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HEMOPATHIES MALIGNES LYMPHOIDES
Plus de 80 % des hémopathies malignes lymphoïdes dérivent de la lignée B. La classification, selon l’organisation mondiale de la santé (OMS), distingue les proliférations des précurseurs lymphoïdes (B ou T), les lymphomes B, les lymphomes T et NK (natural killer) et la maladie de Hodgkin [13].
Les hémopathies malignes lymphoïdes de type B sont classées selon leur stade de maturation en hémopathies lymphoïdes à précurseurs B et à cellules B matures (Tableaux I et II).
PHYSIOPATHOLOGIE DU MM
L’étiologie du myélome multiple n’est pas encore connue. Il existe de rares cas familiaux avec une fréquence plus élevée chez les Afro-américains. Des facteurs environnementaux comme une exposition à des toxiques (pesticides, herbicides, engrais, colorants, pétrole et dérivés du pétrole) ou à des radiations ionisantes constituent des facteurs de risque. Un lien avec l’herpès virus HHV-8 est possible [15].
Certains cas de myélomes multiples sont précédés d’une gammapathie monoclonale de signification indéterminée (MGUS). Cette dernière, asymptomatique, se définit par la présence d’un clone stable de plasmocytes produisant une immunoglobuline monoclonale dont le taux reste bas et stable [16]. Le risque annuel de progression de la MGUS vers un myélome est de 1% par an [17]. L’apparition d’anomalies génétiques supplémentaires (délétions, mutations) conduit à une perte ou inactivation de gènes suppresseurs de tumeur (Rb sur 13q14, 17p, p16, p18, PTEN etc..) et à l’activation d’oncogènes (N-ras et K-ras). Le clone stable de MGUS devient, dans le myélome multiple, un clone doté d’une cinétique de croissance expansive, avec un temps de doublement toutefois très long. Certains myélomes multiples restent de faible masse tumorale pendant des années (myélomes indolents), tandis que d’autres progressent et sont rapidement symptomatiques.
Les aspects cellulaires et moléculaires jouent ainsi un rôle essentiel dans le développement et la progression du MM.
Aspects cellulaires
Les cellules myélomateuses (MMC), localisées au sein de la moelle osseuse, coexistent et interagissent avec les protéines de la matrice extracellulaire et le compartiment non hématopoïétique. Ce dernier est caractérisé par les cellules stromales contenant les cellules souches mésenchymateuses, les ostéoclastes, les ostéoblastes, les cellules endothéliales et les adipocytes [18].
L’expression de CXCR4 (cxc chemokine receptor) par les plasmocytes et la présence de la chimiokine SDF-1α (stromal cell derived Factor) dans la moelle osseuse (MO) permettent le recrutement des MMC dans la MO [19]. Ces cellules vont ensuite adhérer aux protéines de la matrice extracellulaire telles que le collagène, la fibronectine, la laminine et la vitronectine et aux cellules stromales grâce à l’expression de molécules d’adhésion. Les MMC expriment 3 principales molécules d’adhésion :
– VLA-4 et VLA-5 (very-late-activating antigens 4 et 5), qui se lient à la fibronectine et à la laminine de la matrice extracellulaire ou à la VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule) présent sur les cellules stromales [20].
– LFA-1, qui se lie à ICAM-1 (intercellular cell adhesion molecule) présent sur les cellules stromales [21].
– Syndecan-1 qui se lie au collagène de type I de la matrice extracellulaire [22].
Ces adhésions sont renforcées par la présence de cytokines présentes dans le milieu. Ces différentes adhésions entre MMC, protéines de la matrice extracellulaire et cellules stromales ne permettent pas seulement la localisation de ces cellules dans la moelle, mais favorisent également la survie et la croissance des MMC.
Les lésions osseuses sont une des principales manifestations cliniques du MM. Elles sont dues à un déséquilibre de la balance ostéoclastes/ostéoblastes qui provoque une lyse osseuse.
L’os est un tissu en renouvellement constant. A l’état normal, le remodelage osseux résulte d’un équilibre entre les ostéoclastes (OC), responsables de la résorption osseuse et les ostéoblastes (OB) qui reconstituent la matrice osseuse.
