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Protéines mitochondriales
Seule une très faible proportion des protéines présentes dans la mitochondrie sont codées par l’ADNmt et fabriquées par les ribosomes mitochondriaux : les mitoribosomes. Ces mitoribosomes ont la particularité d’avoir une faible teneur en ARN et par conséquence un faible coefficient de sédimentation d’environ 55S. Les sous-unités ribosomales 39S et 28S, contiennent respectivement les ARNr 16S et 12S, codés par l’ADNmt. La faible teneur en ARN des mitoribosomes est compensée par une relativement grande teneur en protéines, ce qui a pour résultat de donner aux mitoribosomes une masse similaire aux ribosomes de bactéries.
La plupart des protéines mitochondriales sont donc codées par l’ADNn, traduites par les ribosomes cytoplasmiques et importées dans les mitochondries. La distribution de ces protéines dans les compartiments mitochondriaux appropriés est un processus complexe. Il existe différentes voies d’importation selon la destination des protéines, c’est-à-dire la matrice mitochondriale, la membrane interne, la membrane externe ou l’espace intermembranaire.
Production de protéines codées par l’ADNmt
Les ARNm mitochondriaux n’ont pas de séquence leader pour faciliter la fixation des ribosomes, comme c’est le cas pour les procaryotes et les messagers cytosoliques des eucaryotes. De plus, ces messagers ne disposent pas non plus de coiffe en 5′ qui leur permettrait de fixer des facteurs d’initiation48. Ainsi, le début de la traduction se fait au niveau ou très proche de l’extrémité 5′ du codon initiateur N-formylméthionine. La petite sous-unité des mitoribosomes (28S) va se lier à l’ARNm. Cette interaction entre messager et petite sous-unité ribosomique nécessite 30 à 80 nucléotides alors que 400 nucléotides, au minimum, sont nécessaires pour avoir une efficacité de liaison maximale. Ceci peut expliquer pourquoi les deux plus courts cadres ouverts de lecture de l’ADNmt (ATPase 8 et ND4L, tous les deux inférieurs à 300pb) sont des gènes chevauchants : ATPase 8/ATPase 6 et ND4L/ND4. Ces deux paires de gènes vont donner des messagers bicistroniques. En effet, des transcrits monocistroniques des gènes ATPase 8 et ND4L auraient été trop petits pour avoir une interaction efficace avec la petite sous-unité ribosomique. Une fois que la petite sous-unité des mitoribosomes est fixée sur le messager, elle va se déplacer vers l’extrémité 5′ de l’ARNm49.
Importation des protéines codées par l’ADNn
Comme dit précédemment, la majorité des protéines mitochondriales est synthétisée dans le cytoplasme. Ces protéines doivent ensuite traverser la membrane externe et la membrane interne pour rejoindre la matrice mitochondriale, elles peuvent éventuellement s’intégrer aux membranes externes ou internes s’il s’agit de protéines transmembranaires.
Ces protéines sont adressées au compartiment mitochondrial via une séquence-cible d’une longueur de 10 à 80 acides aminés. Lorsque ces protéines atteignent leur destination finale, leur séquence-cible est clivée. Elles sont par la suite prises en charge pas des protéines chaperonnes de type mtHSP (mitochondrial Heat Shock Protein), qui leur confèrent leur conformation tridimensionnelle finale. L’importation des protéines vers les différents compartiments mitochondriaux (membrane externe ou interne, espace intermembranaire, matrice) est médiée par deux translocases, TOM et TIM (Figure 9)50 :
– Le complexe TOM (Translocase Outer Membrane) est situé dans la membrane externe mitochondriale. Il est composé de sept protéines dont une partie (TOM70, TOM22 et TOM20) est impliquée dans la reconnaissance des protéines destinées à l’espace intermembranaire et la matrice mitochondriale. La seconde partie (TOM40, TOM7, TOM6 et TOM5) participe à la formation du pore transmembranaire au niveau de la membrane externe.
– Le complexe TIM (Translocase Inner Membrane) est localisé dans la membrane interne. Il est composé de sept protéines dont une partie (TIM50, TIM23, TIM21 et TIM17) est impliquée dans la reconnaissance des protéines destinées à la matrice mitochondriale. La seconde partie (TIM44, TIM6 et TIM4) participe à la formation du pore transmembranaire au niveau de la membrane interne permettant le transfert des protéines vers la matrice11,51.
