Soutenance mémoire
La maladie d’Alzheimer
Schématisation d’un neurone endommagé par la maladie d’Alzheimer (au centre).
A gauche, coloration argentique d’une coupe de cortex humain, on y distingue des plaques amyloïdes (a). À droite, photo prise au microscope électronique d’une cellule présentant des régions saines (2) et des régions caractérisées par une formation d’enchevêtrements (1). Images modifiée, tirée de http://lecerveau.mcgill.ca/. 1.1.1 La forme sporadique de la maladie d’Alzheimer En 2009, on comptait plus de 25 million de personnes souffrant de démences dont 75% étant atteintes de la maladie d’Alzheimer (4). Avec une population mondiale dont l’espérance de vie avancée conduit à une proportion de personnes âgées grandissante – passant de 420 million en 2000 à 1 milliard en 2030 – la maladie d’Alzheimer, dont l’occurrence est fortement associée au vieillissement, est amené à poser de sérieux problèmes de santé publique. En effet, les patients Alzheimer sont dans plus de 90% des cas, des femmes et des hommes âgés de 65 ans et plus, et l’âge reste à ce jour considéré comme le plus grand facteur à risque d’apparition de la maladie, dont la distribution apparemment aléatoire lui a alors valu l’appellation « forme sporadique ».
Cependant, suite à des études récentes menées à large échelle, il est désormais indiscutable qu’une importante prédisposition génétique existe, comptant pour près de 58% à 79% des risques menant au développement de la maladie (5). Depuis plus de 10 ans et encore à ce jour, seul le gène ApoE (Apolipoprotéine E) a été identifié comme facteur génétique à risque, lorsque celui-ci est présent sous la forme allélique E4 (ApoE ε4) (6, 7). L’apolipoprotéine est une protéine plasmatique impliquée dans le transport de cholestérol, ainsi que dans la croissance et la réparation du système nerveux, durant le développement ou suite à un traumatisme. Des études ont mis en évidence la relation entre la présence du gène ApoE ε4 et l’accumulation des peptides Aβ (8), mais le mécanisme par lequel cet évènement se produit est encore peu compris. L’hypothèse la plus répandue est celle d’une interaction directe entre les deux protéines, empêchant alors l’élimination des peptides Aβ et conduisant à leur accumulation intra et extracellulaire (9, 10). D’autres études cependant, nient une telle interaction, et proposent un rôle indirect des protéines ApoE sur le métabolisme de l’Aβ. En effet, ces dernières sont en compétition pour les mêmes voies de clairance cellulaire, ApoE et Aβ étant deux ligands du récepteur LRP1 par exemple, et une liaison préférentielle de l’ApoE aurait pour effet de bloquer l’intégration puis l’élimination de l’Aβ par les astrocytes (11).
La forme familiale de la maladie d’Alzheimer
Il existe également une seconde forme plus rare de la maladie d’Alzheimer, appelée « forme précoce », ou encore « forme familiale de la maladie d’Alzheimer » (FAD), qui représente environ 10% des cas. La FAD se caractérise par une apparition précoce, en touchant des individus de 30 à 50 ans, et se transmet au sein de certaines familles en suivant une transmission autosomique dominante. Malgré sa rareté, la FAD représente une cible importante des recherches portant sur l’Alzheimer. D’abord par ce qu’elle représente un véritable fléau pour les personnes déclarant la pathologie, qui voient alors leur espérance de vie brutalement diminuée de moitié et laissent derrière elles famille, conjoints et enfants. De plus, la FAD ouvre la voie à de nombreuses études envisageant sous un angle nouveau la maladie d’Alzheimer.
En effet, celle-ci a la particularité de se transmettre génétiquement suite à une mutation de gènes clés, étant, dans l’ordre d’occurrence : PSEN1 codant pour la Préséniline 1 « PS1 » (12), qui est le plus fréquemment représenté avec près de 221 mutations menant à la pathologie identifiées (13), APP codant pour la protéine précurseur de l’amyloïde « APP », et enfin le gène PSEN2 codant pour la Préséniline 2 « PS2 » (14). L’étude des phénotypes cellulaires associés à ces mutations a permit de comprendre plus en profondeur certains mécanismes conduisant à la pathologie d’Alzheimer. De plus, la FAD sert de modèle dans le cadre d’études cliniques, au cours desquelles les phénotypes associés aux différentes mutations provoquant à la maladie sont étudiés. Suite à cela, et grâce à l’apparition des tests génétiques, il sera alors possible d’effectuer un diagnostique pré-symptomatique, permettant de délivrer un traitement tôt avant l’apparition de la maladie.
