Importance médicale des phlébotomes

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Les agents pathogènes

Classification

Les leishmanies appartiennent :
– à l’ordre des Kinetoplastida,
– à la famille des Trypanosomatidae,
– au genre Leishmania.
Le genre Leishmania a été subdivisé en deux sous genres en fonction de la partie de l’intestin du phlébotome vecteur colonisé par le parasite.
– Les parasites qui se développent dans la partie antérieure de la région du pylore (suprapylaria) forment le sous genre Leishmania ;
– Les parasites se développant au niveau de la région du pylore (péripylaria) forment le sous genre Viannia.
Cette classification basée sur les caractères décrits ci-dessus [41], a été par la suite confirmée par des analyses phylogénétiques [14, 58].
Les sous genres Leishmania et Viannia sont composés de plusieurs complexes d’espèces (Figure 1). Près de 30 espèces sont actuellement décrites et environ 20 parmi elles présentent un intérêt médical ou vétérinaire.

Morphologie

Les leishmanies passent par deux formes au cours de leur cycle évolutif : la forme amastigote et la forme promastigote.

La forme amastigote

C’est une forme ovoïde immobile de 3-5 μm, possédant un noyau, un kinétoplaste et un flagelle intracytoplasmique. On la trouve dans les phagolysosomes des macrophages et d’autres cellules phagocytaires des mammifères. L’observation se fait par examen direct de prélèvements (sang, moelle osseuse, rate, etc.) au microscope optique (Figure 2).

La forme promastigote

Chez le vecteur, les amastigotes se transforment en promastigotes dans le tube digestif du phlébotome (Figure 3). Cette forme est observée uniquement chez le vecteur et en culture in vitro à 26°C : il s’agit d’un organisme fusiforme allongé, de 15-20 μm, très mobile grâce à un flagelle libre ; à la base du flagelle, au voisinage du blépharoplaste, se trouve le kinétoplaste qui est une formation d’ADN mitochondrial caractéristique des kinétoplastidae.

Biologie

Cycle évolutif

Les leishmanies sont des organismes à cycle hétéroxène. Elles alternent entre une phase intracellulaire chez un hôte vertébré, essentiellement des mammifères et une phase extracellulaire chez un hôte invertébré, le phlébotome (Figure 4).
Pendant le repas de sang, le phlébotome infesté injecte à l’hôte les leishmanies au stade infectant, les promastigotes métacycliques. Ils sont ensuite phagocytés par les macrophages et se transforment en amastigotes. Dans les vacuoles parasitophores, les amastigotes vont se diviser jusqu’à provoquer l’éclatement des macrophages. Les leishmanies libérées vont coloniser d’autres macrophages. Ainsi, elles atteignent différents tissus, suivant l’espèce de Leishmania impliquée. La femelle du phlébotome se contamine en ingérant des macrophages parasités pendant un repas de sang sur un hôte contaminé. Dans le tube digestif du phlébotome, les parasites migrent vers l’intestin antérieur et passent par différentes formes promastigotes (promastigotes procycliques, promastigotes nectomonades, promastigotes leptomonades, promastigotes métacycliques). Les promastigotes métacycliques, qui sont les formes infectantes, sont ensuite amassés au niveau de la valve stomodéale du phlébotome, prêts à être injectés à un mammifère hôte lors du prochain repas sanguin [9, 35, 48, 67].

Habitat

Il existe un lien étroit entre les différentes manifestations cliniques observées, l’espèce de Leishmania concernée et sa localisation à l’intérieur du mammifère hôte.
C’est ainsi que L. major zoonotique et L. tropica anthroponotique qui sont les deux principales espèces responsables de la forme cutanée dans le monde colonisent particulièrement la zone cutanée de l’hôte. L. braziliensis responsable de la forme cutanéo-muqueuse dépasse la peau et colonise les parties muqueuses. Pendant que les deux espèces vicérotropes, L. donovani et L. infantum responsables des formes viscérales vont ériger domicile au niveau des viscères: le foie, la rate, la moelle osseuse etc.

