Ingénierie génétique de la levure oléagineuse Yarrowia Lipolytica pour la production de lipides

LIPIDES

Les lipides constituent une classe chimiquement hétérogène composée de substances hydrocarbonées portant des fonctionnalités très différentes, et ayant pour propriétés communes d’être insolubles dans l’eau et d’être solubles dans des solvants organiques comme le chloroforme, les hydrocarbures et les alcools. Ces molécules amphiphiles, constituent en solution dans l’eau, des structures dans lesquelles le pôle hydrophobe est enfoui tandis que l’extrémité polaire s’expose en surface au contact de l’eau (micelles, vésicules, etc.). Cela leur permet de constituer des structures bidimensionnelles, telles que des membranes fluides tout en étant totalement imperméables à l’eau et aux molécules polaires, à la base de toutes les membranes biologiques. Ainsi, bien que non polymérisable, cette classe de molécule joue un rôle structurel important chez les êtres vivants (membrane cellulaire). Ces molécule constituent également des éléments énergétiques car leur état d’oxydation est très bas (en particulier s’il s’agit de graisses ou de triacylglycérols).

Répartis dans tout le monde vivant, les lipides sont trouvés dans tous les types de cellules, et ces molécules peuvent être impliquées de la régulation de la transcription de gènes à la régulation de voies métaboliques vitales. Néanmoins, on peut diviser les lipides en deux grandes catégories : ceux constitués à partir des acides gras et ceux constitués à partir de stérols. Les acides gras sont les lipides les plus simples, que l’on retrouve comme constituants de nombreux types de lipides plus complexes. Leur structure étant extrêmement polymorphe, on connaît plus de 300 types d’acides gras différents chez les végétaux (Voelker et Kinney, 2001), il est difficile de les définir d’un point de vue structural. En forme libre les acides gras sont assez rares dans la cellule, car ils sont susceptibles d’avoir des effets toxiques sur les membranes. Habituellement les acides gras entrant dans la cellule sont activés en acyl-CoA. On les trouve ainsi estérifiés dans les phospholipides, les sphingolipides et les triglycérides. Les lipides constitués des stérols sont les hormones stéroïdes, des vitamines et autres terpènes. Suivant les règnes, la complexité et le rôle des stérols va grandement varier, notamment chez les végétaux qui composent des stéroïdes particuliers. Les brassinostéroïdes chez les brassicacées sont impliqués dans la signalisation et dans la rigidité des membranes. Chez les microorganismes la diversité des lipides constitués des stérols est moins important car ils contiennent essentiellement de l’ergostérol et ses précurseurs. Chez les animaux cette classe de lipides comporte les hormones stéroïdes. Sous forme estérifiée, les stérols peuvent représenter une quantité assez importante des acides gras. C’est le cas de la levure S. cerevisiae où plus que 50% des lipides de stockage se trouvent sous forme d’esters des stérols (Daum et al., 1998).

Classification et fonction des lipides

Du fait de la grande diversité des lipides et de la difficulté à adopter une définition universelle, il n’existe pas de classification unique des lipides. Dans cette partie les lipides sont distingués en fonction de leur polarité afin de discuter leurs propretés physiques. Les lipides polaires constituent une classe à part dans les matières grasses puisque comme leur nom l’indique, ces lipides possèdent une partie hydrophile qui leur permet de jouer un rôle prépondérant au niveau des interfaces que ce soit dans les organismes vivants ou dans les systèmes dispersés.

Les acides gras
Les acides gras sont les constituants de nombreux types de lipides. Ils sont constitués d’un squelette alcane (R) portant une fonction acide carboxylique terminale (-COOH). Ils se distinguent par la longueur de la chaîne hydrocarbonée, son degré d’insaturation, la localisation et la conformation (cis, trans) des doubles liaisons, la présence et la position de modifications éventuelles (hydroxylation, époxydation, etc.). Leurs diagrammes de phases peuvent être très complexes et leurs propriétés physiques sont affectées par les modifications qu’ils peuvent porter. Les acides gras sont désignés par le nombre de carbone de la chaîne aliphatique, le nombre de double liaisons (Δ), leurs positions et leurs configurations (cis ou trans). La position des modifications est faite en prenant comme référence la fonction acide carboxylique (Δ) de la molécule. Certains auteurs se réfèrent au méthyle terminal (numérotation ω ou n) .