Les cellules de MM entrainent une augmentation de la formation et de l’activité des ostéoclastes et une diminution du nombre des ostéoblastes.
L’augmentation de l’activité des OC est médiée par divers facteurs activant les OC (OAF) produits par les MMC et les BMSC (bone marrow stromal cell). Ces facteurs sont MIP-1α (macrophage inflammatory protein-1), un ligand du récepteur NF-κB (RANKL aussi nommé TRANCE : TNF-related activation-induced cytokine ou OPGL : osteoprotegerin ligand), le VEGF, le TNF-α, l’IL-1ᵝ, le PTHrP (parathyroid hormone-related protein), l’HGF et l’IL-6. L’activité des OC module également la croissance et la survie des MMC [23 ; 24].
La diminution du nombre d’ostéoblastes pourrait être expliquée par la dérégulation de plusieurs molécules incluant Runx2/Cbfa1, Wnt et IL-3.
Les MMC bloquent l’activité et la fonction des facteurs de transcription Runx2/Cbfa1 dans les progéniteurs ostéoblastiques à travers l’interaction directe VLA-4/VCAM-1 ou la sécrétion d’IL-7 [25]. Runx2 augmente également l’ostéoclastogenèse par l’induction de la sécrétion d’osteoprotegerin (OPG) par les cellules progéniteurs d’ostéoblastes [26].
Les cellules endothéliales (EC) de l’environnement tumoral sont différentes de celles des sujets sains dites EC normales. Les EC des tumeurs ont une prolifération importante et accompagnent la progression tumorale (croissance, invasion, métastase) [27].
Au total, l’environnement médullaire en interaction avec les cellules myélomateuses a une grande importance dans la biologie du MM. Au sein de la moelle osseuse, les MMC vont activer les autres composantes de la MO et créer un environnement favorable à leur migration, survie et prolifération (Figure 2). Du fait de ces interactions, de nombreux facteurs de croissance vont être produits et impliqués dans la progression du clone tumoral. D’une part, la grande diversité de ces facteurs de croissance rend la biologie du MM complexe. D’autre part, le MM est une maladie hétérogène caractérisée par de nombreuses anomalies cytogénétiques qui possèdent, de ce fait, des profils d’expression de gènes différents entre patients.
Aspects moléculaires
L’interaction entre les cellules myélomateuses et l’environnement médullaire favorise la production de cytokines par les cellules tumorales elles-mêmes et par les cellules de l’environnement. Ces molécules, présentes à de fortes concentrations dans la MO, vont permettre la progression et la survie du clone tumoral. Plus d’une dizaine de facteurs de croissance myélomateux ont été identifiés. Un des acteurs essentiels dans la survie et la prolifération des plasmocytes malins est l’interleukine-6 (IL6). (Tableau III).
Anomalies cytogénétiques
Les principales anomalies cytogénétiques décrites dans le MM sont soit des anomalies de nombre, soit des anomalies de structure des chromosomes.
Les anomalies de nombre ou aneuploïdies sont séparées en 2 groupes d’une part, les hyperdiploïdies et d’autre part les hypodiploïdies.
Les hyperdiploïdies (présence d’un ou de plusieurs chromosomes en sus du nombre normale diploïde de chromosome) représentent environ 50% des cas et concernent surtout les chromosomes 3, 5, 7, 9, 11, 19 et 21.
Les pertes chromosomiques rencontrées dans les hypodiploïdies concernent les chromosomes 13, 14, 16 et 22[49].
Les anomalies de structures ou aneusomie décrites dans le MM impliquent principalement les loci IgH (en 14q32), P53(en 17p13), le chromosome 13 ou le chromosome 1(gain en 1q).