Le vecteur: le phlébotome

Morphologie

La connaissance de la morphologie des phlébotomes est un élément obligatoire pour la nomenclature des espèces. Le vocabulaire général reconnu, adapté à l’identification des phlébotomes est largement basé sur divers caractères morphologiques tels que la forme, la taille et la disposition d’un certain nombre d’éléments. Ces éléments sont essentiellement situés au niveau de la tête et du génitalia.
– Les adultes.
Les phlébotomes sont des insectes de petite taille (2-3 mm) (Figure 5). Ils n’attirent guère l’attention du public, en dehors des épisodes de pullulation intense. Cependant, pour peu qu’on y prête attention, ils sont faciles à identifier à cause de leur morphologie générale particulière. Ils ont une couleur gris-jaunâtre, une allure de moustique ; le corps et les ailes sont velus. Ils ont un aspect bossu avec de longues pattes grêles et des ailes lancéolées, dressées au repos en « V » au-dessus du corps [44]. Leur vol est heurté, interrompu par de brèves périodes de repos. L’observation de la morphologie détaillée, en vue notamment de leur identification spécifique, nécessite le montage entre lame et lamelle et l’observation au microscope [1].

Importance médicale des phlébotomes

L’importance médicale des phlébotomes provient du rôle vecteur que jouent certaines espèces dans la transmission de certaines affections. Les phlébotomes peuvent, en effet, inoculer à l’homme Bartonella, responsable de la bartonellose ou maladie de Carrion en Amérique du sud, Phlébovirus, agent de la fièvre des trois jours ou fièvre à papataci en Afrique du nord et dans une partie de l’Asie [1, 2, 37]. Plusieurs phlébovirus sont également transmis par le genre Lutzomyia en Amérique et les genres Phlebotomus et Sergentomyia en Afrique et sur le pourtour méditerranéen [12, 18, 27].
Cependant, les leishmanioses restent la principale affection que les phlébotomes transmettent à travers le monde.
Il faut noter que la piqûre de phlébotome peut parfois provoquer des éruptions prurigineuses assez violentes chez certains individus.

Le réservoir de parasites

Seuls les mammifères sont, à ce jour, trouvés porteurs d’espèces du genre Leishmania qu’elles soient ou non pathogènes pour l’homme. On peut qualifier les leishmanioses d’anthroponoses ou de zoonoses selon que l’homme soit l’hôte réservoir ou l’hôte accidentel. Les réservoirs du Nouveau Monde sont principalement les paresseux, les rongeurs, les primates [60]. Dans l’Ancien Monde, ce sont principalement les petits rongeurs, les canidés et occasionnellement les félidés [74].

Facteurs de risque [59]

Conditions socioéconomiques

La pauvreté accroît le risque de leishmaniose. Les mauvaises conditions de logement et les insuffisances de l’assainissement domestique (par exemple, absence de système de gestion des déchets, égouts à ciel ouvert) peuven favoriser le développement des sites de reproduction et de repos des phlébotomes et augmenter les contacts avec l’homme. Les phlébotomes sont attirés par les repas de sang potentiels que leur offrent les logements surpeuplés. Les comportements humains (par exemple, dormir dehors ou à même le sol) sont également susceptibles d’accroître le risque, que modère l’utilisation de moustiquaires imprégnées d’insecticides.

Malnutrition

Les régimes alimentaires pauvres en protéines, en fer, en vitamine A et en zinc augmentent la probabilité de voir l’infection évoluer en kala-azar.

Mobilité de la population

Les épidémies des deux principales formes de leishmaniose sont souvent associées aux migrations et à l’arrivée de personnes non immunisées dans des zones où il existe déjà des cycles de transmission. L’exposition professionnelle et l’intensification de la déforestation restent des facteurs importants. Par exemple, les personnes qui s’installent dans des terres autrefois boisées se rapprochent de l’habitat du phlébotome, ce qui peut augmenter rapidement le nombre de cas.

Changements environnementaux

Plusieurs changements environnementaux peuvent influencer l’incidence de la leishmaniose, dont l’urbanisation, l’intégration du cycle de transmission dans l’habitat humain et l’empiétement des exploitations agricoles et des zones de peuplement sur les forêts.