Les phospholipides

Les phospholipides (PL) et les triacylglycérides (TAG) sont les lipides les plus importants en biologie, les deux dérivent du diacylglycérol (DAG). Le glycérol est une molécule à trois atomes de carbone, chacun portant un groupement hydroxyle (triol). Ces groupements hydroxyles peuvent réagir avec le groupement acide des acides gras pour former une liaison ester. A un glycérol, peuvent donc se fixer de 1 à 3 acides gras (chaine acyle-R). Les molécules obtenues sont nommées en conséquence, monoacylglycérides (MAG), diacylglycérides (DAG) et triglycérides (TAG). Les phospholipides sont donc composés d’un squelette glycérol contenant des chaines acyles liées par une liaison ester en positions sn1 et sn2. Le troisième carbone est estérifié par une liaison phosphodiester d’un dérivé X de l’acide phosphorique (XPO4) et constitue la tête polaire . Les phospholipides sont donc des molécules amphiphiles dont les parties hydrophobes peuvent s’associer entre elles, en excluant l’eau du milieu, les parties hydrophiles restant en interaction avec l’environnement aqueux, ce qui a pour conséquence la formation spontanée de bicouches, à l’origine des membranes. Ces membranes permettent aux cellules de séparer leurs constituants internes de l’environnement externe. C’est ce même principe que la cellule utilise afin de différencier ses organelles. La parcellisation permet la ségrégation des réactions chimiques, d’accroître leur efficacité biochimique et d’éviter la dispersion des produits réactionnels.

Les classes de phospholipides sont définies par la nature du composant X. Les phospholipides des membranes plasmiques les plus représentés de manière quantitative sont la phosphatidylcholine (PC) et les aminophospholipides, la phosphatidyléthanolamine (PE) et la phosphatidylsérine (PS) qui sont des diacylglycérides estérifiés par un groupement azoté, et le phosphatidylinositol (PI) qui est un diacylglycéride estérifié par un polyalcool cyclique. A pH 7, le groupe phosphate porte une charge négative ; donc si le groupement X est neutre ou chargé négativement, comme pour le PI et la PS, le phospholipide est anionique ; si X porte une charge positive, le phospholipide est électriquement neutre ou zwitterionique, comme dans le cas de la PC et de la PE.

Les phospholipides sont, avec le cholestérol, les lipides les plus abondantes de la membrane, suivis par les sphingolipides. La plupart des biomembranes contiennent une grande diversité d’espèces moléculaires de phospholipides. Cette diversité est générée par le grand nombre de combinaisons possibles des diverses têtes polaires (choline, éthanolamine, inositol et sérine) avec les différentes chaines acyles. En général, la distribution des chaines acyles est asymétrique (Hanahan, 1954). Les phospholipides de levure par exemple possèdent en effet plutôt des chaînes acyles saturées en position sn-1 (comme le palmitate) et des acyles insaturées (comme l’oléate) en position sn-2 (Wagner et Paltauf, 1994). La tête polaire ainsi que la composition en chaînes acyles des phospholipides déterminent les propriétés de la membrane. La charge du groupement polaire affecte le potentiel de surface de membranes (Cerbon et Calderon, 1991). La composition lipidique, alors, fournit aux membranes le potentiel de bourgeonnement, de mise en forme, de fission et de fusion. Ce sont là des caractéristiques essentielles pour la division cellulaire, la reproduction biologique et la circulation intracellulaire. Les lipides affectent aussi l’activité des protéines membranaires permettant en plus l’agrégation et la dispersion des ces protéines (Chen et Wilson, 1984). La taille de la tête polaire détermine l’état physique des membranes qui est en générale sous forme liquide-cristallin dans la plupart des organismes (Zweytick et al., 2000).

