Soutenance mémoire
Insuline, diabète et complications
Physiologie de la sécrétion de l’insuline
Le pancréas est une glande à 95% exocrine et 2% endocrine. Sa partie endocrine qui est organisée en îlots de Langerhans, produit et sécrète les hormones nécessaires à la régulation du glucose sanguin. Leur rôle a été découvert en 1890 par Joseph van Mering et al. qui, à la suite de pancréatectomies, ont montré le développement de diabète chez le chien (1). Les îlots sont constitués de 5 types cellulaires : les cellules α (glucagon), β (insuline and amylin), δ (somatostatine), ε (ghrelin) et les cellules PP (polypeptide pancréatique). Les cellules β productrices de l’insuline sont les plus nombreuses ; elles représentent 50 à 70% de la masse des îlots. La communauté scientifique a montré que l’insulino-sécrétion n’est pasréduite à ces seuls types cellulaires mais à l’interaction de l’ensemble des constituants des îlots pancréatiques. Ils interagissent par contact direct ou par l’intermédiaire des produits sécrétés. Le glucose est l’agent stimulant le plus puissant de la sécrétion de l’insuline. Il pénètre via son transporteur GLUT-2 dans les cellules β où il phosphorylé par une glucokinase en glucose-6- phosphate (glycolyse) (Figure 1). La phosphorylation entraine une augmentation de la production d’ATP, par le cycle de Krebs, qui provoque une fermeture des canaux K+ /ATP dépendants. La membrane cellulaire se dépolarise et permet au Ca2+ extracellulaire de pénétrer dans la cellule par ses canaux voltage dépendant ouverts. L’augmentation du Ca2+ cytosolique est nécessaire à l’exocytose des vésicules d’insuline. Après un bolus de glucose, la sécrétion d’insuline est bi-phasique (Figure 1). La première phase, très courte, débute moins d’une minute après l’ingestion du glucose. Elle correspond à la sécrétion de l’insuline stockée dans les granules de sécrétion. Son intensité dépend de la glycémie. Des études ont montré que la disparition de cette phase est associée au développement des diabètes de type 1 et 2. S’ensuit une deuxième phase soutenue qui débute quelques minutes après le bolus mais n’est mise en évidence qu’au bout de 10 min, et dure le temps de l’homéostasie. L’insuline libérée est celle déjà stockée mais également celle nouvellement synthétisée (2)(3)(4)(5). Les lipides, les acides aminés et les hormones intestinales incrétines (GIP et GLP-1) jouent également un rôle dans la sécrétion de l’insuline (3)(6).
Microbiologie des DFIs
Les DFIs sont principalement causées par des cocci Gram+ aérobies et en particulier par Staphylococcus aureus (23)(24)(25). Ses propriétés spécifiques en font un micro-organisme particulièrement virulent. Ses adhésines lui permettent un bon attachement aux protéines de la matrice extracellulaire ; certains composants favorisent son évasion des défenses de l’hôte et une bonne pénétrance cellulaire, en particulier chez les mammifères (36). On retrouve plus rarement des streptocoques bêta-hémolytique (surtout du groupe B) et des staphylocoques à coagulase négative. Les infections des plaies récentes (moins de 15 jours) et superficielles sont le plus souvent d’origine monomicrobiennes. Les formes modérées à sévères et chroniques, qui ont déjà été traitées, sont plus souvent polymicrobiennes, avec des coques Gram+, des entérobactéries (Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella spp), des bacilles Gram- pyogènes (Pseudomonas aeruginosa) et des bactéries anaérobies obligatoires (24)(25)(30). Dans les prélèvements osseux issus de DFOs, l’agent pathogène le plus fréquement retrouvé est S. aureus seul, ou prédominant dans le cadre d’une infection polymicrobienne (24)(25). Des études récentes ont montré que dans les régions subtropicales et chaudes, les infections aux entérobactéries et à P. aeruginosa sont les plus fréquentes (30% de S. aureus contre 75 % sous nos latitudes) (25)(34). La littérature recense quelques rares cas d’infections fongiques, parasitaires, ou à mycobactéries. En revanche, les infections virales osseuses n’ont pas encore été décrites. L’isolement de plus en plus fréquent de bactéries multi-résistantes est un problème récent. Depuis 10 ans, on assiste à l’émergence de S. aureus résistant à la méticilline (SARM) et de bactéries Gram- bêtalactamase à spectre élargi ou productrices de carbapénémase (24)(25). Le biofilm est un autre grand mécanisme de résistance responsable d’échecs thérapeutiques. On le retrouve dans la plupart des plaies chroniques (dont les DFOs) (37)(38). Une étude récente confirme la présence de biofilm dans des ulcères infectés aigus ou chroniques du pied diabétique (39). L’os dévascularisé des DFIs est un substrat idéal pour l’attachement des bactéries qui s’organisent en communauté pour développer le biofilm (40). Il a été découvert en 1970 par le Dr William Costerton qui a démontré le changement des pathogènes de la forme familière planctonique (flottante) à la forme sessile (adhérente) phénotypiquement différente, par fixation à une surface (35). Plusieurs étapes sont nécessaires à sa formation