INTERET DE LA RECHERCHE DE CLONALITE B AU SEIN DES GLANDES SALIVAIRES ACCESSOIRES (GSA)

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Rôle du microenvironnement local dans la lymphomagénèse

La sialadénite lymphocytaire caractéristique du SGS correspond à une infiltration lymphoïde focale des glandes salivaires accessoires (GSA) par des cellules B auto-réactives polyclonales. La lymphomagénèse au cours du SGS repose ensuite sur un continuum entrainant progressivement l’évolution d’un infiltrat lymphoïde polyclonal vers une population oligo puis monoclonale pouvant aboutir à une authentique hémopathie maligne. Récemment, de nouveaux éléments dans la physiopathologie de l’échappement lymphomateux ont été identifiés au sein des GSA. Ces travaux ont mis en exergue l’existence de conditions micro-environnementales, c’est à dire intra-glandulaires, particulièrement favorables à la mise en place et à l’entretien de la stimulation antigénique chronique, conduisant à la production d’autoanticorps et de complexes immuns stimulant de façon continue les cellules B exprimant le facteur rhumatoïde. La mise en évidence au sein des GSA de foci lymphocytaires prenant la forme de centre germinatifs (CG) ectopiques, la dysrégulation des voies de signalisation NF-κB (nuclear factor kappa B), la production élevée de la cytokine BAFF (B-cell activating factor) ainsi que la diminution des taux de protéine A20, confèrent un avantage de survie à ces cellules B et reflètent une situation locale propice à la transformation maligne (18).

Intérêt de la recherche de clonalité B au sein des glandes salivaires accessoires (GSA)

Le lymphome du MALT associé au SGS touche principalement les glandes salivaires qui sont l’organe cible de l’exocrinopathie auto-immune (19). Cependant, le diagnostic du lymphome au stade où la maladie est déjà disséminée reste une situation fréquente (20). La biopsie des GSA apparait donc comme une procédure peu invasive, peu couteuse et facile à réaliser au lit du malade, surtout lorsque le lymphome du MALT implique des sites plus difficiles d’accès tels que la glande parotide (risque de lésion du nerf facial, cicatrices) mais aussi le poumon ou l’estomac. Dans le cadre du SGS où les patients sont à risque de développer un lymphome, la documentation d’une infiltration lymphocytaire B monoclonale dans les GSA, avant l’apparition de manifestions cliniques néoplasiques dans d’autres organes, pourrait être pertinente pour le diagnostic et la stadification du lymphome.
La fiabilité de la PCR pour le diagnostic de lymphome du MALT parotidien a déjà démontrée (21). Par ailleurs la population clonale B ayant tendance à se propager d’un site glandulaire à l’autre (22), l’analyse en biologie moléculaire de la clonalité B au sein des GSA pourrait donc être une approche simple pour le dépistage précoce de cette complication au cours du SGS.
Certains travaux ont déjà suggéré que l’évaluation par PCR des réarrangements clonaux des gènes d’immunoglobulines pouvait être une méthode intéressante dans la prédiction du risque de développement d’un lymphome au cours du SGS (23). Cependant les progrès importants réalisés dans l’uniformisation et l’optimisation des techniques pour la détection d’une monoclonalité rendent aujourd’hui ces résultats critiquables et difficilement extrapolables à posteriori.

Synopsis de l’étude

Notre hypothèse est que la présence d’une monoclonalité B au sein des GSA est liée au risque de lymphome chez les patients atteints du SGS. Pour étudier cela, nous avons évalué les réarrangements des gènes de la chaîne lourde des immunoglobulines (IGH) et des gènes de la chaîne légère kappa des immunoglobulines (IGκ) à partir de GSA congelées mais non fixées, en utilisant un protocole de PCR standardisé issu des recommandations émises par l’EuroClonality consortium (BIOMED-2). Ensuite, nous avons analysé les résultats de biologie moléculaire en parallèle que les données cliniques, biologiques et histologiques dans notre série de patients atteints du SGS.