Selon les caractéristiques des protéines (ex. taille, protéine transmembranaire, etc.) la translocation par les complexes TOM et TIM est différente. Les protéines contenant plusieurs domaines transmembranaires sont transférées, via TOM et TIM23, qui gèrent l’insertion des protéines transmembranaires dans la membrane interne. La protéine est ensuite exportée dans la membrane interne par le complexe PAM (Presequence translocase-Associated Motor), partenaire de TIM23 pour l’insertion des protéines transmembranaires. Les protéines qui ne contiennent qu’un seul domaine transmembranaire sont importées via les TOM et le TIM23 uniquement.
Les protéines contenant plusieurs résidus hydrophobes et plusieurs domaines transmembranaires sont d’abord transférées par le TOM. Elles sont ensuite interceptées par le TIM (TIM12, TIM10 et TIM9) présent dans l’espace intermembranaire, et transférées au complexe TIM22 (TIM54, TIM22 et TIM18) qui les insère dans la membrane interne.
Les protéines destinées à l’espace intermembranaire présentent deux séquences-cibles leurs permettant de voyager par les complexes TOM puis les TIM23. Une première protéolyse permet leur insertion dans la membrane interne tandis que la seconde permet leur insertion dans l’espace intermembranaire.
Les protéines de la membrane externe sont importées par le TOM dans la membrane externe, transférées vers les TIM (TIM10, TIM8, TIM13) afin d’être prises en charge par la protéine transmembranaire SAM (Sorting and Assembly Machinery) qui permet l’insertion de la protéine dans la membrane externe.
Contrôle-Qualité mitochondrial
Les interactions entre les génomes nuclaire et mitochondrial ne se limitent pas uniquement à la traduction et l’import des protéines mitochondriales. En effet, il existe également une communication inter-génomes permettant un contrôle-qualité des fonctions mitochondriales. Le principe de cette communication repose sur un stimulus initial d’origine mitochondrial vers le génome nucléaire qui déclenche ou non, une réponse à ce stimulus.
De nombreux travaux ont permis de mettre en évidence plusieurs de ces stimuli, couramment définis dans la littérature comme « signal rétrograde mitochondrial »52,53. Les principaux signaux, évidemment propres à la physiologie mitochondriale, peuvent être une variation du potentiel de membrane, un différentiel des concentrations en Ca2+, ATP/AMP, ROS ou NAD+/NADH. Plusieurs catégories de réponses à ce signal rétrograde ont été démontrées comme pouvant réguler l’ensemble des fonctions mitochondriales par l’activation de facteurs ou de voies de signalisations particulières. Ces régulations peuvent impacter la capacité (ex. transcription, assemblage des complexes OXPHOS) et la dynamique mitochondriale (ex. fusion, fission) par l’activation de facteurs tels que TFAM, mTERF (mitochondrial transcription TERmination Factor), POLRmt, NRF1 (Nuclear Respiratory Factor 1), NFκB (Nuclear Factor-kappa B), ou bien la voie de signalisation mTOR (mammalian Target Of Rapamycin). Il est par ailleurs intéressant de noter que l’étude de cette voie de régulation mTOR semble indiquer que ce contrôle-qualité est très conservé au cours de l’évolution, et ce quelle que soit l’espèce étudiée. La régulation de la masse mitochondriale par l’activation de facteurs tels que PGC-1, le repliement des protéines CHOP (CEBP Homologous Protein) et JNK (c-Jun N-terminal kinase) par mtUPR (Unfolded Protein Response), ainsi que le switch métabolique (ex. PI3K, gènes glycolytiques) semblent également être des voies de régulations efficaces pour le maintien de l’homéostasie mitochondriale et cellulaire. Bien que les réponses du génome nucléaire soient très spécifiques, elles ne semblent pourtant pas se limiter à l’activation d’un seul facteur (ou d’une seule voie de signalisation), mais plutôt d’une activation globale.
Phylogénie moléculaire et phylogéographie de l’ADNmt
Dans le domaine de la génétique des populations, il est possible de distinguer trois types d’évènements mutationnels en fonction de leur impact sur le phénotype : les mutations dites « positives » qui permettent d’augmenter le pouvoir reproducteur ; les mutations dites « pathogènes » qui diminuent le pouvoir reproducteur ; et les mutations dites « neutres» (polymorphisme) qui n’ont aucun impact. Par définition, les mutations positives se propagent alors que les mutations pathogènes tendent à disparaitre.
