur procédure est simple et peut se faire en une seule étape pour le sérum/plasma, et parfois en deux étapes pour le sang total.
Le western blot
Le Western blot ou immunoblot permet la caractérisation des anticorps dirigés contre chaque protéine virale. Le sérum du patient est mis en contact avec une bandelette de nitrocellulose contenant toutes les protéines constitutives du virus VIH, disposées par poids moléculaire après électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Tous les anticorps spécifiques présents dans le sérum du patient se lieront à l’antigène, produisant ainsi une bande colorée lorsqu’on ajoute un conjugué d’IgG marquée à la phosphatase alcaline. Ces bandes peuvent être visualisées, et la positivité est évaluée en suivant les recommandations du fabricant et en fonction du nombre et du type de bandes présentes (24).
Quantification du virus/PCR
La PCR est une méthode qui amplifie l’acide nucléique viral pour permettre sa détection dans les échantillons de patients. C’est un test particulièrement spécifique et sensible qui peut détecter un très petit nombre de particules virales. La PCR est très utile dans le diagnostic de l’infection par le VIH chez les nouveau-nés de mères infectées et chez les individus immunodéprimés qui ne peuvent pas induire une réponse d’anticorps adéquate (24).
Structure du VHB
Le VHB produit 3 différents types de particules liées au virus: des particules sphériques à double coque, des particules simplement sphériques et des filaments de longueur variable (Figure 5). Les particules à double coque, également appelées particules de Dane, sont les particules infectieuses (29) car ne contiennent que le génome du VHB. Ces particules de Dane incorporent des nucléocapsides à symétrie icosaédrique de 25-27 nm contenant l’acide nucléique viral, la polymérase virale et les protéines associées (30).
Les particules sphériques de 20 nm sont produites en excès, jusqu’à 1000 fois plus que les particules de Dane, tandis que les particules filamenteuses de 20 nm sont produites en quantités moindres (31). Les particules sphériques et filamenteuses sont principalement composées de la glycoprotéine de surface virale hautement immunogène, mais n’ont de nucléocapside avec son activité virale d’acide nucléique et de polymérase, de sorte qu’elles ne sont pas infectieuses.
Cycle de vie du VHB
Le VHB pénètre dans l’hépatocyte par liaison au récepteur du polypeptide cotransportant de taurocholate de sodium (NTCP). Après l’élimination de l’enveloppe virale et de la nucléocapside, l’ADNrc viral est transporté vers le noyau où il est converti en cccDNA qui est la matrice de transcription pour tous les ARNm viraux. L’ARNpg est transporté vers le cytoplasme où il est encapsidé avec HBV Pol et transcrit de manière inverse en rcDNA. Si une déformation survient au cours de ce processus, l’ADNdb est produit à la place de l’ADNrc. L’ADNrc encapsidant les virions devient enveloppé et est sécrété à partir de la cellule sous forme de virions infectieux, ou ADNrb et ADNdb peuvent être transportés vers le noyau, où l’ADNrc est converti en cccDNA via la voie de conversion intracellulaire. L’ADNdb peut s’intégrer dans le chromosome hôte. L’AgHBs est synthétisé à partir de l’ARNm dérivé du chromosome viral et de l’ADN du VHB intégré. La mutation G1896A introduit un codon stop prématuré et abroge la production de HBeAg (33).
Mode de transmission
Le VHB peut être détecté dans le sérum, l’urine, la salive, les sécrétions nasopharyngées, les larmes, les sécrétions vaginales, le sang menstruel et le sperme (34). Le virus peut aussi être transmis par exposition périnatale, percutanée ou sexuelle, ou par contact étroit de personne à personne (6). La transmission mère-enfant, un aspect important de de l’infection par le VHB, fait l’objet de plusieurs programme de prévention.
Aspects cliniques
Hépatite aigue
La période d’incubation de l’hépatite aigue varie de 1 à 4 mois après l’infection. La présentation clinique peut être une infection asymptomatique chez deux tiers des patients. On peut aussi assister à une hépatite ictérique et, rarement, à une insuffisance hépatique fulminante. Ces symptômes aspécifiques caractérisés par la fièvre, des arthralgies et des éruptions cutanées, peuvent survenir au cours de la période prodromique. La complication la plus grave de l’hépatite aigue est la survenue de l’insuffisance hépatique fulminante. Elle survient chez environ 0,5% des patients et se défini par l’apparition d’une l’encéphalopathie hépatique dans les 8 semaines suivant l’ictère (6).