Les réarrangements de la bande 14q32 (IgH) sont identifiés dans 55 à 70% des cas. Les translocations décrites sont : la t(11;14)(q13;q32) dans 15 à 20%, la t(4;14)(p16;q32) représente environ 15% des cas ou les translocations t(14;16)(q32;q23), t(14;20)(q32;q11) ou t(6;14)(p21;q32) dans moins de 5% des cas respectivement. Le partenaire d’IgH n’est pas identifié dans 20% des cas. Par contre, sur 40 à 50% des cas, il est observé une monosomie 13 ou plus rarement une délétion del (13q). Il existe une association fréquente entre les translocations t(4;14) ou t(14;16) et la perte d’un chromosome 13. Enfin, la délétion del (17q) est identifiée dans moins de 10% des cas [49].
Ces anomalies peuvent être détectées par des techniques d’hybridation in situ (FISH) sur des cellules en interphase [50].
La translocation impliquant la région 14q32
Ces translocations sont dues généralement à une erreur dans le processus de réarrangement des Ig durant la commutation isotypique. La translocation de l’IgH (locus 14q32) entraîne une dérégulation d’un oncogène par juxtapositon d’une région proche d’un élément activateur de la transcription : l’Ig enhancer, ce qui conduit à la transcription de ces oncogènes. Trois partenaires chromosomiques récurrents sont le plus souvent associés à cette translocation [12-51] :
– le gène sur le chromosome 11q13, dérégule le gène CCND1, conduisant à une hyperexpression de la cycline D1. [52].
– le gène localisé sur le 4p16, est unique, dans le sens où elle n’a jamais été décrite dans d’autres pathologies (mais elle n’est pas identifiable par cytogénétique conventionnelle), et où elle entraîne la dérégulation de deux gènes situés de part et d’autres du point de cassure sur le chromosome 4 [53]. Le gène FGFR3, situé en position distale (télomérique), est transloqué sur le dérivé du chromosome 14, conduisant à sa surexpression. En position proximale par rapport au point de cassure, un gène a été identifié par clonage de la translocation : le gène MMSET. Ce gène (dont les fonctions restent essentiellement méconnues) comporte un domaine SET, qui serait impliqué dans la régulation de la conformation chromatinienne. La translocation conduit à la formation d’un gène chimérique sur le dérivé du chromosome 4, ce qui constitue un cas d’espèce dans les translocations 14q32 marqué par une dérégulation de l’expression de MMSET et de FGFR3.
– le gène se trouve sur le 16q22-23, dérégule l’oncogène c-maf en le déplaçant sur le der (14), ce qui explique sa surexpression [54].
La disparité de partenaires chromosomiques explique sans doute en partie l’hétérogénéité de la pathologie.
Ces anomalies chromosomiques impliquant le gène IGH sont très certainement très précoces dans l’oncogenèse de la maladie. En effet, lorsque l’on analyse des cas de MGUS, l’incidence de ces réarrangements illégitimes est globalement la même que dans le MM symptomatique, avec peut-être une moindre incidence de t(4;14) [55 ; 56].
Anomalies du chromosome 13
Cette anomalie a été l’une des premières à être reconnue dans les études cytogénétiques. Initialement décrites comme des pertes centrées sur la région 13q14, il a été montré par la suite que la très grande majorité de ces anomalies correspondaient en fait à des monosomies 13 [57 ; 58]. Il n’est d’ailleurs pas certain que les rares délétions partielles (< 10 % des anomalies du 13) aient la même traduction biologique que les pertes complètes. Deux études ont cherché à déterminer l’incidence réelle des monosomies par rapport aux délétions partielles. Ces deux travaux s’accordent à démontrer que 90% des anomalies du chromosome 13 sont en fait des monosomies.
Tout comme les précédentes anomalies, les anomalies du 13 ont été décrites dans les MGUS, avec une incidence similaire à celle retrouvée dans le MM, soit de l’ordre de 40–50 % [56-57]. La distribution de ces anomalies ne semble pas aléatoire. Alors qu’elles sont rarement retrouvées chez les patients hyperdiploïdes, elles sont à l’inverse pratiquement constantes chez les patients présentant une t(4;14), une t(14;16) ou une del(17p). Tout comme les deux précédentes anomalies, les anomalies du chromosome 13 sont très probablement primitives, ou tout du moins, surviennent lors des premiers stades de l’oncogenèse plasmocytaire.