Théorie de la coalescence
Les mutations « neutres » sont à la base de la théorie de la coalescence. En effet, l’étude d’une même séquence d’ADN entre différents individus et espèces a permis de mettre en évidence l’existence d’une variabilité inter-séquences des polymorphismes de I’ADNmt. La théorie de la coalescence54 stipule que les variations de polymorphismes sont liées à l’histoire évolutive de cet ADN. Cette théorie se base sur l’hypothèse que les séquences d’ADN de chaque individu peuvent être reliées entre elles par un arbre généalogique55,56 (représentation graphique des liens de parenté et de filiation d’un groupe d’individus). Ainsi, il est possible de définir un ancêtre commun appelé MRCA (Most Recent Commun Ancestor) à l’origine de cet arbre. Les polymorphismes observés sur ces séquences seraient alors issus d’événements mutationnels apparus régulièrement au cours de l’histoire évolutive de l’ADNmt étudié. Cette théorie permet également de reconstruire des arbres généalogiques à partir des études génétiques. Les arbres ainsi construits sont appelés arbres phylogénétiques. En effet, puisque les différences s’accumulent au fur et à mesure des ramifications de l’arbre phylogénique, deux séquences très similaires seront donc très proches dans l’arbre.
Différentes méthodes sont utilisées afin de reconstruire des arbres phylogéniques à partir des séquences génétiques mitochondriales57. Cependant, ces méthodes sont difficilement adaptables aux caractéristiques des études anthropologiques. En effet, les travaux portant sur la phylogénie mitochondriale humaine étudient de très nombreux échantillons (plusieurs centaines) génétiquement très proches. De plus, la phylogénie mitochondriale humaine laisse apparaître de nombreuses « multifurcations » (diverses branches) et des événements mutationnels identiques indépendants. Afin de s’adapter à ces caractéristiques, une nouvelle méthode basée sur les réseaux génétiques est apparue en 199558. Cette méthode permet de construire un réseau phylogénétique laissant apparaître les différents liens possibles. Elle est essentiellement utilisée pour les données provenant des analyses par séquençage de la région D-loop et des études par enzymes de restriction des polymorphismes de l’ADNmt.
Hypothèse de l’horloge moléculaire
L’hypothèse de l’horloge moléculaire est une hypothèse selon laquelle la probabilité qu’une mutation apparaisse au cours du temps soit constante. Ainsi le nombre de mutations séparant deux individus d’un même ancêtre commun est corrélable au temps écoulé depuis cette divergence.
En comparant le nombre de mutations survenues entre deux individus ou deux espèces, dont la date de divergence est connue, il est possible de calibrer la datation. Ainsi, le taux de mutation de l’ADN mitochondrial des hominidés, calibré à partir d’une date estimée de divergence entre l’Homme et le chimpanzé à 6,5 millions d’années, est estimé pour la séquence codante à 1,26.10-8 substitutions par nucléotide et par an59. Cependant, ce taux moyen reste très controversé et peut varier en fonction du type de polymorphisme étudié (polymorphisme synonyme, non-synonyme, transition, ou transversion), ou du locus étudié (D-Loop ou zone codante) ou bien même de la lignée étudiée. Grâce à cette hypothèse, il a été possible de proposer des datations concernant les événements phylogéniques obtenus par l’hypothèse de la coalescence.
Cette hypothèse est régulièrement remise en question. En effet, des études ont montré que des mutations avantageuses se fixent plus rapidement lors de la formation de nouvelles espèces, rendant ainsi cette théorie finalement inconstante60. De plus, les événements mutationnels seraient épisodiques61,62, c’est-à-dire que les mutations ne se produiraient pas de façon indépendante au cours de l’évolution mais apparaitraient par épisodes d’accumulation suivis d’un arrêt évolutif. Bien qu’elle soit critiquable, l’utilisation de l’horloge moléculaire est aujourd’hui limitée à l’étude de locus particuliers associés à une période temporelle délimitée.
Haplotype, haplogroupe et nomenclature de l’ADNmt
Afin de faciliter l’étude des ADNmt, il a été proposé de caractériser ces ADN en mettant en évidence les variations de composition par rapport à la séquence de référence (CRS). Chaque combinaison de polymorphismes présente sur un ADNmt est appelée haplotype (séquence d’ADNmt d’un individu), et lorsque plusieurs haplotypes se partagent plusieurs polymorphismes, cohérents en terme d’événements mutationnels, il est possible de créer un groupe d’haplotypes, nommé haplogroupe.
La première classification des haplogroupes a été proposée par A. Torroni en 1993. Cette classification permet de regrouper les différents haplotypes dont les polymorphismes les définissant ont été obtenus par RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) dans des haplogroupes, et à partir d’un nombre limité de polymorphismes. Cette classification a été ultérieurement implémentée par les différents travaux sur l’étude du peuplement du même auteur63,64.