Changement climatique

Les conditions climatiques jouent sur la leishmaniose, et l’évolution des précipitations, des températures et de l’humidité a des répercussions importantes à cet égard. Le réchauffement planétaire et la dégradation des terres modifient de plusieurs manières l’épidémiologie de la leishmaniose:
– L’évolution des températures, de la pluviométrie et de l’humidité peut avoir des effets importants sur les vecteurs et les réservoirs en modifiant la distribution et en influant sur les taux de survie et la taille des populations.
– Même les plus faibles variations de températures peuvent avoir une profonde incidence sur le cycle de développement des promastigotes de Leishmania dans les phlébotomes, et permettre ainsi au parasite de se transmettre là où la maladie n’était pas endémique auparavant.
– Il est possible que les sécheresses, les famines et les inondations imputables au changement climatique entraînent des déplacements et migrations massives vers les zones de transmission de la leishmaniose et que la malnutrition affaiblisse l’immunité des populations concernées.

Répartition géographique

Il s’agit d’une parasitose des zones intertropicales (hormis l’Océanie) et tempérées chaudes, signalée dans 88 pays répartis en cinq foyers : méditerranéen, chinois, indien, africain et américain (Figure 11). La prévalence de la maladie est estimée à 12 millions et l’incidence annuelle à 2 millions (1,5 million de leishmanioses cutanées dont 90% en Algérie, Afghanistan, Arabie saoudite, Brésil, Iran, Pérou, Syrie, et 500 000 leishmanioses viscérales dont 90% au Bangladesh, Brésil, Inde, Népal et Soudan).
L’Europe du Sud fait partie du foyer méditerranéen dans la partie occidentale et septentrionale. On n’y rencontre que Leishmania infantum, dont le réservoir principal est le chien [5].
Au Sénégal ces maladies sont bien connues comme étant endémiques dans plusieurs régions du pays [21, 63, 64]. Cependant, elles ont été uniquement étudiées dans l’Ouest du pays, particulièrement dans la région de Thiès [15, 17].

PREVENTION ET LUTTE [59]

Une panoplie de stratégies d’intervention doit être mobilisée pour prévenir et combattre la leishmaniose. La transmission, en effet, s’inscrit dans un système biologique complexe associant l’hôte humain, le parasite, le phlébotome et, parfois, un réservoir animal. Les principales stratégies sont les suivantes :
– Un diagnostic précoce et une prise en prise en charge efficace des cas permettent de réduire la prévalence et de prévenir handicaps et décès. Des médicaments très efficaces et sûrs existent aujourd’hui contre la leishmaniose, en particulier contre sa forme viscérale, et l’accès à ceux-ci s’améliore de façon significative.
− La lutte antivectorielle aide à atténuer ou interrompre la transmission de la maladie en s’attaquant aux phlébotomes, en particulier au niveau domestique. Parmi les méthodes utilisées figurent la pulvérisation d’insecticides, les moustiquaires imprégnées d’insecticides, l’aménagement de l’environnement et la protection personnelle.
− Une surveillance efficace de la maladie est importante. Le dépistage et le traitement précoces des cas aident à réduire la transmission et permettent de surveiller la propagation et la charge de morbidité.
− La lutte contre les réservoirs est complexe et doit être adaptée à la situation locale.
− Mobilisation sociale et renforcement des partenariats : il s’agit de mobiliser les communautés et de les informer au moyen d’interventions efficaces visant à modifier les comportements par des stratégies de communication adaptées à la situation locale. Les partenariats et la collaboration avec les différentes parties intéressées et avec les autres programmes de lutte contre les maladies à transmission vectorielle sont essentiels.

Sites d’échantillonnage

Nous avons effectué nos échantillonnages dans les périmètres (parcelles) reboisés à Widou Thiengoly représentés sur la carte de la figure (13). Les lieux de collecte étaient représentés par les terriers, autres petits trous du sol, les trous des termitières, les anfractuosités au niveau des arbres et des murs, les chambres des habitations.