Anomalies du chromosome 17
Les études se sont concentrées sur le gène p53, situé sur le 17p13. Par analyse FISH, la plupart des études montrent une perte de ce gène chez près de 10 % des patients atteints de MM, mais exceptionnellement dans les cas de MGUS [59-60].
En effet, la p53, gène suppresseur de tumeur, bloque l’entrée du cycle cellulaire. Les mutations de la p53 sont relativement rares dans les MM au diagnostic (5%) mais cette fréquence semble augmenter avec la progression tumorale et est retrouvée dans 30% des PCL (Plasma cell leukaemia) [61]. Il en est de même pour les délétions de p53 qui se produisent dans 10% des MM et environ 40% des PCL. La perte d’un allèle de ce gène nécessiterait une mutation du second allèle pour avoir une implication biologique, ayant pour conséquences, soit une inactivation épigénétique de p53 ou soit une augmentation de l’expression de MDM2 (protéine destructrice de p53) [59].
La del 17 est une des anomalies cytogénétiques les plus importantes associée à un facteur de mauvais pronostic [62].
Hyperdiploïdie
La seconde anomalie en termes de fréquence est l’hyperdiploïdie (50 à 60 % des patients) [63-64]. En effet, la nature des chromosomes en excès n’est pas aléatoire, et touche tout particulièrement les chromosomes impairs (3, 5, 7, 9, 11, 15, 19 et 21). Aucune explication, ni même d’hypothèse, n’a été avancée à ce jour pour expliquer ce biais dans la nature des chromosomes gagnés. Cela est d’autant plus troublant que, si l’on analyse la nature des chromosomes impliqués dans les hyperdiploïdies d’une autre hémopathie lymphoïde B, la leucémie aiguë lymphoblastique de l’enfant, ceux-ci sont totalement différents. Cependant, l’hyperdiploïdie dans le MM représente très probablement une voie oncogénique distincte de celle liée aux translocations impliquant la bande 14q32. En effet, les réarrangements récurrents impliquant la région 14q32 sont pratiquement incompatibles avec une hyperdiploïdie [65]. Comme toutes translocations impliquant la région 14q32, l’hyperdiploïdie a été démontrée dans les MGUS, montrant ainsi le caractère précoce de survenue de ces anomalies [66].
CRITERES PRONOSTIQUE
Dans la littérature, on distingue plusieurs types de facteurs pronostiques. Ceux qui sont liés à la masse tumorale (Classification de Salmon et Durie, β2-microglobuline), à la malignité intrinsèque du clone (Index cinétique, CRP, IL-6, Etude cytogénétique, Morphologie et certains marqueurs sériques), et à l’hôte (Age ˃ 65 ans, Sexe masculin, diminution du taux de CD4 entre autre). La β2-microglobuline et la CRP apparaissent comme des facteurs pronostiques indépendants et révèlent des informations importantes en termes de survie. De plus, ils sont intéressants car ce sont des examens tout à fait accessibles à plusieurs centres [74].
En pratique, ce sont les paramètres permettant d’établir le stade pronostique de Salmon et Durie (Tableau VII), encore utilisé par les cliniciens (NFS, calcémie, créatinine, recherche d’Ig monoclonale). Le score International Staging System ou ISS (albuminémie, β2-microglobuline), la LDH, la CRP, l’âge, la cytogénétique (FISH) et le profil d’expression génique (GEP) (évaluation transcriptionnelle sur plasmocytes purifiés) sont également pris en compte pour une meilleure orientation vers une thérapie ciblée. Compte tenu des éléments disponibles, l’IMWG (International Myeloma Working Group) a proposé une stratification de la maladie (cf. Tableau VIII).
Type et cadre d’étude
Il s’agit d’une étude rétro-prospective, multicentrique réalisée dans la fédération des laboratoires de l’Hôpital Principal de Dakar (HPD), les services d’Hématologie Clinique et le laboratoire de Biologie de l’Hôpital Aristide Le Dantec (HALD) et le Centre National de Transfusion Sanguine (CNTS).