Par la suite, Richards et Macaulay, proposent en 1998 une autre nomenclature des ADNmt basée cette fois-ci sur la distinction de lignées mitochondriales monophylétiques qu’ils nomment « clusters »65,66. Cette nouvelle nomenclature est une version plus affinée que celle proposée en 1993. Les principaux clusters sont désignés par une lettre majuscule (ex. haplogroupe J) et pour la plupart reprennent les lettres déjà proposées initialement (Figure 10). Les branches secondaires sont définies par une alternance de chiffres et de lettres minuscules (ex. haplogroupe J1c). Les regroupements de clusters sont désignés par le regroupement de leurs noms, ainsi on nomme AB le plus petit cluster regroupant les clusters A et B. Lorsque l’origine monophylétique d’un cluster n’est pas certaine, on appose un astérisque (*). Si des clusters définis et des lignées isolées ont un même ancêtre commun, ils sont regroupés dans un cluster désigné par le préfix “pre-” suivi du nom des clusters déjà définis.
Phosphorylations oxydatives
Comme vu précédemment, la mitochondrie participe à une partie de l’oxydation des glucides, des acides aminés, et la totalité de celle des acides gras. Au cours de ces réactions cataboliques, l’énergie contenue dans les glucides, les lipides et les protides permet la réduction de coenzymes tels que le NAD+ (Nicotinamide Adénine Ddinucléotide) et le FAD (Flavine Aadénine Dinucléotide). L’énergie potentiellement contenue dans ces équivalents réducteurs, essentiellement NADH et FADH2, est transformée en une forme d’énergie directement utilisable pour le travail cellulaire, l’ATP. Cette transformation porte le nom de phosphorylation oxydative et elle repose sur une série de réactions d’oxydoréduction au niveau de la chaîne respiratoire couplée à l’ATP synthase.
Chaine respiratoire mitochondriale
La chaine respiratoire est constituée d’une suite de réactions d’oxydo-réduction reliant l’oxydation du NADH et du FADH2 à la réduction de l’oxygène (Figure 12)69. La chaine principale de transfert d’électrons comporte 3 complexes multi-enzymatiques (I, III et IV) et deux transporteurs mobiles (coenzyme Q et cytochrome c).
Le complexe II fournit des électrons provenant du succinate qui rejoint cette chaine principale au niveau du coenzyme Q (Co-Q). A l’intérieur des complexes I, III et IV, les électrons transférés du NADH vers l’oxygène sont relayés par des transporteurs spécifiques (flavine mononucléotide, centres fer-soufre, et hèmes présents dans les cytochromes) dont les potentiels rédox vont croissants, les potentiels standards extrêmes étant ceux des couples NAD+/NADH (E’0= -0,3V) et O2/H2O (E’0= +0,8V).
Parallèlement à ces réactions d’oxydo-réduction, des protons H+ sont expulsés de la matrice vers l’espace intermembranaire (au niveau des complexes I, III et IV) ce qui créer, de part et d’autre de la membrane interne, un gradient électrochimique d’ions H+ qui contient l’énergie d’oxydation. Il est constitué d’un gradient de pH (la matrice devient plus basique) et d’un gradient de charges (la face matricielle de la membrane interne est chargée négativement).
Succynyl-CoQ oxydoréductase
Le complexe II (EC 1.3.5.1) est composé de quatre sous-unités codées par l’ADNn uniquement et possède une masse de 124kDa. Deux d’entre-elles forment un complexe soluble dans l’eau (sous-unités 27 et 70 kD) et correspond à la succinate deshydrogénase (SDH) tandis que les deux autres sous-unités sont associées à la membrane interne72. Le complexe II se situe à l’interface du cycle de Krebs et de la chaîne respiratoire. Il réalise l’oxydation du succinate en fumarate pour réduire le FAD en FADH2 puis il prend en charge les électrons du FADH2 et les transmet au pool quinonique situé dans la membrane interne mitochondriale : succinate + Co-Q = fumarate + CoQH2.
