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Structure et biosynthèse de peptidoglycane
Le peptidoglycane est constitué de chaines glycanes reliées entre elles par des tiges peptidiques [62]. La sous-unité du peptidoglycane comprend un disaccharide composé d’une N-acétyl glucosamine (GlcNAc) et d’un acide N-acétyl muramique (MurNAc) reliés par une liaison β-1,4. Chez certaines espèces, notamment chez les mycobactéries, l’acide muramique est N-glycolylé (MurNGlyc) au lieu d’être N-acétylé [63]. Le groupement D-lactoyl du MurNAc est substitué par une tige peptidique composée d’une alternance de résidus d’acides aminés de configuration L et D, le plus fréquemment L-Ala-γ-D-Glu-mA2pm (ou L-Lys)-D-Ala-D-Ala (mA2pm, acide meso-2,6-diaminopimélique). La polymérisation du peptidoglycane implique la formation de liaisons β-1,4 entre les disaccharides pour former les chaînes glycanes et de liaisons amides entre chaînes peptidiques portées par des chaînes glycanes adjacentes pour former les ponts interpeptidiques. Ces dernières relient le plus souvent la D-Ala en position 4 et l’acide aminé en position 3 (mA2pm ou L-Lys).
La synthèse du peptidoglycane est complexe et implique trois parties qui ont lieu dans le cytoplasme (synthèse des précurseurs nucléotidiques), en liaison avec le feuillet interne de la membrane cytoplasmique (synthèse des intermédiaires liés au transporteur lipidique, l’undécaprénol ou bactoprénol) et à la face externe de la membrane cytoplasmique (réaction de polymérisation de la sous-unité disaccharide-pentapeptide).
La première étape est la formation de l’UDP-GlcNAc (uridine-diphospho-N-acétylglucosamine) à partir du fructose-6-phosphate et de la L-glutamine. Les enzymes qui interviennent dans cette étape sont la glucosamine-6-phosphate synthase (GlmS), la phosphoglucosamine mutase (GlmM), la glucosamine-1-phosphate acetyltransferase et la N-acetylglucosamine-1-phosphate uridyltransferase, ces deux dernières activités étant présentes dans l’enzyme bifonctionnelle GlmU.
La deuxième étape est la formation de l’UDP-MurNAc à partir de l’UDP-GlcNAc, catalysée par les enzymes MurA et MurB. Lors cette étape, MurA forme un produit, l’énolpyruvate UDP-N-GlcNAc, qui est ensuite réduit en UDP-MurNAc par la réductase MurB grâce aux cofacteurs FADH2 et NADPH. NADPH est un intermédiaire dans le transfert de proton entre le FADH2 et l’énolpyruvate UDP-N-acetylglucosamine [65, 66]. MurA est une cible d’un antibiotique, la fosfomycine, qui forme un adduit covalent avec la cystéine en position 115 de cette enzyme, le résidu important pour la réactivité de l’enzyme [67]. Chez M. tuberculosis ce résidu est substitué par un acide aspartique conduisant à l’absence d’activité de la fosfomycine [68].
La troisième étape est l’assemblage de la tige peptidique. Les enzymes impliquées dans cet assemblage, les Mur ligases, ajoutent séquentiellement au groupement D-lactoyl de l’UDP-MurNAc les acides aminés L-Ala (MurC), D-Glu (MurD) et mA2pm ou L-Lys(MurE) ainsi que le dipeptide D-Ala-D-Ala (MurF). Les quatre réactions catalysées par les Mur ligases aboutissent à la formation du dernier précurseur nucléotidique soluble de la voie de synthèse du peptidoglycane, l’UDP-MurNAc-pentapeptide ou nucléotide de Park. Certains substrats utilisés par les Mur ligases nécessitent des enzymes supplémentaires dédiées à la synthèse du peptidoglycane. Ainsi, le dipeptide D-Ala-D-Ala est synthétisé par la ligase Ddl à partir de deux D-alanines issues de la racémisation de la L-alanine. L’acide D-glutamique est aussi obtenu par racémisation.
