Soutenance mémoire
Huile essentielle de C. fragrans
Présentation du projet « Pôle d’Excellence Régional (PER) »
La thématique générale du PER consiste à la « Valorisation des ressources de la biodiversité végétale de Madagascar et des Comores pour la sécurité des aliments : identification des plantes, criblage et caractérisation des molécules actives ». Un pôle d’excellence régional est un réseau de compétences universitaires et scientifiques, exerçant dans un cadre régional, sur une thématique commune. Celui-ci est financé par l’Agence Universitaire de la francophonie (AUF) pour une durée de 3 ans (2008- 2011). Un pôle d’excellence régional est donc constitué par un centre universitaire (laboratoire, centre de recherche, département, faculté, et d’un établissement membre de l’AUF) dont le programme est réalisé en relation avec des partenaires régionaux. Des collaborations d’universités d’autres régions, notamment du Nord, peuvent également intervenir. Les universités partenaires du Nord sont ainsi invitées à contribuer aussi à cette mutualisation scientifique de haut niveau et à son rayonnement régional.
Ce programme vise donc à :
identifier les centres de haute valeur scientifique avérée des pays du Sud ; les renforcer ; es amener à mobiliser un réseau régional de compétences collaborant autour de mêmes thématiques, en mutualisant les moyens disponibles et, dans la mesure du possible, les contributions complémentaires d’autres partenaires.
Thématique retenue
Les microorganismes (bactéries, champignons), qu’ils soient pathogènes ou d’altération, représentent des risques majeurs pour la qualité et la sécurité des aliments. Ce projet propose de rechercher, dans les biodiversités végétales de Madagascar et des Comores, de nouvelles molécules d’intérêt biologique pour améliorer la sécurité sanitaire des denrées alimentaires. La biodiversité malgache comporte 12000 espèces dont 80% sont endémiques. Malgré le nombre croissant d’études sur cette biodiversité végétale, nombreuses sont les espèces qui n’ont pas encore fait l’objet d’études approfondies pour la caractérisation de leur composition chimique, et de leurs propriétés antimicrobiennes ou nutritionnelles. Plusieurs de ces plantes sont cependant décrites par la pharmacopée malgache et sont utilisées empiriquement pour soigner plusieurs pathologies infectieuses. Le projet d’une durée de 3 ans vise à créer un pôle scientifique régional doté de moyens et de ressources pour soutenir une recherche de qualité afin d’approfondir la caractérisation de plantes d’intérêt à partir des biodiversités de Madagascar et des Comores.
Objectifs scientifiques
Identifier des plantes d’intérêt biologique (activités antimicrobiennes, propriétés nutritionnelles). Caractériser la composition chimique et les propriétés biologiques des extraits végétaux de quelques plantes endémiques sélectionnées. Evaluer la variabilité des molécules utiles (variabilité géographique et saisonnière) afin de développer des modes de gestion durables des espèces intéressantes.
Objectifs partenariaux
La mise en place d’un réseau scientifique régional pour la recherche et la formationassociant les Universités de Madagascar (Département de Biochimie Fondamentale etAppliquée et Ecole Supérieure des Sciences Agronomiques), des Comores et de la Réunion,ainsi que des centres de recherches (CNARP, FOFIFA, CIRAD).Le renforcement des capacités des équipes du Sud (Comores, Madagascar) par laformation de jeunes chercheurs malgaches et comoriens et l’appui d’institutions du Nord(CIRAD, Université de la Réunion).La mutualisation des équipements des différentes institutions travaillant sur cettethématique à Madagascar.