Méthodes de capture

Plusieurs techniques de piégeages de phlébotomes ont été utilisées : le piégeage adhésif, le piégeage lumineux de type CDC et les pulvérisations intra-domiciliaires avec insecticides.
– Le piégeage adhésif :
Le piège adhésif consiste en une feuille de papier blanc de 20 cm de côté, de faible épaisseur mais assez rigide, enduite d’huile de Ricin sur les deux faces. Le piège est disposé à l’entrée de terriers, autres petits trous du sol, dans les trous des termitières, les anfractuosités au niveau des arbres et des murs, etc. Il doit être disposé de telle sorte qu’il permette l’entrée et la sortie des animaux qui y ont élu domicile, sans la moindre gêne, ceci pour éviter qu’il soit déplacé (Figure 14). Ce piégeage est le mieux adapté pour recenser le peuplement phlébotomien d’une localité. Il permet une bonne étude de la distribution géographique de ces insectes [54].
– Le piégeage lumineux de type CDC
Le piège est constitué d’un cylindre en plastique, muni d’un système d’aspiration composé d’un petit moteur relié à un ventilateur. Une lampe de faible éclairage est située au-dessus du moteur. Ce cylindre est relié à son extrémité une cage en tulle moustiquaire ; cette dernière permet de recueillir les individus aspirés à l’intérieur par le ventilateur (Figure 15).
Cette méthode de piégeage, qui présente l’avantage de capturer des phlébotomes vivants, est basée sur le phototactisme positif de ces insectes. Les échantillons obtenus sont généralement en bon état et permettent de faire des études systématiques, taxonomiques et surtout parasitologiques efficaces.
– Les pulvérisations intra-domiciliaires
La méthode est basée sur les propriétés asphyxiantes de la pyréthrine, principe actif du produit insecticide “Yotox” qui a été utilisé ici. Après pulvérisation avec les bonbonnes de “Yotox”, la pièce est fermée pendant une douzaine de minutes, le temps nécessaire pour permettre à la pyréthrine d’agir sur les insectes. Un drap blanc étalé sur tout le plancher de la pièce permet de recueillir les insectes tués ou assommés (Figure 16). Les pulvérisations se déroulent entre 8 et 11 heures du matin, période pendant laquelle les phlébotomes sont encore présents dans les habitations.
Cette méthode de capture permet d’avoir une bonne idée de la diversité spécifique des espèces endophiles. Les individus capturés sont soit morts, soit endormis.

Protocole d’échantillonnage

Les phlébotomes étant des insectes à activité nocturne, les pièges CDC et les papiers huilés sont mis en place en fin d’après-midi, juste avant la tombée de la nuit, pour être relevés le lendemain matin avant 8 heures.
Pour le piégeage lumineux, ce sont 18 pièges de type CDC, en raison de 12 pièges dans les périmètres reboisés, principalement dans des touffes d’arbres, à l’entrée de grands terriers et de petits terriers parfois, 6 dans les habitations dont 3 à l’intérieur et 3 autour des habitations.
Pour le piégeage adhésif, 30 papiers huilés ont été utilisés en fonction des périmètres de captures retenus.
Les pulvérisations de pyréthrines à l’intérieur des habitations ont été faites en raison de 3 chambres par village et par jour représentant 30 pièces pulvérisées.

Conservation

Les individus récoltés sont classés selon la date et le type de piégeage, ceci pour permettre une meilleure exploitation des résultats.
Pour le piégeage lumineux CDC et les pulvérisations intradomiciliaires, les phlébotomes capturés sont prélevés et conservés dans de l’alcool à 70°.

Montage et identification

L’ensemble des individus capturés (mâles et femelles), ont été identifiés au laboratoire. Les mâles ont été montés de façon permanente entre lame et lamelle, la tête en position dorsoventrale, les ailes et les pattes bien étalées. Après passages successifs dans les bains suivants : éclaircissement dans une solution de potasse 20 %, pendant deux heures, rinçage à l’eau distillée pendant 2 x 30 minutes, mordançage dans la solution de Marc André pendant 1 heure au moins, déshydratation à l’alcool à 70° (30 minutes) puis à 90° (30 minutes). L’identification des espèces a été réalisée au microscope photonique après séchage des lames dans une étuve à 40° C pendant au moins 48 heures.
Concernant les femelles c’est la méthode d’identification rapide qui a été utilisée. Seuls la tête et le génitalia ont été montés sur la lame. Ils ont tout d’abord été séparés du reste du corps. Ils ont été ensuite immergés dans une goutte du liquide Marc André portée à ébullition grâce à la flamme d’un briquet ou d’un bec de gaz. Après cette étape, ils ont été bien étalés sur la lame, dans une goutte de liquide de montage (baume du Canada), la face ventrale de la tête vers le haut. L’identification peut se faire juste après la pose de la lamelle ou plusieurs jours après. Cette méthode a permis de garder le reste du corps pour d’autres utilisations comme les extractions.