comme illustré Figure 5. Les pathogènes adhèrent à la surface de façon réversible via des liaisons chimiques ; de par la formation de molécules protéiques et de structures (pili), l’adhésion devient permanente. Après fixation, les colonies formées par multiplication des bactéries sécrètent la matrice. C’est un polymère extracellulaire dont la composition varie selon les espèces bactériennes. Le biofilm évolue en écosystème par la maturation de cette matrice qui s’épaissit, la formation de canaux reliant les colonies et l’envoi de signaux de communication (quorum sensing (36)(41)). La maturation est suivie par la phase planctonique pendant laquelle les bactéries se détachent et colonisent de nouvelles zones (41)(40). Les biofilms sont une communauté dynamique en changement constant, composés parfois d’une seule espèce de bactérie ou de champignon, ou plus fréquemment d’origine polymicrobienne. Ils protègent les micro-organismes d’agressions extérieures comme les antibiotiques et les mécanismes de défenses de l’hôte en empêchant leur diffusion par diminution du métabolisme et des changements phénotypiques (42). Le stress mécanique tel que le débridement est limité en raison de l’extrême rapidité de la formation/reformation de cette barrière (36)(41)(43). Pour éliminer le biofilm et ses pathogènes, il faut des concentrations en antibiotiques très élevées (10-1000 fois la concentration minimale inhibitrice) sur des périodes prolongées, qui peuvent entrainer des effets secondaires toxiques et délétères pour le patient (35)(38)(44). De plus, la plupart des antibiotiques inhibent la division cellulaire ou la synthèse de la paroi bactérienne (45). Or, dans les biofilms, les bactéries sont en état de quiescence, les médicaments ne peuvent donc pas agir.
Le diabète est une maladie en constante augmentation. Toutes les parties du corps sont concernées, à commencer par les pieds fréquemment touchés les premiers. À mesure que la pandémie du diabète progresse à l’échelle mondiale, il en va de même des complications podologiques. 50 % des ulcères s’infecteront, et 20 % aboutiront à une amputation du membre inférieur. Les DFIs sont très graves, invalidantes et leur traitement est encore complexe et très couteux. Leur prise en charge repose sur une antibiothérapie et des soins de plaie. Malgré des progrès médicaux et chirurgicaux significatifs, ces infections restent un problème de santé publique. La communauté scientifique s’efforce de trouver de nouveaux systèmes de délivrance des ATBs, notamment pour s’affranchir des problèmes vasculaires et de leur mauvaise pénétrance au site infecté. L’administration locale permettrait d’augmenter la quantité de principe actif directement dans la plaie sans effet toxique pour l’organisme.
Les systèmes à libération locale
La voie d’administration des médicaments est essentielle pour leur efficacité et le traitement des maladies. Il existe de nombreuses voies pour administrer les principes actifs (orale, parentérale, sous-muqueuse…). Dans certaines affections telles que les DFIs, les problèmes de vascularisation entrainent un faible niveau d’absorption des molécules, une action lente, une délivrance non spécifique et de potentiels effets secondaires non ciblés. L’administration locale est une technologie qui limite la distribution et l’absorption d’un médicament sur un site défini. Le but de cette approche est d’améliorer la biodisponibilité des molécules au site de la maladie, de réduire la fréquence d’administration et de minimiser les effets secondaires systémiques.
Les pansements
Actuellement, il existe sur le marché une large gamme de pansements de diverses formulations. Ces pansements sont classés en fonction de leurs caractéristiques et du type de plaie (Tableau 2). Ce classement constitue un outil pour orienter le choix des professionnels de santé (50). Il n’existe pas de pansement « idéal » mais la communauté scientifique s’efforce de développer de nouveaux dispositifs répondant au cahier des charges présenté Figure 7. Traditionnellement utilisés pour protéger les plaies des agressions extérieures, et destinés aux traitements et aux soins des plaies pour favoriser la cicatrisation, ils sont exploités depuis plusieurs années comme plateforme pour la délivrance locale de molécules actives. On parle de pansements techniques dits « avancés ». Ils sont constitués de divers biomatériaux, et les substances dont ils sont imprégnés agissent directement ou indirectement sur le processus de cicatrisation (51). L’accélération et l’amélioration de la régénération de la peau permet de lui rendre son intégrité, ses fonctions protectrice et homéostatique, de réduire les temps des soins, les rechutes et le coût de prise en charge.
Les pansements pro-cicatrisants
Ils favorisent directement la réparation de la peau grâce à des molécules qui agissent à différents stades essentiels de la cicatrisation. Ces pansements ne sont en revanche utilisés que sur terrains non infectés. Ils ne conviennent donc pas pour le traitement de l’infection du pied diabétique.