CoQH2-Cytochrome c oxydoréductase
Le complexe III (EC 1.10.2.2) est un dimère composé chacun de onze chaines polypeptidiques de 240kDa dont une sous-unité est codée par l’ADNmt (Cytochrome b)73. Le complexe III récupère les électrons transmis par le complexe I et II via le Co-Q. Ces électrons permettent la réduction du cytochrome c via un centre fer-soufre et dans un second temps, la réoxydation du Co-QH2 via des groupements d’hèmes. L’énergie libre de cette réaction permet, comme pour le complexe I, la translocation de protons H+ de la matrice vers l’espace intermembranaire mitochondrial. La réaction globale du complexe III est la suivante : Co-QH2 + 2 cyt c OX + 2H+matrice = Co-Q + 2 cyt c RED + 4H+ espace inter.
Cytochrome c oxydase
Le complexe IV (EC 1.9.3.1) est composé de treize sous-unités dont trois sont codées par l’ADNmt (COI, COII, COIII) d’une masse de 130kDa74. Il assure l’oxydation du cytochrome c réduit, couplé à la réduction de l’oxygène moléculaire dans la matrice mitochondriale. Les trois sous-unités codées par l’ADNmt constituent le noyau catalytique de l’enzyme qui contient les sites de fixation de l’oxygène et du cytochrome c. Les dix sous-unités codées par l’ADNn interviendraient dans la régulation de l’activité enzymatique ainsi que dans la formation du complexe. La cytochrome c oxydase contient trois centres redox qui sont le centre cuivre a (CuA), l’hème a et le centre cuivre B-hème a3 (CuB-hème a3). L’énergie libre de cette réaction permet également la translocation de protons H+ de la matrice vers l’espace intermembranaire mitochondrial. La réaction globale du complexe IV est la suivante : 4 cyt c RED + 8H+matrice + O2 = 4 cyt c OX + 2 H2O + 4H+espace inter.
ATP synthase
L’ATP synthase ou complexe V ou complexe F1-F0 (EC 3.6.1.34) est, comme les complexes de la chaine respiratoire, localisée dans la membrane interne mitochondriale75. Elle possède une masse proche de 450kD et est constituée de seize sous-unités, dont deux sont codées par l’ADNmt (ATPase 6 et ATPase 8), et dont certaines sont présentes en plusieurs exemplaires. L’ATP synthase comporte 2 sous-complexes :
– Le sous-complexe F1 contient le site catalytique (exposé du côté de la matrice mitochondriale)
– Le sous-complexe F0 sert au transfert vectoriel des protons (intramembranaire)
La réaction globale de l’ATP synthase est la suivante : ADP + Pi + nH espace inter. = ATP + H2O + nH matrice
Théorie chimio-osmotique
L’oxydation des substrats réduits (NADH et FADH2) provenant du cycle de Krebs ou de la ß-oxydation des acides gras par les complexes enzymatiques de la chaîne respiratoire, génère une cascade d’électrons qui s’achève par la réduction de l’oxygène moléculaire en eau. Ce transfert d’électrons au travers les différents complexes est couplé à l’excrétion de protons H+ par les complexes I, III et IV de part et d’autre de la membrane interne mitochondriale, conduisant ainsi à la création d’un gradient électrochimique de protons (∆µH+). Etant donné l’imperméabilité de la membrane interne mitochondriale, le transfert est rendu possible par l’ATP synthase. Cette force protomotrice représente l’intermédiaire énergétique qui est finalement utilisé par l’ATP synthase pour phosphoryler l’ADP en ATP. Ainsi, selon les principes de la théorie chimio-osmotique énoncée en 1961 par P. Mitchell31, la production d’énergie au niveau de la mitochondrie s’effectue grâce à un couplage entre la respiration et la synthèse d’ATP par l’intermédiaire du gradient électrochimique de protons.
Les cytopathies mitochondriales
Les cytopathies mitochondriales ont longtemps été appelées myopathies mitochondriales. Ce terme décrit un groupe hétérogène de désordres métaboliques qui sont caractérisés par des anomalies aussi bien de l’ultra-structure mitochondriale que du fonctionnement des OXPHOS (Figure 14)76.
Le terme de myopathie mitochondriale a été utilisé pour la première fois par R. Luft en 1962, chez un adulte qui présentait un hypermétabolisme non thyroïdien avec découplage permanent des OXPHOS et existence de mitochondries d’aspect anormal dans le muscle77,78.
Le terme a ensuite été employé de façon très large pour toutes sortes de tableaux cliniques ayant en commun l’existence d’altérations du nombre ou de l’aspect des mitochondries du muscle strié squelettique. Il a rapidement été étendu à des syndromes variés comportant des myopathies associées à d’autres signes neurologiques : syndrome de Leigh, maladie d’Alpers, MERRF (Myoclonus-Epilepsy-Ragged Red Fibers), MELAS (Mitochondrial-Encephalopathy-Lactic Acidosis-Stroke like episodes), syndrome de Kearns-Sayre, CPEO (Chronic-Progressive-External-Ophtalmoplegia), maladie de Leber (LHON).