Les étapes membranaires de la synthèse du peptidoglycane débutent par la réaction catalysée par la transférase MraY [69, 70]. Cette enzyme catalyse le transfert du groupement phospho-MurNAc-pentapeptide du nucléotide de Park sur l’undecaprényl-phosphate pour former l’undécaprényl-pyrophospho-MurNAc-pentapeptide (intermédiaire lipidique I ou lipide I) [71]. Ensuite, la transférase MurG catalyse le transfert du GlcNAc de l’UDP-GlcNAc au lipide I pour former l’undécaprényl-pyrophospho-MurNAc(pentapeptide)GlcNAc (intermédiaire lipidique II ou lipide II). Cette réaction achève la biosynthèse de la sous-unité du peptidoglycane, un disaccharide pentapeptide, qui reste lié au transporteur lipidique pour permettre sa translocation vers le feuillet externe de la membrane cytoplasmique grâce à des flippases [72].
La dernière partie de la synthèse du peptidoglycane implique deux types de réactions catalysées par les glycosyltransférases, responsables de la formation des chaînes glycanes, [73-75] et par les transpeptidases, responsables de la formation des ponts interpeptiques qui relient les chaînes glycanes entre elles [76]. Ces enzymes sont décrites en détail dans la section qui suit.
Protéines de liaison à la pénicilline
Les protéines de liaison à la pénicilline (PLP) constituent une large famille d’enzymes qui ont comme propriété commune de lier les β-lactamines et d’assurer des fonctions variées dans la polymérisation et la maturation du peptidoglycane. Les PLP bifonctionnelles de classe A assurent la polymérisation des chaînes glycanes (transglycosylases) et la formation des ponts interpeptidiques (transpeptidases). Les PLP de classe B assurent uniquement cette deuxième fonction. Les D,D-carboxypeptidases hydrolysent la liaison entre la D-Ala4 et la D-Ala5 des précurseurs du peptidoglycane mais ne forment pas de ponts interpeptidiques. Les endopeptidases hydrolysent les ponts interpeptidiques [77, 78].
Toutes les PLP contiennent un domaine de liaison aux β-lactamines qui présente des similarités structurales et fonctionnelles mais diffèrent par la nature et le nombre de domaines qui lui sont associés. Les PLP de haut poids moléculaire associent à un domaine transpeptidase situé à l’extrémité C-terminale de la protéine un domaine glycosyltransférase (PLP de classe A) ou un domaine dit de morphogenèse (PLP de classe B) dépourvu d’activité enzymatique connue. Ce domaine pourrait jouer un rôle dans la morphogénèse de la macromolécule du peptidoglycane grâce à des interactions avec d’autres protéines impliquées dans le cycle cellulaire [79-81]. Les PLP de haut poids moléculaire comprennent le plus souvent une queue cytoplasmique de quelques acides aminés qui précède un segment transmembranaire permettant l’ancrage des enzymes dans la membrane cytoplasmique [76]. Des domaines additionnels peuvent être présents comme les domaines de fixation aux lipoprotéines LpoA et LpoB dans les PLP de classe A d’Escherichia coli [82].
Les PLP de bas poids moléculaire, PLP de Classe C selon certains auteurs, présentent des activités D,D-carboxypeptidase et endopeptidase. La plupart des bactéries produisent plusieurs PLP de classe A, B, et C qui assurent des fonctions partiellement redondantes. Ainsi, M. tuberculosis produit deux PLP de Classe A, deux PLP de Classe B, six PLP de Classe C et une lipoprotéine apparentée aux PLP de Classe B [83].
Le domaine de liaison à la pénicilline des PLP présente trois motifs conservés : SXXK, S(Y)XN(C) et K(H)T(S)G (où x est un résidu variable) [76]. La sérine du motif SxxK est le résidu catalytique essentiel pour l’activité enzymatique. Lors de la catalyse, l’hydroxyle de cette sérine attaque le carbonyle de la liaison peptidique D-Ala4-D-Ala5 d’un donneur d’acyle pentapeptidique pour former une liaison ester reliant le carbonyle de la D-Ala4 à l’oxygène porté par le carbone β de la sérine (Figure 2). Cette réaction, qui conduit à la formation d’un adduit covalent, l’acylenzyme, s’accompagne de la libération de la D-Ala5. Dans la deuxième étape, le carbonyle de la D-Ala4 de l’acylenzyme subit une attaque nucléophile par l’amine du second substrat, l’accepteur d’acyle, pour former la liaison interpeptidique et régénérer l’enzyme libre. Cette liaison relie le carbonyle de la D-Ala4 du donneur d’acyle à l’amine localisée à l’extrémité de la chaîne latérale du 3ème résidu de l’accepteur d’acyle (mA2pm ou L-Lys) (Liaison interpeptidique du type 4 3) (Figure 2) [77].