L’acide hyaluronique (AH)
L’acide hyaluronique est un polysaccharide endogène composé d’acide D-glucuronique et de D-N-acétylglucosamine, liés entre eux par des liaisons glycosidiques. C’est un des composants de la matrice extracellulaire des tissus humains. Il est particulièrement présent dans les tissus conjonctifs de la peau. Il joue également un rôle clé dans la réparation des tissus à différentes phases de la cicatrisation, en permettant la prolifération, la migration et l’hydratation des cellules (53). La méta-analyse menée par Chen et al., a montré l’efficacité de l’AH indépendamment de sa forme galénique, pour le traitement des ulcères diabétiques, en accélérant la guérison à 12 semaines (54). L’essai contrôlé, conduit en double aveugle et randomisé de Humbert et al. conclu à une différence significative de la réduction de la taille des ulcères au 45ème jour, lorsque les patients sont traités par des gazes IALUSET® imprégnées à l’AH plutôt qu’avec des gazes classiques sans AH. Le nombre de guérisons complètes à 45 jours également été plus important (55). L’HAS a aussi estimé, pour ce pansement, le service attendu suffisant pour le traitement des ulcères de jambe mais dans un contexte non infecté .
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Table des matières
Introduction générale
Chapitre 1 : Étude bibliographique
1. Insuline, diabète et complications
1.1. Physiologie de la sécrétion de l’insuline
1.2. Fonctions de l’insuline
1.3. Le diabète
1.4. Les complications liées au diabète
1.4.1. L’infection du pied diabétique (DFI : « diabetic foot infection »)
1.5. Conclusion
2. Les systèmes à libération locale
2.1. Les pansements
2.1.1. Les pansements pro-cicatrisants
2.1.2. Pansements antibactériens
2.2. Les systèmes à libération locale pour les infections profondes du pied diabétique.
2.2.1. Le polyméthacrylate de méthyle (PMMA)
2.2.2. Le sulfate de calcium purifié (CaSO4)
2.2.3. Les éponges de collagène
2.3. Conclusion
3. Les hydrogels et éponges
3.1. Les hydrogels
3.1.1. Caractérisation rhéologique des hydrogels
3.1.2. Les hydrogels à base de polymères naturels
3.2. Les éponges
3.2.1. La lyophilisation
3.2.2. Caractérisation des éponges
3.2.3. Les éponges de chitosan à libération d’antibiotiques
3.3. Les travaux du laboratoire à base du mélange de CHT et de PCD
3.4. Conclusion
4. Contexte, objectifs de la thèse et cahier des charges
4.1. Contexte et objectifs de la thèse
4.2. Cahier des charges
Chapitre 2 : Matériels et Méthodes.
1. Matériels
1.1. Le chitosan (CHT)
1.2. Le polymère de cyclodextrines soluble (PCD)
1.3. La ciprofloxacine (CIP)
1.4. La rifampicine (RFP)
2. Méthodes
2.1. Préparation des hydrogels lyophilisés de CHT et de PCD
2.2. Préparation des hydrogels lyophilisés
2.3. Caractérisation des hydrogels
2.3.1. Test du flacon retourné
2.3.2. Étude rhéologique
2.4. Caractérisation des éponges
2.4.1. Étude de la microstructure par MEB (Microscopie Électronique à Balayage)
2.4.2. Étude de la dégradation
2.4.3. Étude du gonflement
2.4.4. Essais mécaniques
2.5. Étude des cinétiques d’absorption et de libération des éponges imprégnées
2.5.1. Cinétique d’absorption
2.5.2. Libération en condition dynamique
2.6. Tests biologiques
2.6.1. Étude de la cytotoxicité – méthode de l’extrait (contact indirect)
2.6.2. Évaluation de l’activité antibactérienne
2.7. Analyses statistiques
Chapitre 3 : Résultats et Discussion
Partie 1 : Conception et caractérisation des éponges
1. Préparation et caractérisation des hydrogels
1.1. Observation macroscopique des hydrogels
1.2. Analyse rhéologique
2. Caractérisation des éponges
2.1. Observations macroscopiques des éponges
2.2. Observations microscopiques de la microarchitecture des éponges
2.3. Évaluation de la dégradation des éponges
2.4. Gonflement des éponges
2.5. Propriétés mécaniques des éponges
2.6. Évaluation de la cytotoxicité des éponges
3. Conclusion
Partie 2 : Étude in vitro du chargement et de la libération des principes actifs
1. Étude des paramètres de chargement des principes actifs
1.1. Interactions CD/antibiotiques
1.2. Influence du temps de chargement
1.2.1. Chargement de la ciprofloxacine
1.2.2. Chargement de la rifampicine
1.2.3. Conclusion
2. Étude de la libération des principes actifs en mode dynamique
2.1. Étude de la libération de la ciprofloxacine
2.2. Étude de la libération de la rifampicine
3. Conclusion
Partie 3 : Étude in vitro de l’activité des éponges chargées d’antibiotiques
3.1. Test de diffusion
3.1.1. Éponges chargées avec la ciprofloxacine
3.1.2. Éponges chargées avec la rifampicine
3.1.3. Éponges chargées avec l’association ciprofloxacine-rifampicine
3.2. Test de la réduction bactérienne (Kill Time)
3.2.1. Éponges chargées avec ciprofloxacine
3.2.2. Éponges chargées avec la rifampicine
3.2.3. Éponges chargées avec l’association de ciprofloxacine/rifampicine
3.3. Conclusion
Chapitre 4 : Conclusions et perspectives
Conclusion et discussion générale
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