Patients et méthode

Population étudiée

Nous avons analysé rétrospectivement les dossiers médicaux de 222 patients pris en charge dans les différents services de médecine interne (Conception, Nord, Timone) de l’Assistance Publique – Hôpitaux de Marseille (AP-HM) entre octobre 2011 et mars 2019. Tous ces patients avaient bénéficié d’une biopsie des GSA avec une recherche de clonalité lymphocytaire B. La biopsie était réalisée dans le cadre d’un SGS primaire ou secondaire, pour le diagnostic ou lors du suivi si une transformation lymphomateuse était soupçonnée. Le diagnostic retenu après la biopsie des GSA reposait sur les critères de classification ACR/EULAR de 2016 (24). Les patients ne répondant pas aux critères diagnostiques ont été utilisés comme population contrôle. La définition des manifestations extra-glandulaires était basée sur les critères du score d’activité de la maladie ESSDAI (25). Les paramètres pertinents concernant l’activité de la maladie, les facteurs de risque cliniques et biologiques de lymphome et les symptômes B traditionnels tels que la fièvre, la perte de poids involontaire et les sueurs nocturnes ont été extraits des dossiers médicaux (Tableau 1).

Analyses biologiques

La détection et le dosage des anticorps anti-SSA/Ro ont été réalisés par une technique immuno-enzymatique automatisée, à l’aide de réactifs EliA™ et d’un automate UniCAP 250 (Phadia AB/Thermo Fisher Scientific, Inc., Freiburg, Allemagne) avec un seuil de positivité à 10 UI/ml. La lymphopénie était définie à un seuil de 1000 lymphocytes/mm3, la lymphopénie T CD4+ inférieure à un seuil de 500 /mm3, la présence de lymphocytes T activés HLADR+/CD8+ au-dessus de 6 % et l’hypergammaglobulinémie polyclonale au-dessus de 16 g/l. L’inversion du rapport lymphocytaire CD4+/CD8+ était retenue si le rapport était inférieur à 1. L’hypocomplémentémie était définie comme un niveau de C3 inférieur à 0,81 g/l ou de C4 inférieur à 0,13 g/l ou de CH50 inférieur à 70%. Un titre de FR supérieur à 20 UI/l était considéré comme significatif. Le rapport de chaîne légère libre κ/λ sériques était considéré comme anormal en dehors de la fourchette 0,26-1,65 et la β2-microglobuline était considérée comme élevée si >2,2 mg/l.

Échantillons de glandes salivaires accessoires

Intérêt diagnostique

Les GSA ont été prélevées à partir de la muqueuse labiale inférieure chez 222 patients. Deux à quatre glandes pour chaque sujet ont été fixées dans du formol puis incluses en paraffine pour le diagnostic anatomopathologique. Des sections de trois μm d’épaisseur ont été colorées à l’hématoxyline-éosine (H&E) et examinées en microscopie optique. Les patients présentant une sialadénite lymphocytaire focale de grade 3 ou 4 de la classification de Chisholm et Mason (correspondant à au moins un foyer lymphocytaire par 4 mm² de tissu glandulaire) étaient considérés comme ayant un critère majeur du diagnostic du SGS (26).

Intérêt pronostique

Toutes les GSA disponibles dont le compte rendu histologique mentionnait la présence de fibrose ou un score de Chisholm et Mason ≥2 (96/109), ont été relues pour rechercher la présence de CG ectopiques. Les lames ont été centralisées puis scorées par un anatomopathologiste indépendamment des données cliniques en utilisant la définition donnée par Theander et al (27). Un CG était défini par la présence d’un agrégat de cellules mononuclées, formant une couronne de plus de 50 éléments appelée zone sombre. Cette zone contient des centroblastes très compacts entourant une zone plus claire composée d’un réseau lâche de cellules dendritiques folliculaires et de centrocytes.
Lors du prélèvement, deux glandes n’ont pas été fixées mais congelées dans de la glace carbonique puis stockées à -80°C jusqu’à l’analyse de clonalité.