Les L,D-transpeptidases
Les D,D-transpeptidases classiques appartenant à la famille des PLP ne sont pas les seules enzymes responsables de la formation des ponts interpeptidiques du peptidoglycane. En effet, cette fonction peut être assurée par des L,D-transpeptidases, qui se substituent aux PLP, le plus souvent partiellement, chez un grand nombre, mais pas la totalité des espèces bactériennes. Le premier représentant de cette famille d’enzymes a été identifié chez un mutant de Enterococcus faecium obtenu in vitro après cinq étapes de sélection sur des milieux contenant des concentrations croissantes d’ampicilline [88]. Cette sélection a été effectuée à partir de la souche parentale E. faecium D344S qui est hypersensible à l’ampicilline (CMI = 0,06 µg/ml) parce que la délétion d’une partie du chromosome de cette souche a entraîné la perte du gène codant pour une PLP de faible affinité pour les β-lactamines chez les entérocoques (PLP5) [89]. Le mutant obtenu en cinq étapes, M512, est très résistant à l’ampicilline (CMI > 2000 µg/ml). La structure du peptidoglycane de la souche parentale D344S et du mutant M512 a été analysée par HPLC couplée à la spectrométrie de masse. Cette analyse a mis en évidence chez M512 la présence de 100% de ponts interpeptidiques contenant la séquence L-Lys3→D-iAsn-L-Lys3 qui remplacent les ponts interpeptidiques classiques (D-Ala4 →D-iAsn-L-Lys3) présents chez la souche parentale D344S. Ce résultat a permis de proposer que la formation des ponts interpeptidiques chez le mutant M512 implique la production d’une L,D-transpeptidase qui clivait la liaison L-Lys3-D-Ala4 d’un donneur d’acyle et liait le carbonyle de la L-Lys3 au groupement amine de l’accepteur d’acyle qui est porté chez E. faecium par un résidu D-iso-asparaginyl (D-iAsn) branché sur la L-Lys3. De manière plus générale, les ponts interpeptidiques formés par les L,D-transpeptidases sont nommés du type 3→3 puisqu’ils relient la position 3 du peptide donneur d’acyle à la position 3 de l’accepteur d’acyle. Comme décrit précédemment, les D,D-transpeptidases classiques appartenant à la famille des PLP catalysent la formation de ponts du type 4→3 reliant la position 4 du donneur d’acyle à la position 3 de l’accepteur d’acyle. Les transpeptidases sont nommées d’après la configuration des acides aminés qui bordent la liaison clivée dans le donneur d’acyle : D-Ala4-D-Ala5 pour les D,D-transpeptidases appartenant à la famille des PLP et L-Lys3-D-Ala4 pour les L,D-transpeptidases. Grâce au développement d’un essai enzymatique, la L,D-transpeptidase de E. faecium (Ldtfm) a été purifiée à partir d’un extrait brut du mutant M512 donnant ainsi accès à la séquence N-terminale de la protéine afin d’identifier le gène codant pour Ldtfm. La surexpression de ce gène chez E. coli a permis la purification de l’enzyme en quantités importantes pour les études fonctionnelles et structurales [90]. Le domaine catalytique de Ldtfm, identifié par des sous-clonages, ne présente pas de similarités structurales avec d’autres protéines, incluant les PLP [91]. Ldtfm est une enzyme à cystéine active contrairement aux PLP qui utilisent une sérine comme nucléophile. Le domaine catalytique de Ldtfm produit chez E. coli et purifié catalyse in vitro la formation de ponts du type 3→3 en utilisant comme substrats des disaccharide-peptides purifiés à partir du peptidoglycane d’un entérocoque. La première étape de cette réaction implique l’attaque nucléophile par la cystéine active de Ldtfm du carbonyle de la L-Lys3 d’un donneur d’acyle tétrapeptidique conduisant à la rupture de la liaison L-Lys3-D-Ala4, au départ du groupement partant (D-Ala4), et à la formation d’une acylenzyme contenant une liaison thioester (Figure 4B). La cystéine catalytique pourrait être activée grâce au transfert du proton du groupement sulfhydrile à un résidu histidine conservé au sein d’une triade catalytique (Cys-His-Asp) [91]. Les fragments de peptidoglycane contenant un pentapeptide ne sont pas utilisés par Ldtfm comme donneur d’acyle. La deuxième étape de la réaction de transpeptidation débute par une attaque nucléophile de l’acylenzyme par le groupement amine porté par le résidu D-iAsn de l’accepteur d’acyle. Ceci conduit à la formation du pont interpeptidique du type 3→3 (L-Lys3→D-iAsn-L-Lys3). Ldtfm n’est pas inhibée in vitro par l’ampicilline en accord avec la synthèse de ponts du type 3→3 en présence de cet antibiotique chez M512 et la résistance de haut niveau à l’ampicilline de ce mutant.