Afin de distinguer les différents désordres du métabolisme oxydatif en fonction de leur étiologie, certains auteurs ont établi une classification biochimique des défauts conduisant à des cytopathies d’origine mitochondriale. Ainsi, il est possible de distinguer les atteintes au niveau du transport des substrats énergétiques, de leur transformation, de leur catabolisme dans le cycle de Krebs et de la production d’ATP par les OXPHOS. Ces atteintes fonctionnelles correspondent en fait à des défauts dans l’activité de certaines enzymes impliquées dans les voies métaboliques précitées. Par exemple, les atteintes au niveau du transport des substrats peuvent être dues à un défaut d’activité des carnitine-palmitoyl-transférases (CPT1 et CPT2) et celles au niveau de la transformation des substrats à un défaut de la pyruvate déshydrogénase. Des défauts d’activité de la fumarase ou de l’alpha-cétoglutarate déshydrogénase conduisent à une altération du catabolisme au niveau du cycle de Krebs et un défaut d’activité de la cytochrome c oxydase est généralement responsable d’une déficience de la production énergétique par les OXPHOS.
La deuxième façon de classer les cytopathies d’origine mitochondriale est de les regrouper en fonction de l’origine génétique du défaut qui les caractérise. En effet, plus de 200 mutations ponctuelles dans des ARNt ou des ARNr ainsi que sur des gènes codant des protéines, et des réarrangements comprenant des délétions, des insertions, des duplications, des triplications, des inversions et des déplétions de l’ADNmt sont aujourd’hui reconnus comme étant la cause de pathologies d’origine mitochondriale79. De plus, l’absence de mutation dans l’ADNmt chez des patients présentant un déficit au niveau de la cytochrome c oxydase80 ainsi que les mutations dans des gènes nucléaires impliqués dans l’import des peptides à l’intérieur de la mitochondrie, ou dans l’assemblage de certains complexes enzymatique ont permis de mettre l’accent sur de nouveaux mécanismes conduisant à des pathologies mitochondriales.
L’ensemble de ces données a été compilé par l’équipe de D. Wallace sur le site MITOMAP (http://www.mitomap.org), et a organisée la classification des mutations mitochondriales suivant deux entrées : le phénotype et le type de mutation.
Travaux de recherche : développement de nouveaux modèles ciblés sur le métabolisme énergétique mitochondrial
Caractérisation d’un modèle pour le syndrome de Leigh
Parmi la grande diversité de syndromes mitochondriaux, nous avons choisi de nous focaliser sur le syndrome de Leigh, une maladie neurologique progressive. Il existe déjà quelques modèles murins et cellulaires de ce syndrome, permettant d’étudier certains mécanismes de neuropathogénèse87,88. Comme dit précédemment, la mise au point de modèle murin par modification ciblée de l’ADNmt est difficile. Pour cela, nous avons étudié un modèle murin par intoxication chimique au MPTP (neurotoxine) qui permet d’observer une dégénérescence neurologique caractéristique de ce syndrome. Dans le cadre de ce projet, nous avons caractérisé biochimiquement les causes de cette neuro-dégénérescence.
Ce modèle murin a deux objectifs. Il permet d’une part, de provoquer et mimer les mêmes symptômes que ceux observés chez les patients sans remaniement de l’ADNmt et ce, en quelques heures de traitement. D’autre part, il permet d’étoffer nos connaissances sur les mécanismes d’inhibition des complexes OXPHOS menant à la dégénérescence neurologique et musculaire comme observée chez les patients.
Caractérisation d’un modèle d’haplogroupe de l’ADNmt
Le second projet de cette thèse est la mise au point d’un modèle cellulaire permettant l’étude des haplogroupes de l’ADNmt. Ce modèle fait appel à la technique des cybrides qui permet de placer un ADNmt d’intérêt dans une cellule dépourvue de cet ADN. Comme vu précédemment, il existe déjà des modèles cellulaires similaires cependant, ceux-ci ont été construits pour étudier des pathologies mitochondriales précises.
Pour construire notre modèle, nous sommes partis du postulat que les haplogroupes de l’ADNmt sont capables soit d’avoir un effet protecteur soit être un facteur de risque pour l’apparition de pathologie. Nous avons donc construit une collection de cybrides constituée des principaux haplogroupes européens (H, J, K, T) sur lesquels nous avons réalisé une caractérisation biochimique et phénotypique.