Protocole en biologie moléculaire

Extraction de l’ADN

L’ADN génomique a été extrait manuellement à partir des tissus frais congelés, à l’aide du kit DNA E.Z.N.A® selon les recommandations du fabricant (Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA). L’ADN extrait a été élué dans 100 µL de tampon d’élution et quantifié à l’aide du spectrophotomètre NanoDrop™ 8000 (Thermo Electron, Vantaa, Finlande).

Amplification par PCR en point final et formation d’homo/hétéroduplexes

Pour l’amplification des réarrangements des gènes d’immunoglobuline, nous avons utilisé une combinaison de quatre amorces multiplexes : IGH(VHJH) FR1, -2, – 3 et IGκ Vκ-Kde/intron-Kde (Invitrogen™) placées dans quatre tubes séparés (tube FR1, tube FR2, tube FR3, tube Kde) selon le protocole de PCR multiplexe BIOMED-2 (28). Les produits de PCR, d’un volume de 50 µL, comprenaient 100 ng d’ADN, 10 pmol d’amorces oligonucléotidiques 5’ et 3’, 0,2 mM de dXTP, 5 µL de tampon Taq Gold 10×, 1,5 mM de MgCl2 et 1 U d’AmpliTaq Gold polymérase (Applied Biosystems™). Toutes les réactions d’amplification ont été réalisées dans un thermocycleur automatisé (TProfessional thermocycler, Biometra, Allemagne). Les paramètres de cycle et de fonctionnement ont été définis selon la méthode précédemment décrite par le laboratoire du Pr Jean Gabert (29) : préactivation pendant 7 minutes à 94°C, suivi de 35 cycles de dénaturation de 45 secondes à 95°C, hybridation 45 secondes à 60°C, et élongation de 90 secondes à 72°C. Après le dernier cycle, nous avons effectué une dernière étape d’élongation pendant au moins 10 minutes à 72°C. 20 µL de produits PCR ont été dénaturés à 95°C pendant 5 minutes, puis renaturés à 4°C pendant 60 minutes pour induire la formation de duplexes. Les produits de PCR contenant des homo/hétéroduplexes (1 µL) ont été détectés par électrophorèse microcapillaire de haute résolution à l’aide du Bioanalyseur Agilent 2100 sur une puce ADN 1000 LabChip (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA). Le détail des réarrangements des gènes d’immunoglobuline en fonctions des différentes amorces utilisées sont présentés dans le Tableau S1.

Analyses statistiques

Les variables continues ont été exprimées en moyenne (± S.D.) et/ou médiane (intervalle). Elles ont été comparées à l’aide du test ANOVA (comparaisons à 3 groupes) et des tests de Student ou de Mann-Whitney (comparaisons à 2 groupes), selon les cas. Les variables catégorielles ont été exprimées en nombre (%) et comparées à l’aide du test du χ² ou du test exact de Fisher. Tous les tests statistiques ont été effectués de façon bilatérale en utilisant un seuil de 0,05 pour la P-value. Les analyses ont été effectuées à l’aide du logiciel SPSS Statistics® 20.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA).

Éthique et approbation

Le comité local de protection des données personnelles (DPO) a approuvé notre étude (RGPD/APHM 2019-50) conformément au Règlement général sur la protection des données (UE) 2016/679 en vigueur.