Etudes morphologiques
Comme tout arthropode, les crevettes présentent une symétrie bilatérale bien marquée. Elles sont formées de deux régions bien distinctes (Beaumont et al., 1981): Le Céphalothorax est recouvert d’une carapace d’un seul tenant. Cette partie est issue de la fusion entre la tête et le thorax, d’où le nom de Céphalothorax. Ces dernières sont séparées par un sillon cervical (Figure 1 et 2). D’un côté, la tête comporte : une bouche, deux yeux pédonculés et cinq paires d’appendices sensoriels : les antennules, antennes, mandibules, maxillules et maxilles. De l’autre côté, le Thorax ou Péréion dispose d’appendices appelés « péréiopodes » ou pattes thoraciques dont les trois premières paires sont munies de pinces.
Sexualité
Les crevettes sont des animaux invertébrés parfaitement sexués. Le mâle et la femelle sont nettement différenciés. A premier abord, les mâles ont une plus petite taille par rapport aux femelles. A la première maturité sexuelle, le mâle ne pèse que 40 g avec une carapace de 38,5 mm alors que la femelle atteint un poids de 70 g pour une carapace de 46 mm (Primavera, 1980). Mais le principal critère de différenciation sexuelle réside dans la forme et la localisation des appareils sexuels. L’appareil copulateur du mâle se situe à la jonction de deux rames internes modifiées de la première paire de pattes abdominales, c’est le pétasma. Pour la femelle, un étui plus ou moins développé ventralement et appelé thélycum sert d’appareil copulateur. Celui-ci se trouve à la base de la cinquième paire de pattes thoraciques. Le thélycum peut être ouvert ou fermé selon les espèces. Penaeus monodon fait partie des espèces à thélycum fermé.
Fécondation et ponte
La fécondation n’a lieu que lorsque les individus ont atteint leur pleine maturitésexuelle. Pour la femelle particulièrement, la maturation sexuelle s’observe à travers la région céphalothoracique – abdominale où l’ovaire devient turgescent et prend une couleur sombre. Juste après la mue qui suit cette maturation, l’accouplement a lieu. Les spermatophores émis par le mâle s’insèrent à l’intérieur du thélycum de la femelle, et ceci en plein mer. La femelle va alors pondre. Les œufs sont fécondés au moment de l’expulsion. A une température de 24 à 28° C, 12 à 15 heures après la ponte sont nécessaires pour incuber les œufs. Par ailleurs, les individus destinés à devenir des géniteurs sont minutieusement sélectionnés en aquaculture.
Développement larvaire
La température constitue l’un des principaux paramètres à maîtriser pour son bondéroulement. Effectivement, la vitesse de développement des larves atteint son optimum à une température avoisinant les 28° C. Ainsi, au bout de 12 à 18 jours, les larves ont achevé leur développement. Sont énumérées ci-dessous les quatre phases successives du développement larvaire (Figure 3) :
Phase Nauplius
Une fois éclos, les œufs donnent naissance à des nauplii. Ce sont des individus ayant un corps massif, globuleux, non-segmenté et renflé. Cette phase dure environ 6 jours. Les nauplii utilisent uniquement leurs réserves vitellines pour se nourrir.
Phase Zoé
Les caractères morphologiques de l’adulte commencent à apparaître chez les larves Zoé. En effet, une segmentation du corps s’opère et l’ébauche du céphalothorax et celle de l’abdomen sont ainsi nettement individualisées. La première prend une forme ovale alors que la seconde a une forme allongée. Les Zoé se nourrissent de phytoplancton et de zooplancton puis rejettent un cordon fécal. Ce dernier est une traînée d’algues plus ou moins dégradées, c’est le signe d’un bon développement. Cette phase prend fin au bout de 4 à 5 jours.