Critères d’inclusion
Les patients de tout âge, internes ou externes présentant soit une plasmocytose médullaire supérieure à 10% avec un caractère dystrophique des plasmocytes soit la présence d’Ig monoclonales sériques caractérisées par l’immunofixation des protéines sériques ont été inclus dans l’étude.
Procédure de collecte des données
Une partie des données a été obtenue à partir de Inlog, logiciel d’exploitation des données de la fédération des laboratoires de l’HPD. Les résultats épidémiologiques et cliniques ont été collectés à l’aide d’un questionnaire.
Ce questionnaire comporte des données épidémiologiques qui sont fournies par le bulletin d’analyse.
Prélèvements
Les prélèvements sanguins ont été effectués sur tubes secs pour l’électrophorèse et l’immunofixation des protéines sériques et sur tubes contenant de l’héparinate de lithium pour la FISH.
Les échantillons sont acheminés au laboratoire dans l’heure qui suit. Le tube sec est centrifugé à 1000 tours /mn pendant 5 mn, le sérum est tout de suite traité ou conservé à + 4°C ou – 20°C.
Myélogramme
Le myélogramme est un examen cytologique de la moelle osseuse réalisé après prélèvement du suc médullaire.
Dans le myélome, le myélogramme permet ainsi de détecter la présence et le pourcentage de plasmocytes anormaux afin de poser le diagnostic.
La moelle osseuse prélevée peut servir également à pratiquer les analyses cytogénétiques et moléculaires.
La lecture se fera (généralement sur deux à quatre lames) d’abord au faible grossissement pour apprécier la richesse cellulaire puis au fort grossissement pour l’étude des différentes lignées (figure 4).
Electrophorèse des protéines sériques
L’électrophorèse des protéines sériques consiste à soumettre les protéines du sérum à un champ électrique. En milieu basique (pH = 9,2) ces molécules amphotères se chargent négativement et, sous l’influence du champ électrique, migrent de la cathode vers l’anode sur un gel d’agarose. Une fois séparées, les différentes fractions protéiques peuvent être colorées puis mesurées par densitométrie optique.
Les résultats se présentent sous forme d’une bande du support, une courbe traduisant la densité optique des plages colorées et un tableau de chiffres.
Les protéines sont séparées en cinq fractions : albumine, α1- et α2-globulines, β-globulines et γ-globulines (figure 5).
Matériels et méthode
Matériels
– Tube vacutainer (Becton Dickinson Vacutainer System) contenant de l’héparine de Lithium comme anticoagulant
– Micropipettes de volume variable
– Centrifugeuse
– Bain marie avec réglage et contrôle de température
– Incubateur à 37°C
– Microscope à fond clair
– Vortex
– Tube Falcon de 15 ml en polypropylène
– Acide acétique à 5%
– Solution hypotonique de chlorure de potassium (KCl) 0,075 M (0,56g/l)
– Solution fixative ou Carnoy : mélange de méthanol (3 volumes) et d’acide acétique glacial (1 volume)
Méthode
– Mettre 500μl de suc médullaire dans un tube Falcon 15ml
– Laver trois fois avec de l’eau physiologique et une centrifugation à 1700 trs/mn pendant 7mn
– Ajouter 10ml de KCl à 0,075 M [choc hypotonique aux cellules. Cette étape permet de faire gonfler les cellules (turgescence)]
– Incuber au bain marie ou à l’étuve à 37°C pendant 10mn
– Ajouter 2ml d’acide acétique glacial à 5% : Préfixation (favorise l’hémolyse des hématies)
– Homogénéiser puis centrifuger à 1700 trs/mn pendant 7mn
– Éliminer le surnageant
– Ajouter, goutte à goutte et mixer en même temps au vortex, 10ml de solution de Carnoy.
Origine des prélèvements
Les patients étaient hospitalisés dans les services de médecine interne et des maladies infectieuses de l’Hôpital Principal de Dakar (HPD) (53%) et du service de médecine interne de l’Hôpital Aristide Le Dantec (HALD) (21 cas).
