Impact de la transfection de mutants de la CaMKII sur la force synaptique

Mémoire présenté dans le cadre du programme de maîtrise en neurobiologie pour l’obtention du grade de maître en sciences

Introduction générale
Le système nerveux
L’hippocampe
La mémoire et l’hippocampe
Architecture de l’hippocampe
Modification synaptique à long terme (LTP/LTD) dans l’hippocampe
L’épine dendritique
Le calcium
La calmoduline (CaM)
La kinase calmoduline dépendante II (CaMKII)
Autres kinases majeures : PKA et PKC
Les récepteurs inonotropiques glutamatergiques AMPA et NMDA
Récepteurs AMPA
Récepteur NMDA
Méthode
Modèle utilisé: cultures dissociées d’hippocampe du rat naissant
Protocole de culture
La technique du patch-clamp
Transport et mise en place de l’échantillon
Le choix des cellules
La perfusion
Obtention d’un « gigaseal »
Compensation
Le problème du bruit électrique
Le problème de la dérive de la pipette
Solution extracellulaire
Solution intracellulaire
Analyse des minis
Résultats
Tentatives de reproduction de protocoles de LTP en culture
Lu et al., 2001
Oh et al. 2005
Impact de la transfection de mutants de la CaMKII sur la force synaptique  
Possible potentialisation des minis de types glutamatergiques par application prolongée
d’une lumière intense
Discussion
Le mot de la fin
Références
Annexes
Le projet Rig
Le logiciel libre Rig
Le matériel Rig
Sites critiques de l’alpha CaMKII
Lys42
Thr286
Thr305 et Thr306
Le segment d’autorégulation de l’alpha-CaMKII
Quelques mutants intéressants de l’alpha CaMKII
1-290
1-326 (mCaMKII)
T286D
T286A
T305/306D
K42M
I205K
Méthode de dissociation et culture de neurones de l’hippocampe  
Préparation des disques d’Aclar pour la culture de neurones

Rapport PFE, mémoire et thèse avec la catégorie neurobiologie

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Analyse de la plasticité

Comme dans les papiers ayant servi d’inspiration pour les manipulations effectuées (Lu, Man et al. 2001) et (Oh and Derkach 2005), la plasticité synaptique est analysée simplement par le changement en fonction du temps de l’amplitude et de la fréquence moyennes des minis. Une minute de minis est échantillonnée 5 minutes après le passage en cellule entière suivie d’un échantillonnage continue de 15 minutes pendant lequel le protocole de stimulation est appliqué. Finalement, une minute de minis est enregistrée à chaque 5 minutes jusqu’à la fin. En fait, cette méthode avec seulement une minute d’enregistrement pour estimer la fréquence et l’amplitude des minis s’est avérée sensible à un artefact dont il est question un peu plus loin où la fréquence des minis peut parfois doubler et revenir à son niveau de base sur une échelle de temps de l’ordre de la minute.
Suite à l’identification de cet artefact, des enregistrements de 5 minutes furent utilisés pour estimer la fréquence et l’amplitude des minis.
Il ne faut pas écarter le cas hypothétique d’une potentialisation où le phénomène dominant consisterait en des synapses silencieuses (sans récepteurs AMPA) gagnant un certain nombre de récepteurs AMPA, on pourrait alors avoir une augmentation de la fréquence moyenne des minis mais associée paradoxalement à une baisse de l’amplitude moyenne. Ainsi, la fréquence moyenne peut être considérée un meilleur indicateur que F amplitude moyenne pour mesurer une potentialisation.

Impact de la transfection de mutants de la CaMKII sur la force synaptique

Une méthode pour évaluer par quel mécanisme la CaMKII affecte la force synaptique est de transfecter des neurones en culture avec des mutants dont l’adressage est affecté (Hudmon, Lebel et al. 2005; Bayer, LeBel et al. 2006). En attachant une GFP (Green Fluorescent Protein) à la CaMKII transfectée on peut identifier les neurones transfectés et mesurer la fréquence et l’amplitude des minis. Cette méthode est utilisée par Thiagarajan pour comparer l’impact de la CaMKII alpha et la CaMKII bêta sur les minis (Thiagarajan, Piedras-Renteria et al. 2002). La GFP utilisée dans le laboratoire est en fait un mutant de la GFP originale qui a été optimisée pour une fluorescence accrue, une sensibilité réduite au pH et un comportement monomérique. En plus de la séquence de la CaMKII et la GFP, le plasmide comprend un promoteur qui permet un certain contrôle sur la quantité de protéine exprimée.

Préparation des disques d’Aclar pour la culture de neurones

Utiliser des gants et de la verrerie réservés exclusivement pour cet usage et qui ne seront jamais lavés avec du détergent. Utiliser de l’eau doublement distillée de qualité pour la culture pour laver et préparer les solutions. Manipuler les disques avec des pinces et non pas avec les mains ou même des gants.
-Couper les disques en taillant des trous à travers une feuille d’Aclar (5 mil d’épaisseur).
Utiliser un poinçon de 13 mm de diamètre, un marteau et une planche à tailler en Teflon.
Metter environ 100 disques dans un Erlenmeyer de 250 ou 500 ml.
-Optionnel: si il y beaucoup de débris de métal provenant du poinçon, ajouter un aimant avec les disques dans l’Erlenmeyer.
-Laver les disques avec environ 100 ml d’eau doublement distillée 3 ou 4 fois en brassant vigoureusement sur un mélangeur orbital et retirer soigneusement la solution dans un entonnoir de verre au cas où des disques tomberaient.

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