Diagnostic moléculaire

Extraction ADN

Après dissection des phlébotomes (montage tête + génitalia), le corps est placé à sec à -20°C dans des tubes 1,5 ml.
1) Ajouter 30μl du 1er tampon de lyse (ATL) et broyer le corps dedans avec un petit « piston pellet » à usage unique ou stérilisé.
2) Compléter après broyage avec150 μl pour arriver au 180 μl finaux de tampon. Enlever le piston. (évidemment).
3) Ajouter 20 μl de PK
4) 30 mn à 56°C (cela suffit surtout si l’on remue un peu après 10 et 20 minutes). Vortex 15 secondes
5) Ajouter 200 μl de tampon AL. Vortex 15 secondes
6) 10 minutes à 70°C (nettoyer le bas des tubes avec papier + javel)
7) Ajouter 200 μl d’éthanol absolu
8) Vortex15 secondes
9) Transférer le tout dans une colonne (ne pas toucher la colonne)
10) Centrifuger 1 minute à 6000 rpm
11) Transférer la colonne dans un tube propre et rinçage ave 500μl de tampon AW1
12) centrifuger 1 minute à 6000 rpm
13) Transférer la colonne dans un tube propre et rinçage ave 500μl de tampon AW2
14) Centrifuger 3 minutes à 14000 rpm
15) Transférer la colonne dans un tube 1,5 ml identifié et mettre 30 μl du tampon d’élution.
16) Important : attendre 15 minutes sur le portoir pour augmenter le rendement de l’extraction
17) Centrifuger 1 minute à 8000 rpm
18) Transférer la colonne dans un nouveau tube 1,5 ml identifié et mettre 20 μl du tampon d’élution.
19) Important : attendre 15 minutes sur le portoir pour augmenter le rendement de l’extraction.

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Table des matières

PREMIERE PARTIE : GENERALITES SUR LES LEISHMANIOSES
1- DEFINITION
2- EPIDEMIOLOGIE
2-1 Les agents pathogènes
2-1-1 Classification
2-1-2 Morphologie
2-1-2-1 La forme amastigote
2-1-2-2 La forme promastigote
2-1-2 Biologie
2-1-2-1 Cycle évolutif
2-1-2-2 Habitat
2-2 Le vecteur: le phlébotome
2-2-1 Morphologie
2-2-2 Classification
2-2-3 Biologie
2-2-4 Importance médicale des phlébotomes
2-2-5 Les espèces vectrices de leishmanioses
2-2-5-1 Vecteurs du Nouveau Monde
2-2-5-2 Vecteurs de l’Ancien Monde
2-2-6 Cycle intravectoriel
2-3 Le réservoir de parasites
2-4 Facteurs de risque
2-4-1 Conditions socioéconomiques
2-4-2 Malnutrition
2-4-3 Mobilité de la population
2-4-4 Changements environnementaux
2-4-5 Changement climatique
2-5 Répartition géographique
3-MANIFESTATIONS CLINIQUES
4-TRAITEMENT
5- PREVENTION ET LUTTE
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL DE RECHERCHE
1-MATÉRIELS ET MÉTHODES
1- 1 Le cadre géographique
1- 2 Méthodologie
1-2-1Sites d’échantillonnage
1-2-2Méthodes de capture
1-2-3Protocole d’échantillonnage
1-2-4Conservation
1-2-5Montage et identification
1-2-6Diagnostic moléculaire
1-2-6-1 Extraction ADN
1-2-6-2 PCR diagnostique Leishmania
2-RÉSULTATS ET DISCUSSIONS
2- 1 Diversité et abondance
2- 2 Répartition des phlébotomes en fonction du piégeage
2- 3 Etude parasitologique moléculaire
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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