Hépatite chronique
La plupart des cas d’hépatite chronique survient dans les populations endémiques à la suite d’une transmission horizontale périnatale. L’évolution naturelle de la maladie est déterminée par l’interaction entre la réplication virale et la réponse immunitaire de l’hôte. L’histoire naturelle de l’hépatite B chronique sans traitement a été récemment décrite en cinq phases.
Phase de tolérance immunitaire
La phase de tolérance est caractérisée par la détection de l’AgHBe dans le sérum du patient, une charge virale élevée, des taux sériques normaux d’aminotransférases (ALT) et des changements inflammatoires minimes ou non identifiés dans la biopsie hépatique. Elle survient principalement chez les individus infectés à la naissance par transmission périnatale de mères positives pour AgHBe (35). Il n’y a pas d’activité cytotoxique des lymphocytes T contre le virus car le système immunitaire ne reconnaît pas le virus dans cette phase (36).
Phase de clairance immunitaire
Cette phase est caractérisée par la négativité de l’AgHBe et la positivité de l’anticorps anti-HBe, un ADN du VHB indétectable ou bas, des taux d’ALT normaux persistants et une histologie hépatique montrant une fibrose. Ce tableau est généralement observé quand l’hépatite est acquise à l’âge adulte ou chez les patients présentant une hépatite chronique à la fin de l’enfance ou de l’adolescence (37).
Phase asymptomatique ave présence d’anticorps anti-HBs
Elle se caractérise par la séroconversion de l’AgHBe en anticorps anti-HBe, un taux d’ADN sérique du VHB faible ou même indétectable et des niveaux normaux d’enzymes hépatiques. Cet état est associé à un risque faible de cirrhose ou de carcinome hépatocellulaire chez la majorité des patients. De plus, la perte d’AgHBs et la séroconversion en anticorps anti-HBs peuvent survenir spontanément après plusieurs années alors que l’ADN du VHB reste indétectable (37).
Phase de faible réplication virale
Cette phase peut suivre la séroconversion de l’AgHBe en anticorps anti-HBe. Il est caractérisé par une réactivation périodique de la réplication virale avec des taux fluctuants d’ADN du VHB et d’aminotransférases. L’AgHBe n’est pas détectable en raison de la mutation nucléotidique induisant un codon stop dans la séquence pré-C interrompant la synthèse de la protéine HBe, et / ou des substitutions dans la région promotrice du noyau basal conduisant à l’expression de faibles taux d’AgHBS (37).
Phase de réactivation
Au fur et à mesure que l’ADN viral persiste dans le foie, un certain nombre de porteurs inactifs d’AgHBs peuvent éventuellement développer une réactivation du VHB avec une recrudescence de la maladie hépatique spontanément ou déclenchée par une immunosuppression active (une chimiothérapie anticancéreuse ou après une transplantation d’organe).
La phase de réactivation est caractérisée par la positivité anti-HBe, des taux détectables d’ADN-VHB, une élévation de l’ALT et une nécro-inflammation modérée ou sévère ; une fibrose est observée à la biopsie hépatique (37).
Co-infection VIH et VHB
La co-infection VIH-VHB est fréquente du fait que les deux virus partagent des voies de transmission similaires (40). Malgré la disponibilité généralisée d’un vaccin efficace, il y a actuellement 300 millions de personnes atteintes d’une infection chronique par le VHB (41). La prévalence est plus élevée dans les pays où le VHB est endémique, y compris en Asie et en Afrique, où la prévalence de la co-infection peut atteindre 25% (42). En effet sur les 40 million de personnes vivants avec le VIH dans le monde, environ 10% (2-4 million) ont une co-infection chronique par le VHB (43).
Au cours de la co-infection, les deux virus interagissent simultanément chez un même hôte, compliquant la pathogenèse et la progression de la maladie de ces deux infections. La co-infection peut aussi avoir un impact défavorable sur la réponse immunitaire contre les deux virus ainsi que sur le traitement contre ces infections (42). Il a été montré que la co-infection par le VIH augmente le taux d’infection chronique par le VHB en diminuant le taux d’AgHBs, la séroconversion de l’AgHBe et en augmentant la réplication du VHB (44;45). L’effet délétère du VIH sur le VHB peut aussi se caractériser par une progression plus rapide vers la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire (46).
Réponse immunitaire contre l’infection par le VIH
Réponse immunitaire cellulaire
La réponse immunitaire à médiation cellulaire est la composante la plus importante dans le contrôle de la réplication virale au cours de l’infection par le VIH.