Les traitements de la maladie d’Alzheimer
Plus de 100 ans après sa découverte, la maladie d’Alzheimer reste incurable, malgré les nombreux essais cliniques effectués et les médicaments existants sur le marché. A ce jour, l’une des principale voies de lutte contre la maladie passe par l’utilisation d’inhibiteurs de cholinestérase (15), qui permettent de maintenir une certaine concentration d’acétylcholine, neurotransmetteur essentiel dans le processus de mémorisation, et dont le niveau baisse de manière cruciale conséquemment à la neurodégénérescence du système limbique des patients atteints. D’autres approches thérapeutiques sont employées, mais toutes, visant généralement à prévenir plutôt qu’à guérir la maladie, offrent de faibles victoires, en permettant au mieux l’amélioration des fonctions cognitives sur le court terme, ou bien le retard de leur aggravation (16). Aujourd’hui, et depuis près de 20 ans, les espoirs d’une thérapie curative naissent dans la communauté scientifique, suite à la découverte de la mutation dominante « APP swedish » chez certain patients présentant une FAD (17), touchant le gène codant pour la protéine précurseur de l’amyloïde « APP ». En effet, celle-ci induit une augmentation de la fréquence du clivage de la protéine et par conséquent du nombre de ses produits, dont le peptide Aβ, déjà connu comme le principal composant des plaques amyloïdes retrouvées dans les cerveaux malades (18). Deux ans plus tard, cette découverte mènera à la formulation, par l’Anglais John A. Hardy, de l’hypothèse de la cascade amyloïde (19).
L’hypothèse de la cascade amyloïde APP est une glycoprotéine transmembranaire existant sous 8 isoformes. Celle-ci est codée par un gène situé sur le chromosome 21 et constitué d’au moins 18 exons, dont les 7e, 8e et 15e peuvent être épissés alternativement donnant alors naissance à différents isoformes protéiques (20). La cascade amyloïde, comme énoncée en 1992, se définit par l’ensemble des évènements conduisant à la production de peptides Aβ, dont le dépôt serait la cause de la neuropathologie d’Alzheimer en induisant l’apparition d’enchevêtrements neurofibrillaires, de pertes synaptiques et neuronales et d’une dégénérescence vasculaire, qui sont les lésions typiques retrouvées chez les patients atteints (21). La protéine APP peut être clivée selon la voie « Non Amyloïdogénique » à gauche, ou « Amyloïdogénique » à droite, menant à la formation de peptides amyloïdes neurotoxiques. Image tirée de « Dropping the BACE: Beta Secretase (BACE1) as an Alzheimer’s disease Intervention Target », Suphioglu et al., NeuroAllergy Research Laboratory (NARL), 2013.
Selon la composition lipidique de la membrane dans laquelle elle se trouve, la protéine APP peut être dégradée selon deux voies différentes, appelées voies « amyloïdogénique » ou « non amyloïdogénique ». Chez les patients sains, APP subit majoritairement une protéolyse selon la voie « non amyloïdogénique ». Cependant, une mutation dans le gène codant pour APP ou pour l’une des présénilines PS1 ou PS2, amplifierait le clivage d’APP selon la voie dite « amyloïdogénique » induisant alors une accumulation de peptides Aβ toxique pour la cellule (22). La voie non-amyloïdogénique permet le clivage d’APP par les secrétases α puis γ, induisant alors la libération du peptide soluble sAPPα puis de p3 et AICD (« APP intracelular domain »). Mis à part p3, dont le rôle biologique reste encore indéterminé, ces peptides sont connus pour avoir une fonction essentielle au sein du neurone. L’AICD d’abord, aurait un rôle de facteur de transcription en s’associant avec divers co-activateurs telle-que la protéine Fe65, qui permettrait ainsi sa liaison à plusieurs complexes transcriptionnels comme TIP60 (« Histone Acetyl-Transferase Tat-Interactive Protein ») (23) ou encore CP2/LSF/LBP1 (24). L’AICD, seul ou en complexe, permettrait alors la transcription de gènes impliqués dans la dynamique du cytosquelette cellulaire (25), et aurait un rôle dans l’apoptose cellulaire dépendante de p53 en augmentant la transcription de la dite protéine mais aussi l’activation de la caspase-3 (26).
Le peptide sAPPα est libéré dans 6 le milieu extracellulaire suite au clivage primaire d’APP. Il est connu pour ses effets majeurs sur la plasticité et la survie neuronale, notamment en favorisant la croissance de neutrites et en protégeant les cellules contre l’excitotoxicité (27, 28). Bien que le rôle propre de la protéine APP est encore inconnu à ce jour, ces données, suggèrent au vu de leur importance, que le clivage « non amyloïdogénique » de la protéine APP serait bénéfique voir essentiel aux bonnes conditions de survie des cellules neuronales. La protéine peut cependant emprunter la seconde voie de transformation dite « amyloïdogénique » qui serait responsable, en cas de dérégulation, de l’accumulation des peptides Aβ pouvant alors mener à la pathologie d’Alzheimer.