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Table des matières Glossaire Liste des abréviations Liste des figures Liste des tableaux Liste des annexes INTRODUCTION Partie I : Contexte général : Pôle d’Excellence Régional (PER) - Généralités sur les crevettes, sur le genre Cinnamosma et ses huiles essentielles I Présentation du projet « Pôle d’Excellence Régional (PER) I.1. Thématique retenue I.2.Objectifs scientifiques I.3. Objectifs partenariaux II Généralités sur les crevettes pénéides II.1. Systématique II.2. Etudes morphologiques II.3. Sexualité II.4. Cycle de vie II.4.1. Fécondation et ponte II.4.2. Développement larvaire a) Phase Nauplius b) Phase Zoé c) Phase Mysis d) Phase de Post-larves II.4.3. Juvéniles II.4.4. Adultes II.5. Répartition bathymétrique II.6 Etapes d’élevage II.6.1. Ecloseries a) Maturation b) Ponte et éclosion c) Elevage larvaire II.6.2. Prégrossissement II.6.3. Grossissement II.7. La crevetticulture à Madagascar II.8. Maladies et stratégies de developpements II.8.1. Maladies a) Vibrioses b) Hépatopancréatite nécrosante II.8.2. Stratégies de développements II.8.3. Résistance bactérienne aux antibiotiques II.8.4. Alternatives aux antibiotiques III Généralités sur Cinnamosma spp. III.1. Dénomination des espèces III.1.1. Cinnamosma fragrans III.1.2. Cinnamosma madagascariensis et Cinnamosma macrocarpa III.2. Biosystématique III.3 Distribution du genre Cinnamosma III.4. Description botanique des espèces étudiées III.5. Propagation végétative de l’espèce III.5.1. Recépage III.5.2. Régénération naturelle III.5.3. Régénération artificielle III.6. Indications thérapeutiques IV Généralités sur les huiles essentielles IV.1. Historique IV.2. Définition IV.3. Localisation des huiles essentielles IV.4. Rôles des huiles essentielles dans les plantes IV.5. Caractéristiques générales des huiles essentielles IV.6. Facteurs de variabilité des huiles essentielles IV.6.1. Variété botanique IV.6.2. Matériel végétal IV.6.3. Processus de distillation IV.6.4. Origine et existence de variété chimiques ou chémotype IV.6.5. Génétique IV.7. Composition chimique des huiles essentielles IV.8. Utilisation des huiles essentielles IV.8.1. Parfumerie et cométique IV.8.2. Industries agro-alimentaires IV.8.3. Industries chimiques IV.8.4. Propriétés antimicrobiennes V Synthèse des travaux effectués sur les huiles essentielles de Cinnamosma spp V.1. Rendement et propriétés physico-chimiques V.2. Composition chimique de l’huile essentielle de Cinnamosma fragrans V.3. Composition chimique de l’huile essentielle de Cinnamosma madagascariensis V.4. Activités antimicrobiennes V.5. Huile essentielle de C. fragrans : nouvelle alternative aux antibiotiques en aquaculture de crevette Partie II : Démarches méthodologiques I Méthodes de caractérisation des huiles essentielles de Cinnamosma spp I.1. Matériel végétal I.2. Localisation des sites de collecte I.2.1 Site de Katsepy I.2.2. Site de Tsaramandroso I.2.3. Site de Tampolo I.2.4. Site d’Ambohitantely I.3. Procédure d’extraction I.4. Détermination de la teneur en eau et rendement en huile I.4.1. Détermination de la teneur en eau I.4.2. Détermination du rendement en huile I.5. Couplage Chromatographie en phase gazeuse et Spectrométrie de Masse (CPG/SM I.6.1. Identification des constituants I.6.2. Quantification des constituants I.7. Détermination des caractéristiques physico- chimiques I.7.1. Densité relative selon la norme NF T 75-111 /ISO 279-2000 I.7.2. Indice de réfraction selon la norme NF T 75-112 /ISO 280-2000 I.8. Détermination des caractéristiques organoleptiques I.9. Huiles essentielles utilisées pour les analyses microbiologiques et les tests en aquaculture de crevettes II Méthodes d’évaluation des activités antimicrobiennes des huiles essentielles de Cinnamosma