Réponse des lymphocytes T auxiliaires (T CD4+)
Les lymphocytes T CD4+ jouent un rôle crucial dans la mise en place de la réponse immunitaire du virus. L’infection entraine soit leur mort directe, soit leur lyse par les lymphocytes T CD8+
ou par apoptose médiée par des récepteurs de type TRAIL (47). Au début de l’infection, les lymphocytes T CD4+ CCR5+ sont particulièrement diminués, puis à la suite d’un changement de tropisme du VIH, tous les lymphocytes T CD4+ peuvent être infectés (48). La fonction effectrice des lymphocytes T CD4+ au cours de l’infection par le VIH est caractérisée par la sécrétion d’INF-γ qui stimule l’immunité innée et favorise aussi le maintien de la réponse CTL (lymphocyte T cytotoxique) contre le virus. Même si les CTL spécifiques du virus peuvent persister longtemps, leur fonction cytotoxique est altérée en l’absence de lymphocytes T CD4+ auxiliaires (49). La corrélation entre la prolifération des lymphocytes T CD4+ stimulés in vitro et le taux de précurseurs de lymphocytes T CD8+ spécifiques du VIH confirme l’importance de la fonction auxiliaire des lymphocytes T CD4+ dans la réponse immunitaire contre le VIH (50). De plus, les lymphocytes T CD4+ produisent des cytokines, notamment l’IL2 indispensable à la survie des lymphocytes T CD8+ et à leur fonctionnalité.
Réponse des lymphocytes T cytotoxiques (T CD8+)
L’importance des lymphocytes T CD8+ a été démontrée par de nombreuses études. En effet, des CTL sont induits par des peptides viraux portés sur les molécules du CMH-I des cellules présentatrices d’antigène (52). Dans la phase de primo-infection, ces réponses apparaissent au pic virémique qui caractérise la réplication virale (53). Dans l’infection par le VIH, la charge virale baisse après que la réponse CTL ait atteint un certain pic (54); par la suite, il y a une corrélation inverse entre la réponse CTL et la charge virale (55). Une augmentation de l’activité des CTL est observée chez les patients ayant un pic de charge virale pendant la phase chronique asymptomatique (56). Au stade sida, les lymphocytes T CD8+ ne parviennent plus à leur stade final de différenciation, ce qui altère leurs fonctions effectrices (57). La réponse immunitaire exerce une pression de sélection sur le virus et tend à sélectionner les mutants non reconnus par les CTL (58).
Régulation négative des cellules T
Le rôle des cellules T dans le contrôle des infections virales telles que le VIH et le VHB est d’une importance capitale. Cependant, la stimulation persistante de l’antigène au cours d’infections virales chroniques rend souvent les cellules T «épuisées», caractérisé par un état de dysfonctionnement défini par la perte progressive de leur fonction effectrice. Des études ont révélé que le programme de mort cellulaire (PD-1) ainsi que le Tim3 constituent des acteurs majeurs de l’épuisement des cellules T (60). Du fait de l’importance de la réponse des cellules dans l’activation des cellules NK (13-15), l’étude de ces marqueurs apparait ainsi déterminant pour la fonction antivirale des cellules NK.
Le rôle de Tim-3 a été identifié pour la première fois sur les cellules T CD8+ de patients infectés par le VIH ; et ceci était caractérisé par une altération de la fonction de ces cellules (61). Ainsi, l’expression de Tim-3 était directement corrélée à la charge virale et était inversement au traitement antirétroviral. Une stimulation in vitro des cellules en présence d’anticorps anti-Tim-3 permettait de restaurer la fonction la capacité de prolifération des cellules T spécifiques du VIH (61).
A l’instar de Tim-3, il a aussi été montré que les lymphocytes T CD4+ de patients infectés par le VIH présentaient une expression de PD-1 plus élevée associée à un épuisement de la fonction des cellules (62). De même, les lymphocytes T CD4+ spécifiques du VIH provenant des ganglions lymphatiques présentaient une expression de PD-1 plus élevée que ceux du sang périphérique (63). Ceci suggère que la reconnaissance continue de l’antigène est une cause importante de l’expression accrue de PD-1 et de l’épuisement qui en résulte.
Les CTL spécifiques au VIH exprimant PD-1 présentaient une faible capacité proliférative et une sécrétion réduite de cytokines effectrices ; et le blocage des voies PD-1 / PD-L1 était capable de rétablir leurs fonctions (63;64).