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Table des matières

LISTE DES ABREVIATIONS
I. AVANT PROPOS
II. INTRODUCTION
A. LIPIDES
A.1 Classification et fonction des lipides
A.1.1 Les acides gras
A.1.2 Les phospholipides
A.1.3 Les sphingolipides
A.1.4 Les glycérides : MAG, DAG, TAG
A.1.5 Les stérols et leurs esters
A.1.6 Les cérides
A.2 Les lipides neutres comme éléments de réserve
B. Accumulation des lipides chez les microorganismes/ levures
B.1 Les corps lipidiques
B.2 Les microorganismes oléagineux
B.3 Déclenchement de l’accumulation de lipides chez les microorganismes
B.4. L’intérêt des lipides de levures et de Y. lipolytica
B.4.1 Les souches de Y. lipolytica
B.4.2 Physiologie, taxonomie et intérêt de la levure Y. lipolytica
B.5. PUBLICATION I
The Hydrocarbon- Degrading Oleaginous Yeast Yarrowia lipolytica
C.1 Biosynthèse des acides gras : accumulation de novo
C.1.1 Activation des acides gras et de leurs précurseurs
C.1.2 Régulation de la biosynthèse des acides gras par les acyl-CoA synthases
C.2 Provenance du carbone utilisé pour la biosynthèse des acides gras
C.2.1 Production d’acétyl-CoA à partir du citrate par l’ACC
C.2.2 L’ATP citrate lyase et le déclenchement de l’accumulation
C.2.3 Le malonyl-CoA
C.2.4 L’acétyl-CoA carboxylase (ACC)
C.2.5 L’acide gras synthase (FAS)
C.2.6 L’apport du NADPH est régulé par l’enzyme malique
C.2.7 Régulation de l’ACC et de la FAS
C.3 Réactions de modification
C.3.1 Elongation
C.3.2 Régulation de l’élongation
C.3.3 Désaturation des acides gras
C.3.4 Régulation des désaturases
D. La synthèse ex novo
D.1 Assimilation du substrat
D.2 Transport des AGL
D.3 PUBLICATION II
Uptake and Assimilation of Hydrophobic Substrates by the Oleaginous Yeast Yarrowia Lipolytica
E. Accumulation de lipides de réserve
E.1 La voie de synthèse des TAG
E.2 La synthèse des esters de stérols
E.2.1 Régulation de la synthèse des esters de stérols
E.3 Stockage dans les corps lipidiques
E.4 Biosynthèse des corps lipidiques
F. Voie de dégradation des réserves lipidiques
F.1 Les TAG lipases
F.2 Voie de la β-oxydation
F.2.1 Les acyl-CoA oxydases
F.2.2 Les enzymes impliquées dans la voie de la β-oxydation
F.3 Le destin de l’acétyl-CoA issue de la β-oxydation
F.4 Interaction des voies du métabolisme
F.4.1 PUBLICATION III
Yarrowia lipolytica: A model and a tool to understand the mechanisms implicated in lipid accumulation
G. Les outils génétiques existants pour la modification de Y. lipolytica
G.1 Les marqueurs de sélection
G.2 Les promoteurs
G.3 Les systèmes d’amplification
G.4 Le système Cre lox recombinase
H. Applications Biotechnologiques de Y. lipolytica
H.1 PUBLICATION IV
Yarrowia Lipolytica as a Cell Factory for Oleochemical Biotechnology
I. Conclusion
I.1 PUBLICATION V
Yarrowia lipolytica as a model for bio-oil production
III. MATERIEL ET METHODES
A. Matériels
A.1. Souches
A.2 Vecteurs
A.2.1 Plasmides
A.2.2 Vecteurs d’expression
A.3. Milieux de culture
A.3.1. Milieu de culture complet pour E.coli : LB
A.3.3. Milieux de culture pour Y. lipolytica
A.3.4. Milieux de sélection des transformants de Y. lipolytica
A.3.5. Milieux de synthèse des acides gras
A.3.6. Milieux d’accumulation des acides gras
B. Méthodes Génétiques
B.1 Analyse in silico des séquences d’intérêt
B.2. Méthodes de préparation/ extraction de l’ADN
B.2.1Préparation de l’ADN plasmidique bactérien
B.2.2 Préparation de l’ADN génomique de levure
B.3. Amplification des séquences par PCR
B.4. Techniques de préparation et d’analyse de l’ADN
B.4.1. Purification de fragments d’ADN
B.4.2. Analyse des fragments d’ADN par séparation électrophorétique
B.4.3. Dosage de l’ADN
B.4.4. Hydrolyse par des endonucléases de restriction
B.4.5. Déphosphorylation de l’ADN
B.4.6. Ligature de l’ADN
B.5. Techniques de transformation
B.5.1. Transformation d’E. coli
B.5.2. Transformation de Y. lipolytica
B.6. Construction de vecteurs de disruption/ surexpression
B.6.1. Construction des cassettes de disruption
B.6.2. Construction de vecteurs de surexpression
B.6.3. Excision du marqueur de sélection – expression de la recombinasse Cre
B.6.4. Vérification de la transformation et de l’excision
B.7. Conditions de culture et de croissance de souches
B.7.1. Conditions de culture
B.7.2. Estimation de la croissance /biomasse
B.8. Techniques analytiques
B.8.1. Microscopie optique
B.8.2. Coloration de cellules au rouge Nil / Microscopie de fluorescence
B.8.3. Extraction des lipides
B.8.4. Séparation des lipides
B.8.5. Chromatographie sur couche mince (CCM)
B.8.6. Transméthylation des acides gras
B.8.7. Chromatographie Phase Gazeuse (CPG)
B.8.8. Quantification et analyse des corps lipidiques (CLs)
IV. CONCLUSION

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