Histologie du tissu osseux et place des CSM

Histologie du tissu osseux et place des CSM

Décalcifiants et immunohistochimie (IHC)

Un des objectifs du projet expérimental étant de pouvoir utiliser l’immunohistochimie pour identifier des cellules de la moelle osseuse, l’impact des décalcifiants sur la conservation des sites antigéniques est donc un élément particulièrement important. Un tableau récapitulatif des résultats en immunohistochimie présentés dans cette partie, regroupant les décalcifiants du commerce cités en fonction de leur composition (type d’acide ou de chélateur et concentration si précisée dans l’étude), est présenté à la fin de ce paragraphe (Tableau 1). La phase de décalcification est réalisée à température ambiante pour toutes les études citées. Les espèces étudiées, si elles sont précisées, sont indiquées au cours des paragraphes cidessous.Une des premières études sur l’impact de la décalcification sur la conservation des sites de marquage est celle d’ATHANASOU et al. en 198732 (modèle d’étude : humain). Quinze marqueurs sont testés après décalcification par des acides forts (HCl, HNO3), des acides faibles (acide acétique, acide formique), un chélateur (EDTA), et un mélange entre un agent chélateur et un acide fort (EDTA – HCl). L’ensemble des marqueurs est conservé après décalcification par les acides faibles et l’EDTA, avec une coloration forte des sites marqués. Le mélange EDTA-HCl et l’acide trichloracétique fournissent également de bons résultats mais un marqueur, le CEA (antigène carcino-embryonnaire, monoclonal) n’est pas validé, et le marqueur EMA (antigène de la membrane épithéliale, monoclonal) présente un signal plus faible (absent pour l’acide trichloracétique, monoclonal) qu’avec les décalcifiants précédents. Concernant les acides forts, l’EMA, le CEA et le HLA DR (Human leucocyte antigène DR, monoclonal) ne sont pas retrouvés, et parmi les autres marqueurs, six apparaissent plus faiblement marqués. L’étude de VELOT et al (2011)20 (modèle d’étude : rat) s’intéresse également à la conservation des épitopes antigéniques et teste l’anticorps Ki-67, marqueur nucléaire ne faisant pas partie de l’étude précédente, sur les prélèvements décalcifiés avec l’EDTA 10% ou des décalcifiants acides du commerce (DC3 (Labonord), le microDEC (MMFrance), l’OsteoRAL (RAL diagnostics), TBD-2 (Thermo Fisher Scientific)). Seuls les prélèvements décalcifiés à l’EDTA ou le TBD-2 présentent un signal nucléaire positif, et ceux de l’EDTA présentent un marquage plus intense.

Décalcifiants et conservation des acides nucléiques et ribonucléiques. Evaluation par PCR, RT PCR et hybridation in situ

Concernant l’étude des acides ribonucléiques en général, les auteurs s’accordent davantage sur le choix de l’EDTA comme décalcifiant pour pouvoir appliquer des techniques telles que l’hybridation in situ ou la PCR. En effet des résultats décevants sont obtenus avec d’autres décalcifiants tels que le RD0 (acide chlorhydrique) dans l’étude de ALERS et al. 39(1999), le DC3 (Labonord), le microDEC (MMFrance), l’OsteoRAL (RAL diagnostics), et le TBD-2 (Thermo Fisher Scientific) dans l’étude de VELOT et al. (2011)20. REINEKE et al. (2006)38 utilisent la PCR après décalcification à l’acide nitrique et obtiennent tout de même des résultats, mais seul l’EDTA permet l’amplification des séquences longues. Lors d’utilisation de la technique d’hybridation in situ après décalcifiant acide, le signal est moins intense qu’avec l’EDTA et un bruit de fond est constaté.MA et al (2008)33 testent le marqueur CD68 (marqueur d’ostéoclastes et de macrophages) sur fémurs de rats après décalcification par l’EDTA 10% ou d’autres solutions du commerce à base d’acide chlorhydrique ou d’acide formique. Un décalcifiant à base d’acide formique supposé permettre de bons résultats en IHC est également testé, l’Immunocal (Decal Chemical Corporation). De même que dans l’étude précédente, hormis l’EDTA, aucun des décalcifiants ne fournit des résultats satisfaisants.REINEKE et al. (2006)26 testent les marqueurs Anti CD20, CD3, Mib1, Glycophorine A (DAKO) après décalcification soit à l’acide nitrique 5% soit à l’EDTA 10% (modèle d’étude : humain). Un marquage est constaté après décalcification par l’acide nitrique mais il est plus faible et non homogène par rapport à l’EDTA, en particulier pour le marqueur nucléaire MIB1.

Guide du mémoire de fin d’études avec la catégorie tissu osseux et place des CSM

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Table des matières

REMERCIEMENTS
TABLE DES ILLUSTRATIONS
TABLE DES PRINCIPALES ABREVIATIONS UTILISEES
INTRODUCTION
Partie I : Introduction du projet
1. Histologie du tissu osseux et place des CSM
1.1 Organisation générale du tissu osseux
1.2 Organisation cellulaire du tissu osseux et place des CSM
2. Etapes spécifiques à l’étude histologique du tissu osseux en microscopie optique
2.1 Enjeux de l’élaboration du protocole de décalcification du projet expérimental
2.2 Les différents décalcifiants et leurs différents impacts sur les prélèvements
2.3 Influence de paramètres physiques sur la durée de décalcification
2.4 Outils permettant l’évaluation du stade de décalcification du prélèvement
2.5 Différentes méthodes de fixation rencontrées dans la littérature
2.6 Recommandations établies par l’« International Council for Standardization in haematology »
BILAN DE LA PARTIE I
Partie II : Etude expérimentale
Introduction
1. Matériel et méthode
1.1 Etude n°1 Validation d’un protocole optimal de décalcification
1.2 Etude n°2 : Tests de marquages immunohistochimiques après décalcification
2. Résultats
2.1 Etude n°1 Validation d’un protocole optimal de décalcification
2.2 Etude n°2 : Tests de marquages immunohistochimiques après décalcification
3. Discussion
Concernant l’étape de fixation
Facteurs susceptibles d’améliorer la décalcification des mandibules canines
Décalcification et résultats d’immunohistochimie
Conclusion
Bibliographie
7 Annexes