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Table des matières
GENRALITES SUR LE VIH ET LE VHB RAPPELS SUR LE VIH
I.1. Infection par le VIH
I.1.1. Répartition géographique
I.1.2 Structure du VIH
I.1.3 Cycle de vie du VIH-1
I.1.4. Modes de transmission
I.1.5. Clinique
I.1.6. Diagnostic biologique
I.1.7. Traitement
RAPPELS SUR LE VHB
I.2. Infection par l’hépatite B
I.2.1. Répartition géographique
I.2.2. Structure du VHB
I.2.3. Cycle de vie du VHB
I.2.4. Mode de transmission
I.2.5. Aspects cliniques
I.2.5.2. Hépatite chronique
I.2.6. Diagnostic de l’infection par le VHB
I.2.6.1. Approches sérologiques
I.2.6.2. Approche moléculaire par la détection de l’ADN du VHB
I.2.7. Traitement
I.2.8. Co-infection VIH et VHB
REPONSE IMMUNITAIRE CONTRE LE VIH ET LE VHB REPONSE IMMUNITAIRE CONTRE LE VIH
II.1. Réponse immunitaire contre l’infection par le VIH
II.1.1. Réponse immunitaire cellulaire
II.1.1.1. Réponse des lymphocytes T auxiliaires (T CD4+)
II.1.1.2. Réponse des lymphocytes T cytotoxiques (T CD8+)
II.1.1.3. Régulation négative des cellules T
II.1.2. Réponse humorale
II.1.3. Cellules NK et leurs rôles dans l’infection par le VIH
II.1.3.1. Interaction VIH et cellules NK
REPONSE IMMUNTAIRE CONTRE LE VHB
II.2. Réponse immunitaire contre l’infection par le VHB
II.2.1. Réponse immunitaire adaptative contre le VHB
II.2.1.1. Réponse cellulaire
II.2.1.2. Régulation négative de la réponse des cellules T médié par Tim 3 dans l’infection par le VHB
II.2.2. Réponse immunitaire innée contre le VHB
II.2.2.1. Interaction entre le VHB et les récepteurs des cellules de l’immunité innée
II.2.2.2. Rôle des cellules dendritiques dans l’infection par le VHB
II.2.2.3. Rôle des cellules NK dans l’infection par le VHB
II.3. Réponse immunitaire contre la co-infection VIH et VHB
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL EXPERIMENTAL METHODOLOGIE
I. Méthodologie
I.1. Cadre d’étude
I.2. Population d’étude
I.3. Aspects éthiques
I.4. Matériels et méthodes
I.4.1. Recueil des échantillons
I.4.2. Tests de diagnostic
I.4.2.1 Sérologie rétrovirale
I.4.2.2 Sérologie VHB
I.4.3. Numération des lymphocytes T CD4+ au FACSCount
I.4.3.1 Matériel et consommable
I.4.3.2. Réactifs et adjuvants
I.4.3.3. Principe
I.4.3.4. Mode opératoire
I.4.4. Isolement et conservation des cellules mononuclées du sang Périphérique
I.4.4.1. Matériels et consommables
I.4.4.2. Réactifs et adjuvants
I.4.4.3. Principe
I.4.4.4. Mode opératoire de la séparation des cellules
I.4.4.5. Conservation des cellules mononucléées du sang Périphérique
I.4.5. Décongélation des PBMC pour la stimulation et la fixation cellulaire
I.4.5.1. Matériel et consommables
I.4.5.2. Réactifs et adjuvants
I.4.5.3. Mode opératoire
I.4.6. Stimulation et fixation cellulaire
I.4.6.1. Matériels et consommables
I.4.6.2. Réactifs et adjuvants
I.7.6.3. Principe
I.4.6.4. Modes Opératoires
I.4.7. Analyse des cellules
I.4.7.1. Matériels et consommables
I.4.7.2. Réactifs et adjuvants
I.4.7.3. Principe de la cytométrie de flux
I.4.7.4. Mode opératoire
I.4.8. Analyses statistique des données
RESULTATS
II. Résultats
II.1. Caractéristiques de la population d’étude
II.2. Stratégie de gating
II.4. Réponse effectrice des cellules NK
II.4.1. Réponse CD107a
II.4.2 Réponse IFN- γ
II.5. Marqueurs de régulation des cellules T
II.5.1. Expression des marqueurs de régulation négative par les cellules T CD4+
II.5.2. Expression des marqueurs de régulation négative par les cellules T CD8+
III. Discussion
IV. Conclusion
V. Références bibliographiques
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