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Table des matières
1.Introduction
1.1 La maladie d’Alzheimer
1.1.1 La forme sporadique de la maladie d’Alzheimer
1.1.2 La forme familiale de la maladie d’Alzheimer
1.1.3 Les traitements de la maladie d’Alzheimer
1.2 Caractéristiques cellulaires et moléculaires
1.2.1 L’hypothèse de la cascade amyloïde
1.2.2 L’effet pathologique des peptides Aβ
1.3 Les secrétases
1.3.1 Les secrétases responsables du clivage primaire de l’APP
1.3.2 La γ-secrétase responsable du clivage secondaire de l’APP
1.4 La préséniline
1.4.1 Propriétés moléculaires
1.4.2 La mutation PS1Δ9
1.4.3 Les rôles de PS1 indépendants de la voie amyloïde
1.4.3.1 PS1 et la voie de signalisation Notch
1.4.3.2 PS1 et les voies de signalisations tyrosine kinase dépendantes
1.4.3.3 PS1 interagit avec les protéines de la famille Armadillo
1.5 Hypothèse et objectifs de recherche
2 Matériel et méthodes
2.1 Préalables au criblage par double hybride en levure
2.1.1 Le système « split-ubiquitin »
2.1.2 Les levures Saccharomyces cerevisiae
2.1.3 Liste des plasmides du système « split-ubiquitin »
2.1.3.1 « Appât » pBT3-N PS1-Cub-LexA-VP16
2.1.3.2 « Proie » pPR3-N-NubG-X
2.1.3.3 pNubG-Fe65, pTSU2-APP et pOst1-Nub
2.1.4 Construction du vecteur pBT3-N PS1-Cub-LexA-VP16
2.1.4.1 Extraction de l’ADNp pBT3-N de bactéries DH5α
2.1.4.2 Obtention des inserts PS1 WT et Δ9 par PCR 30
2.1.4.3 Digestion du vecteur pBT3-N et des inserts PS1 :
2.1.4.4 Ligation des inserts PS1 dans le vecteur pBT3-N :
2.1.4.5 Transformation des bactéries DH5α
2.2 Criblage par double hybride en levure
2.2.1 Transformations des levures CD3-808 « MAT a » et CD3-809 « MAT α »
2.2.2 Essai fonctionnel du système « split-ubiquitin »
2.2.3 Criblage par accouplement des CD3-808 et CD3-809
2.2.3.1 Criblage pilote
2.2.3.2 Criblage de la banque d’ADNc extraits de cerveau humain
2.2.4 Analyse des clones positifs obtenus
2.2.4.1 Isolation des plasmides de levure
2.2.4.2 Identification des gènes candidats
2.2.4.3 Confirmation des interactions protéiques par double hybride en levure
2.3 Confirmation des interactions protéiques en cellules
2.3.1 Les HEK 293T
2.3.2 Liste des plasmides utilisés en cellule
2.3.2.1 pEGFP
2.3.2.2 pcDNA3 et pcDNA3.1-His C
2.3.2.3 pCMV-Zéo-HA PS1
2.3.3 Transfection des cellules
2.3.4 Lyse cellulaire et extraction protéique
2.3.5 Co-Immunoprécipitation
2.3.6 Immunodétection protéique par Western Blot
2.3.6.1 Électrophorèse sur gel polyacrylamide et transfert sur membrane PVDF
2.3.6.2 Immunodétection
3 Résultats
3.1 Essai fonctionnel du système « split-ubiquitin » en levure
3.2 Criblage utilisant l’appât PS1 WT-Cub-TF
3.2.1 L’appât pBT3-N PS1 WT-Cub-TF est fonctionnel
3.2.2 La fusion des levures CD3 808 « Mat a » contenant l’appât PS1 WT-Cub-TF est efficace
3.2.3 Criblage de la banque d’ADNc extraits de cerveau humain
3.2.4 Identification des plasmides candidats
3.2.5 Confirmation des interactions protéiques en levure
3.3 Criblage utilisant l’appât PS1Δ9-Cub-TF
3.3.1 Essai fonctionnel
3.3.2 Évaluation de la fusion des levures CD3 808 « Mat a » contenant l’appât PS1Δ9-Cub-TF
3.3.3 Criblage de la banque d’ADNc extraits de cerveau humain
3.3.4 Identification des plasmides candidats
3.3.5 Confirmation des interactions protéiques en levure
3.4 Étude de PS1 WT, PS1Δ9 et des protéines candidates en cellule HEK 293T
4 Discussion
4.1 Comparaison des interactions protéiques de PS1 WT et PS1Δ9
4.2 PS1 interviendrait dans les processus de réparation de l’ADN
4.3 PS1 permettrait le maintient du cycle cellulaire neuronal
4.4 PS1 participerait à une nouvelle voie de signalisation liée aux RTK
4.5 PS1 permettrait la stabilisation de l’activité transcriptionnelle ribosomale
4.6 PS1 participerait à l’inhibition de la PRPS
4.7 PS1 pourrait jouer un rôle dans l’homéostasie énergétique des astrocytes
Conclusions et perspectives
Bibliographie
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