Le substrat tétrapeptidique de Ldtfm est obtenu chez M512 par le clivage de la liaison D-Ala4-D-Ala5 des tiges pentapeptidiques par une D,D-carboxypeptidase (Figure 4A). Chez E. faecium, cette D,D-carboxypeptidase n’est pas une PLP, mais une metalloenzyme, DdcY, qui appartient à la famille VanY [92]. Cette famille d’enzymes n’est pas inhibée par les β-lactamines. Il a été montré que l’augmentation de la proportion des ponts du type 3→3 (de 3 à 100%) et du niveau de résistance à l’ampicilline (de 0,06 à >2000 microg/ml) lors de la sélection en cinq étapes du mutant M512 ne sont pas associés à une modification de Ldtfm ou de son niveau de production. Ces modifications impliquent une augmentation du niveau de production de DdcY due à une mutation dans le gène codant pour le senseur d’un système à deux composantes qui contrôle la synthèse de cette D,D-carboxypeptidase.
Inactivation des L,D-transpeptidases par les carbapénèmes
Les L,D-transpeptidases ne sont pas inhibées par les β-lactamines de la classe des pénames [90]. Cependant, il a été montré que ces enzymes sont inhibées de manière irréversible par les β-lactamines de la classe des carbapénèmes et dans une moindre mesure par les céphalosporines [35]. En 2007, une accumulation de l’acylenzyme stable formée par Ldtfm et l’imipénème a été mise en évidence par spectrométrie de masse [35]. Le mécanisme d’inhibition des L,D-transpeptidases de E. faecium [104-106] et de M. tuberculosis [97, 107] par les β-lactamines a ensuite été étudié d’un point de vue cinétique et structural. Les L,D- transpeptidases de M. tuberculosis LdtMt1, LdtMt2, LdtMt3, et LdtMt4 sont efficacement inactivées par les carbapénèmes utilisés en thérapeutique (l’imipénème, le méropénème, l’ertapénème et le doripénème) [97]. A l’inverse de ces quatre L,D-transpeptisases, LdtMt5 ne forme pas d’acylenzyme avec les carbapénèmes.
Des études cinétiques de l’inhibition des L,D-transpeptidases par spectrophotométrie et spectrofluorimétrie ont été développées par le laboratoire d’accueil [105]. La spectrophotométrie est basée sur l’observation de la diminution de l’absorbance du carbapénème due à l’ouverture du cycle β-lactame. Cette méthode a permis d’évaluer l’efficacité de l’acylation de l’enzyme par un carbapénème par le rapport kinact/Kapp (µM-1 min-1) et également de mettre en évidence l’absence d’hydrolyse ou l’hydrolyse très faible des acylenzymes (k3 ≤ 10-4 s-1). La spectrofluorimétrie a permis de suivre la formation d’un intermédiaire réactionnel en observant les variations de fluorescence des résidus tryptophanes de l’enzyme. Les résultats obtenus par les analyses cinétiques, par résonnance magnétique nucléaire (RMN) et pas spectrométrie de masse ont permis de proposer le mécanisme catalytique décrit dans la Figure 6. La première étape de la réaction est la formation réversible d’un intermédiaire tétraédrique, l’oxyanion (EIox). La deuxième étape est la formation irréversible de l’acylenzyme (EI*). Les constantes cinétiques pour la formation de l’oxyanion k1 (µM-1min-1) et de la formation de l’acylenzyme k2 (min-1) ainsi que le rapport kinact/Kapp (µM-1min-1) qui caractérise l’efficacité générale de la réaction, peuvent être déterminées par spectrofluorimétrie [105-107].