spp. in vitro. II.1. Microorganismes II.2. Provenance des souches II.2.1. Souches de référence II.2.2. Souches sauvages isolées des larves de crevettes a) Isolement et purification b) Identification II.3. Détermination des concentrations minimales inhibitrices et bactéricides III Méthodes d’évaluation de l’effet des huiles essentielles dans des conditions d’élevage réelles III.1. Conditions et suivis d’élevage III.1.1. Réception et acclimatation des Nauplius a) Comptage des Nauplius reçus b) Ensemencement III.1.2. Gestion des bacs et des larves (prises des paramètres a) Observation des bacs b) Observation des larves c) Prises des paramètres d’élevage III.1.3. Changement d’eau III.1.4. Alimentation des larves III.2. Détermination de la toxicité des huiles essentielles III.3. Traitements à l’antibiotique et aux huiles essentielles III.3.1. Détermination de l’effet des huiles essentielles sur la concentration bactérienne des larves III.3.2. Evaluation du taux de survie des larves IV . Méthodes d’analyse statistique IV.1. Analyse en Composantes Principales (ACP IV.1.1. Objectifs et principes IV.1.2. Interprétations IV.2. Classification Ascendante Hiérarchique (CAH IV.2.1. Objectifs et principes IV.2.2. Interprétations IV.3. Analyse Factorielle Discriminante (AFD IV.3.1. Objectifs et principes IV.3.2. Interprétations IV.4. L’analyse de la variance (ANOVA IV.4.1. Objectif et principe IV.4.2. Conditions d’application IV.4.3. Interprétation du test IV.5. Test de Kruskall Wallis IV.6. Test de corrélation selon Spearman PARTIE III : Composition chimique des huiles essentielles de C. fragrans et C. madagascariensis – Analyses statistiques des données I. Huiles essentielles de Cinnamosma fragrans I.1. Composition chimique des huiles essentielles de Cinnamosma fragrans I.2. Analyse en Composantes Principales (C. fragrans) I.2.1. Test de sphéricité de Bartlett (C. fragrans) I.2.2. Valeurs propres en ACP (C. fragrans I.2.3. Caractérisation des variables et des individus (C. fragrans) I.3. Classification Ascendante Hiérarchique (C. fragrans) I.4. Analyse Factorielle Discriminante (C. fragrans) I.4.1. Test de Lambda de Wilks (C. fragrans) I.4.2. Valeurs propres en AFD (C. fragrans) I.4.3. Description des classes en AFD (C. fragrans) I.4.4. Caractérisation des groupes en AFD (C. fragrans I.5. Caractérisation chimique de chaque chémotype de l’huile essentielle de C. fragrans I.5.1. Caractéristiques organoleptiques des huiles essentielles de C. fragrans I.5.2. Evaluation du rendement en huile essentielle de C. fragrans I.5.3. Caractéristiques physico – chimiques des huiles essentielles de C. fragrans I.6. Influence de la date de récolte pour chaque chémotype identifié (C. fragrans) I.6.1. Evolution de la composition chimique de chaque chémotype de l’huile essentielle de C. fragrans au cours de l’année I.6.2. Evolution des teneurs en constituants principaux de chaque chémotype de l’huile essentielle de C. fragrans au cours de l’année. II. Huiles essentielles de Cinnamosma madagascariensis II.1. Composition chimique des huiles essentielles de C. madagascariensis II.2. Analyse en Composantes Principales (C. madagascariensis II.2.1. Test de sphéricité de Bartlett (C. madagascariensis II.2.2. Valeurs propres en ACP (C. madagascariensis II.2.3. Caractérisation des variables et des individus en ACP (C. madagascariensis) II.3. Classification Ascendante Hiérarchique (C. madagascariensis II.4. Analyse Factorielle Discriminante (C. madagascariensis II.4.1. Test de Lambda de Wilks C. madagascariensis II.4.2. Valeurs propres en AFD (C. madagascariensis II.4.3. Description des groupes (C. madagascariensis II.4.4. Caractérisation des groupes (C. madagascariensis II.5. Caractérisation chimique de chaque chémotype de l’huile essentielle