L’objectif de notre modèle est de rechercher si les haplogroupes de l’ADNmt sont neutres et peuvent influencer le métabolisme énergétique mitochondrial. Il permettra également de proposer une vision modulée des pathologies mitochondriales tant pour leur étude que pour leur diagnostic, en faisant ressortir la notion de médecine personnalisée.
Définition du syndrome de Leigh
Décrit pour la 1ère fois par D. Leigh chez un nourrisson atteint d’une neuropathie89, le syndrome de Leigh (OMIM : 256000), ou encéphalomyopathie nécrosante subaigüe, est une maladie neurologique progressive caractérisée par des lésions neuropathologiques impliquant une atteinte du tronc cérébral et des ganglions de la base90. Les critères diagnostiques de ce syndrome comprennent un ensemble de symptômes tels que des retards psychomoteurs, hypotonie (baisse du tonus musculaire), ataxie (trouble de la coordination), faiblesse, perte visuelle, anomalies des mouvements oculaires, convulsions, dysphagie (difficulté à avaler) et acidose lactique (augmentation du taux de lactate sanguin)87,. La maladie débute typiquement chez le nourrisson de moins d’un an ; l’apparition précoce des symptômes étant généralement associée à un critère pronostique défavorable91.
Atteintes neurologiques
Le syndrome de Leigh est défini par des lésions (tissus nécrotiques) du système nerveux central (SNC)87. Ces lésions peuvent être observées par IRM où l’on détecte fréquemment des taux élevés de lactate. Ce syndrome se caractérise essentiellement par l’implication du tronc cérébral et/ou des ganglions de la base. Dans quelques cas, le thalamus, le cervelet et la moelle épinière peuvent également être touchés. Les ganglions de la base du striatum et de la substance noire jouent un rôle clé dans la régulation des mouvements volontaires ainsi que dans le contrôle comportemental et les fonctions cognitives92. Lors du développement pré- et post-natal du cerveau, il a été montré que ces ganglions de la base représentent des structures vulnérables, impliquant une destruction partielle ou totale du réseau dopaminergique dans diverses affections infantiles comme certaines formes de maladies mitochondriales93. Cette vulnérabilité serait liée à un stress énergétique, montrant ici que l’altération de l’activité mitochondriale est une voie pathogène commune dans plusieurs maladies liées aux ganglions de la base (ex. syndrome de Leigh)94.
L’ensemble des neurones dopaminergiques (qui utilisent la dopamine comme neurotransmetteur) compose le réseau dopaminergique impliqué dans la libération de dopamine dans les systèmes nerveux centraux (dont la substance noire) et périphériques95 (Figure 14). La dopamine (C8H11NO2) est une monoamine issue de la tyrosine et est le neurotransmetteur majeur, de type catécholamine (i.e. substance sympathomimétique), du système nerveux central96,97. Les neurones dopaminergiques sont associés aux mouvements musculaires, la croissance des tissus, le fonctionnement du système immunitaire et interviennent dans la sécrétion de l’hormone de croissance. Il a été montré qu’une insuffisance de dopamine dans cette voie dopaminergique, comme retrouvé chez les patients atteints par la maladie de Parkinson, entraîne des symptômes extrapyramidaux (akinésie, hypertonie, tremblement au repos)98,99. A l’inverse, une forte activité favorise l’apparition de dyskinésies (mouvements involontaires non contrôlés et troubles comportementaux). La perte du réseau dopaminergique au niveau des ganglions de la base entraine une dégénérescence du tissu cérébral qui est la caractéristique pathologique du syndrome de Leigh.
Développement d’un modèle animal applicable au syndrome de Leigh 2.1. Mutants et inhibiteurs mitochondriaux
Afin d’étudier les mécanismes d’apparition et de développement d’une maladie mitochondriale, un modèle murin est indispensable. Ce modèle peut être obtenu de deux manières différentes : soit une mutation est introduite dans son ADNmt, soit l’animal est traité par un inhibiteur des OXPHOS. A ce jour, il est encore difficile de modifier une position précise de l’ADNmt. L’alternative est donc d’utiliser des inhibiteurs spécifiques des OXPHOS permettant, le temps du traitement, de mimer les effets d’une mutation de l’ADNmt. Cela provoquera un déficit d’activité d’un ou plusieurs complexes des OXPHOS afin d’obtenir un modèle murin présentant un phénotype spécifique.