Les β-lactamases des mycobactéries
Plusieurs facteurs contribuent à la résistance des mycobactéries aux β-lactamines. Les plus importants sont l’inactivation par des β-lactamases [121, 122] et la faible perméabilité de la mycomembrane [121]. La contribution des pompes d’efflux paraît très limitée [123]. La délétion des gènes codants pour les β-lactamases augment très significativement l’activité des β-lactamines chez Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium abscessus et Mycobacterium smegmatis [124, 125]. Les CMI restent cependant bien supérieures aux CMI observées pour les bactéries à Gram négatif, reflétant une différence de perméabilité entre la membrane externe des bactéries à Gram négatif et la mycomembrane des mycobactéries. Les gènes codant pour les β-lactamases de Classe A d’Ambler, et plus rarement à la classe C, ont été identifiés dans les génomes séquencés des mycobactéries [126-134]. Ces gènes sont chromosomiques. Une activité β-lactamase a été détectée chez la plupart des mycobactéries, à l’exception de quelques représentants des mycobactéries à croissance lente comme Mycobacterium avium complex (Mycobacterium avium et Mycobacterium intracellulaire), Mycobacterium scrofulaceum et Mycobacterium simae [135]. Cette activité a été mise en évidence par un essai qualitatif : les bactéries ont été cassées mécaniquement avec des billes en verre. Le surnageant à la concentration de 10 mg/ml a été déposé sur un disque contenant de la nitrocéfine. Après une incubation de 60 min, l’activité nitrocéfinase a été évaluée selon l’intensité de la couleur rouge avec une échelle allant de 0 à 3) (Tableau 3).
Les β-lactamases des mycobactéries de Classe A ont un spectre de substrats très large incluant les pénames, les céphèmes, les carbapénèmes et les monobactames ([135], [126],[136],[125]). Ces enzymes présentent de fortes identités de séquences entre elles (Figure 7) et avec les β-lactamases des entérobactéries comme TEM et CTX-M (30-50 %).
Détermination des paramètres cinétiques de l’hydrolyse des β-lactamines par les β-lactamases de Classe A
Il est généralement admis que l’hydrolyse des β-lactamines par les β-lactamases comprend les étapes décrites dans le schéma réactionnel ci-dessous (Figure 8), où E est la β-lactamase, S le substrat (la β-lactamine), ES le complexe non-covalent de Henri-Michaëlis, ES* l’acylenzyme, S* la β-lactamine hydrolysée. Les constantes k1 et k-1 sont respectivement les constantes d’association et de dissociation du complexe non-covalent. k2 et k3 sont respectivement les constantes pour les étapes d’acylation et d’hydrolyse de l’acylenzyme. E + S k1 ES k2 ES* k3 E + S* (1).
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Table des matières
I. Classification, structure et positionnement des βlactamines
1. Pénames
2. Céphèmes
3. Carbapénèmes
4. Pénèmes
5. Monobactames
II. Peptidoglycane
1. Structure et biosynthèse de peptidoglycane
2. Protéines de liaison à la pénicilline
3. Mode d’action des β-lactamines
III. Les L,D-transpeptidases
1. Généralités
2. Inactivation des L,D-transpeptidases par les carbapénèmes
IV. Les β-lactamases
1. Classification des β-lactamases
2. Les β-lactamases des mycobactéries
3. Détermination des paramètres cinétiques de l’hydrolyse des β-lactamines par les β- lactamases de Classe A
4. Mécanisme catalytique des β-lactamases de classe A
5. Motifs conservés et structures des β-lactamases de classe A
V. Inhibiteurs de β-lactamase
1. Généralités
2. Le clavulanate
2.1. Mécanisme d’inactivation des β-lactamases par le clavulanate
2.2. Inactivation irréversible de la β-lactamases BlaC de Mycobacterium tuberculosis par le clavulanate
2.3. Acquisition de la résistance aux combinaisons de clavulanate et de β-lactamines chez les entérobactéries
3. Avibactam
3.1. Mécanisme d’action de l’avibactam.
3.2. Etudes cinétiques de l’inactivation des β-lactamases par l’avibactam.
3.3. Constantes cinétiques des β-lactamases des isolats cliniques.
3.4. Etudes structurales et réversibilité de la réaction.
3.5. Résistance aux associations β-lactamine–avibactam
VI. Mycobacterium tuberculosis et Mycobacterium abscessus : généralités et place des β- lactamines en thérapeutique
1. Mycobacterium tuberculosis
2. Mycobacterium abscessus
OBJECTIFS
ARTICLE 1
ARTICLE 2
ARTICLE 3
ARTICLE 4
CONCLUSIONS
ANNEXE I
ANNEXE II
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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