Résultats

Caractéristiques démographiques, cliniques et biologiques des patients avec et sans SGS

Deux cent vingt-deux patients ont fait l’objet d’une recherche de clonalité lymphocytaire B sur GSA. Dix patients ont été exclus en raison de problèmes techniques lors de l’étape pré analytique (échantillon non exploitable en raison de conditions de transport et de stockage inappropriées), quatre patients ont été exclus en raison d’une quantité d’ADN insuffisante et un en raison d’un nombre trop important de données manquantes ce qui réduisait le nombre total de résultats de clonalités sur biopsies des GSA analysables à 207.
Les patients ont été classés en deux groupes distincts selon le diagnostic final : le groupe SGS (n=123) et le groupe contrôle (n=84) (Tableau 1). Ce dernier a ensuite été divisé en deux sous-groupes, i) maladies auto-immunes autres que le SGS (n=41) et ii) maladies non auto-immunes (n=43). Les diagnostics les plus fréquents parmi les patients contrôles atteints de maladies auto-immunes autres que le SGS étaient : le lupus érythémateux disséminé (7/41, 17 %), le groupe des spondyloarthropathie (6/41, 15 %), la thyroïdite de Hashimoto (6/41, 15 %). Les trois groupes étaient comparables en ce qui concerne l’âge lors de la biopsie, le sexe et la durée de suivi (données non montrées). Il y avait plus de syndrome sec oculaire et/ou buccal dans le groupe SGS (P < 0,001).
La durée médiane du suivi était de 43 mois dans le groupe SGS (intervalle 2-105 mois). Au cours de ce suivi, deux patients appartenant au groupe SGS sont décédés, le premier d’une mort subite et le second d’une défaillance multiviscérale au cours d’une vascularite cryoglobulinémique.

Association entre clonalité B sur GSA et lymphome au cours du SGS

Nous avons trouvé un composant monoclonal B au sein des GSA chez 31/207 (15%) des patients. Cette fréquence était significativement plus élevée chez les patients atteints du SGS que chez les patients contrôles [28/123 (22,8 %) vs 3/84 (3,6 %), P <0,001, Tableau 1]. La différence demeurait statistiquement significative lorsque l’on comparait les patients atteints de SGS aux 2 sous-groupes de témoins avec ou sans autre maladie auto-immune [3/41 (7,3 %) et 0/43 (0 %) respectivement, P <0,001].
Dans le groupe SGS en analyse univariée, la présence d’un lymphome évolutif au moment de la biopsie était associée de façon statistiquement significative à la présence d’une clonalité B dans les GSA (P = 0,05, Tableau 3). En effet, le diagnostic de récidive de lymphome du MALT salivaire a été retenu selon les résultats histologiques et immuno-histochimiques issus des GSA de 2 patients (patient 1 et patient 2) et confirmé ensuite par la mise en évidence d’une clonalité lymphocytaire B au sein des GSA de ces mêmes patients (100%). De plus, chez l’un d’entre eux (patient 1), nous avons pu mettre en évidence des produits de PCR de même taille (même nombre de paires de bases) dans les tissus glandulaires et dans le sang périphérique, suggérant une dissémination systémique de la maladie.
Une recherche de clonalité lymphocytaire B a été réalisée à la fois dans le sang périphérique et les tissus glandulaires chez 63/123 patients ayant un SGS. Une monoclonalité B a été détectée dans le compartiment sanguin et tissulaire chez 3 d’entre eux (3/63, 5 %). Le clone B était identique chez deux de ces patients, le premier était atteint d’un lymphome du MALT salivaire disséminé (patient 1) et le second porteur d’une LLC. Le troisième patient avait également une LLC mais présentait des clones distincts dans le sang et les GSA. Quatorze des patients ayant bénéficié de cette double recherche (14/63, 22 %) présentaient un réarrangement clonal soit dans le sang soit dans les GSA : un patient atteint de LBM était positif dans le sang uniquement et les 13 autres étaient positifs dans les GSA uniquement. Ces 13 patients n’ont pas présenté de lymphome, ni au moment de la biopsie ni pendant le suivi [durée médiane du suivi 83 mois (intervalle 30-105 mois), moyenne 79,5 (S.D. ± 17,6 mois)]. Chez les 46 autres patients (73 %), aucune clonalité B n’a été observée dans le sang ou dans les tissus et aucun d’eux n’avait de lymphome au moment de la biopsie ou pendant le suivi.