Circonstances de découverte
Elles étaient très variables, mais dominées principalement par des douleurs osseuses (N=37). Chez un malade la circonstance de découverte était une fracture. Le caractère pathologique de cette fracture n’a pas été précisé. Chez 7 patients la découverte était systématique après un bilan biologique qui avait montré la présence d’un pic monoclonal à l’électrophorèse, caractérisé par l’immunofixation des protéines sériques.
Myélogramme
Le myélogramme a révélé une infiltration plasmocytaire supérieure à 10% chez 39 patients soit 87% des cas. Chez 4 patients la plasmocytose médullaire était inférieure à 10%. Deux cas de ponction hémodiluée soit 4% étaient enregistrés.
Par ailleurs une plasmocytose dystrophique a été notée chez l’ensemble des patients (Figure 5).
Aspects biochimiques
Protéinémie
Une hyperprotidémie a été observée chez 35 patients soit 75,5 % dans notre population d’étude avec une moyenne de 105 g/l (extrêmes : 84 – 159 g/l).
Un taux de protides normal a été observé chez 24,5% des patients.
Electrophorèse des protéines sériques
Un pic à l’électrophorèse des protéines sériques a été noté chez 42 patients soit 93% des cas. Ce pic était essentiellement situé dans la zone gamma chez 34 patients soit 81% et dans la zone beta chez 8 cas soit 19%. A noter que 7% des patients avaient un profil normal.
Corrélation entre FISH et myélogramme
L’anomalie chromosomique liée à une perte d’un allèle du gène TP53 peut montrer un impact pronostique défavorable sur la prolifération plasmocytaire médullaire. Dans notre série le pourcentage de délétion le plus important a révélé une plasmocytose médullaire de 46% (Tableau 10).
Corrélation entre FISH et protides totaux
Le taux de protide sérique total peut être corrélé au pourcentage de délétion du bras court du chromosome 17. Trois patients ont présenté une hyperprotidémie associant un taux de délétion compris entre 1 et 4% (Tableau 10).
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Table des matières
PREMIERE PARTIE : Généralités sur le myélome multiple
1. GENERALITES SUR LE MYELOME MULTIPLE
2. RAPPELS SUR LA LYMPHOPOIESE
3. HEMOPATHIES MALIGNES LYMPHOIDES
4. PHYSIOPATHOLOGIE DU MM
4.1. Aspects cellulaires
4.2. Aspects moléculaires
4.3. Anomalies cytogénétiques
4.3.1. La translocation impliquant la région 14q32
4.3.2. Les anomalies du chromosome 13
4.3.3. Les anomalies du chromosome 17
4.3.4. L’hyperdiploïdie
5. DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE
6. CRITERES PRONOSTIQUE
DEUXIEME PARTIE : Travail expérimental
1. CONTEXTE ET INTERET
2. OBJECTIFS
2.1. Objectif général
2.2. Objectifs spécifiques..
3. MATERIELS ET METHODES
3.1. Type et cadre d’étude
3.2. Critères d’inclusion
3.3. Critères de non inclusion
3.4. Variables étudiées :
3.4.1. Variables épidémiologiques
3.4.2. Variables biologiques
3.5. Procédure de collecte des données
3.6. Prélèvements
3.7. Myélogramme
3.8. Electrophorèse des protéines sériques
3.9. Immunofixation des protéines sériques
3.10. Récolte directe
3.10.1. Matériels et méthode
3.11. Hybridation in situ en fluorescence (FISH)
3.11.1. Principe
3.11.2. Matériels et méthode
4. RESULTATS
4.1. Résultats globaux
4.2. Age
4.3. Sexe
4.4. Origine des prélèvements
4.5. Circonstances de découverte
4.6. Myélogramme
4.7. Aspects biochimiques
4.7.1. Protéinémie
4.7.2. Electrophorèse des protéines sériques
4.7.3. Immunofixation des protéines sériques
4.8. Résultats de la FISH
4.8.1. Corrélation entre FISH et myélogramme
4.8.2. Corrélation entre FISH et protides totaux
4.9. Analyse statistique
5. DISCUSSION
CONCLUSIONS
REFERENCES
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