de C. madagascariensis II.5.1. Caractéristiques organoleptiques des huiles essentielles de C. madagascariensis II.5.2. Evaluation du rendement en huile essentielle de C. madagascariensis II.5.3. Caractéristiques physico – chimiques des huiles essentielles de C. madagascariensis II.6. Influence de la date de récolte pour chaque chémotype identifié (C. madagascariensis II.6.1 Evolution de la composition chimique de chaque chémotype pour l’huile essentielle de C. madagascariensis durant l’année II.6.2. Evolution des teneurs en constituants principaux de chaque chémotype pour l’huile essentielle de C. madagascariensis au cours de l’année III. Comparaison de la composition chimique des huiles essentielles de C. fragrans et C. madagascariensis III.1. Analyse en Composantes Principales (Cinnamosma spp.) III.1.1. Test de sphéricité de Bartlett (Cinnamosma spp.) III.1.2. Valeurs propres en ACP (Cinnamosma spp.) III.1.3. Caractérisation des variables et des individus (Cinnamosma spp.) III.2. Classification Ascendante Hiérarchique (Cinnamosma spp.) III.3. Analyse Factorielle Discriminante (Cinnamosma spp III.3.1. Test de Lambda de Wilks (Cinnamosma spp.) III.3.2. Valeurs propres en AFD (Cinnamosma spp.) III.3.3. Description des groupes (Cinnamosma spp.) III.3.4. Caractérisation des groupes (Cinnamosma spp IV. Discussions des résulats V. Conclusion partielle PARTIE IV : Propriétés biologiques et tests en écloserie de crevettes de chaque chémotype I. Résultats des analyses microbiologiques in vitro I.1. Identification des isolats de larves de l’écloserie I.1.1. Identification préliminaire I.1.2. Identification des isolats avec la galerie API 20 NE I.2. Concentrations minimales inhibitrices de chaque chémotype et leurs composants purs vis-à-vis des souches de référence I.3. Concentrations minimales inhibitrices de chaque chémotype et leurs composants purs vis-à-vis des souches bactériennes isolées de l’écloserie II. Résultats des tests en écloserie de crevettes II.1. DL 50 des quatre stades larvaires avec les trois huiles essentielles II.1.1. Différence significative entre la DL 50 des trois huiles essentielles, quelque soit le stade a) Statistique descriptive (effet huile essentielle b) Test de Kruskal Wallis sur la DL 50 (effet huile essentielle II.1.2. Différence significative entre la DL 50 des quatre stades, quelque soit l’huile essentielle a) Statistique descriptive (effet stade b) Test de Kruskal Wallis sur DL 50 (effet stade) II.2. Comparaison de l’effet des trois huiles essentielles, antibiotique et témoin sur la concentration bactérienne et le taux de survie des larves II.2.1. Evolution de la concentration bactérienne des larves ensemencés sur Marine agar (Flore Mésophile Totale : FMT) durant 18 jours d’élevage a) Test de Kruskal Wallis sur la concentration en FMT b) Répartition des cinq traitements selon la concentration en FMT II.2.2. Evolution de la concentration bactérienne des prélèvements larvaires ensemencés sur TCBS (Vibrio sp.) durant 18 jours d’élevage a) Test de Kruskal Wallis sur la concentration en Vibrio sp b) Répartition des cinq traitements selon la concentration en Vibrio sp II.2.2. Evolution du taux de survie des larves pendant 18 jours d’élevage a) Test de Kruskal Wallis sur le taux de survie b) Répartition des cinq traitements selon le taux de survie. II.3 Corrélation entre la concentration bactérienne (FMT et Vibrio sp.) et le taux de survie des larves II.3.1. Corrélation entre la concentration en FMT et le taux de survie des larves II.3.2. Corrélation entre la concentration en Vibrio sp. et le taux de survie des larves III. Discussions des résultats IV. Conclusion partielle CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ANNEXES
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