Association entre la clonalité B sur GSA et les facteurs de risque de lymphome

Nous avons d’abord comparé la fréquence des facteurs de risque de lymphome entre le groupe SGS et le groupe contrôle. Nous avons constaté que la présence de polyadénopathie, l’augmentation de volume permanente ou récurrente des glandes salivaires, l’hypocomplémentémie, la lymphopénie portant notamment sur les T CD4+, la présence d’un contingent de lymphocytes T activés HLADR+/CD8+, l’activité FR, les taux sériques de β2-microglobuline, le focus score ≥3 et la présence de CG ectopiques étaient statistiquement beaucoup plus fréquents dans le groupe SGS (Tableau 1). Nous n’avons observé aucune différence statistique entre les deux groupes en ce qui concerne les signes B, la splénomégalie, le purpura vasculaire, la cryoglobulinémie et la présence d’un pic monoclonal sérique. La proportion de patients déjà traités pour une maladie auto-immune au moment de la biopsie était significativement plus élevée dans le groupe SGS. Le traitement antérieur consistait en des corticostéroïdes par voie orale et/ou de l’hydroxychloroquine chez 23/28 (72 %) des patients du groupe SGS.
Pour déterminer si l’infiltration monoclonale B dans les GSA des patients SGS était associée aux facteurs de risque prédictifs de lymphome déjà établis, nous avons comparé les 28 patients du groupe SGS présentant une clonalité B dans les GSA aux 95 patients du groupe SGS sans clonalité B (Tableau 3). Concernant les facteurs de risque cliniques, seul le gonflement permanent ou récurrent des glandes salivaires était significativement associé à la présence d’une clonalité B dans les GSA. En ce qui concerne les facteurs de risque biologiques, la lymphopénie, notamment la lymphopénie T CD4+, l’activité FR, l’hypocomplémentémie, la cryoglobulinémie mixte (type 2) et les concentrations élevées de β2-microglobuline étaient significativement associées à la présence d’une clonalité dans les GSA. La proportion de patients ayant déjà reçu un traitement immunomodulateur était comparable dans les deux groupes avec et sans clonalité B dans les GSA (Tableau 3).

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Table des matières

MOTS CLES
MESSAGES CLES
A) INTRODUCTION
1) LYMPHOME NON HODGKINIEN ET SYNDROME DE GOUGEROT-SJÖGREN (SGS)
2) IMPORTANCE DES FACTEURS DE RISQUE DE LYMPHOME AU COURS DU SGS
2) INTERET DE LA RECHERCHE DE CLONALITE B AU SEIN DES GLANDES SALIVAIRES ACCESSOIRES (GSA)
3) SYNOPSIS DE L’ETUDE
B) PATIENTS ET METHODE
1) POPULATION ETUDIEE
2) ANALYSES BIOLOGIQUES
3) ÉCHANTILLONS DE GLANDES SALIVAIRES ACCESSOIRES
4) PROTOCOLE EN BIOLOGIE MOLECULAIRE
5) ANALYSES STATISTIQUES
6) ÉTHIQUE ET APPROBATION
C) RESULTATS
1) CARACTERISTIQUES DEMOGRAPHIQUES, CLINIQUES ET BIOLOGIQUES DES PATIENTS AVEC ET SANS SGS
2) ASSOCIATION ENTRE CLONALITE B SUR GSA ET LYMPHOME AU COURS DU SGS
3) ASSOCIATION ENTRE LA CLONALITE B SUR GSA ET LES FACTEURS DE RISQUE DE LYMPHOME
D) DISCUSSION
CONCLUSION
REMERCIEMENTS
LISTE DES ABREVIATIONS
REFERENCES

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