Le modèle murin que nous avons utilisé dans l’étude présentée ci-après, a été construit en utilisant un inhibiteur mitochondrial, et plus précisément la neurotoxine 1-méthyle-4-phényl-1, 2, 3, 6-tétrahydropyridine (MPTP).
La neurotoxine MPTP
Le 1-méthyle-4-phényl-1, 2, 3, 6-tétrahydropyridine (MPTP) est une neurotoxine liposoluble, capable de traverser la barrière hémato-encéphalique (Figure 16). Une fois à l’intérieur du cerveau, le MPTP est métabolisé en une substance toxique, le 1-méthyl-4-phenylpyridinium (MPP+) par des monoamines oxydase (MAO) dans les cellules gliales101. Le MPP+ détruit principalement les neurones dopaminergiques dans une partie du cerveau nommée la substance noire. Le MPP+ est transféré dans les cellules dopaminergiques par des transporteurs spécifiques de la dopamine pour lesquels il a une forte affinité102,103. Dans la cellule, une partie du MPP+ est séquestré dans des vésicules par l’action de transporteurs vésiculaires monoaminés et une autre partie se diffuse dans la matrice mitochondriale. Le mode d’action du MPTP est assez complexe et est mal connu, mais son implication dans l’inhibition de la chaine respiratoire à être démontrée104. En effet, les 3 principaux complexes de la chaine respiratoire, les complexes I, III et IV, ont été reportés comme pouvant être inhibés soit par le MPTP soit par le MPP+, par effet direct sur les mitochondries ou les cellules isolées105,106, ou par traitement sur les cellules ou injection dans des primates105,68,107.
Bien qu’associé à la maladie de Parkinson108, le MPTP a récemment été utilisé dans un contexte de maladie mitochondriale. En effet, une étude a mis en évidence une dégénérescence des ganglions de la base associée à une diminution de densité des tyrosines hydroxylases et des transporteurs de dopamine dans le striatum de souris intoxiquées par le MPTP109. Dans cette même étude, il a été proposé que ces souris intoxiquées pourraient être un modèle potentiel pour le syndrome de Leigh, la dégénérescence des ganglions de la base étant une des caractéristiques pathologiques110. Cependant, la caractéristique biochimique du syndrome de Leigh est un déficit de la production d’énergie, qui dans certains cas, est dû à une inhibition d’un des complexes de la chaîne respiratoire (I, III ou IV), mais ce point n’a pas été développé durant cette étude. Ainsi, et afin de déterminer si le traitement par le MPTP pourrait être utilisé comme modèle pour le syndrome de Leigh, nous avons utilisé le même protocole d’intoxication aiguë au MPTP afin de collecter plusieurs types de tissus cérébraux (substance noire, striatum, cortex, cervelet) et de tissus périphériques (muscle, cœur, foie, rein). Par la suite, et sur chaque échantillon, nous avons déterminé l’effet de l’intoxication au MPTP sur les activités de chaque complexe de la chaîne respiratoire afin d’en conclure quant à sa capacité à induire un stress mitochondrial.
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Table des matières
La Mitochondrie
I. Origine, structure et rôles de la mitochondrie
1. Origine endosymbiotique des mitochondries
2. Structure et dynamique mitochondriales
2.1. Structuration des mitochondries
2.2. Modulation de la dynamique mitochondriale
3. Rôles de la mitochondrie au sein de la cellule
II. Génétique mitochondriale
1. Organisation de l’ADN mitochondrial humain
1.1. Structure de la molécule d’ADNmt
1.2. Distribution des molécules d’ADNmt
2. Réplication et expression de l’ADNmt
2.1. Nucléoïdes mitochondriaux
2.2. Réplication de l’ADNmt
2.3. Transcription de l’ADNmt
2.4. Protéines mitochondriales
2.5. Contrôle-Qualité mitochondrial
3. Phylogénie moléculaire et phylogéographie de l’ADNmt
3.1. Théorie de la coalescence
3.2. Hypothèse de l’horloge moléculaire
3.3. Haplotype, haplogroupe et nomenclature de l’ADNmt
3.4. Phylogéographie
III. Phosphorylations oxydatives
1. Chaine respiratoire mitochondriale
1.1. Complexe I : NADH-Ubiquinone oxydoréductase
1.2. Complexe II : Succynyl-CoQ oxydoréductase
1.3. Complexe III : CoQH2-Cytochrome c oxydoréductase
1.4. Complexe IV : Cytochrome c oxydase
2. ATP synthase
3. Théorie chimio-osmotique
IV. Les cytopathies mitochondriales
Problématique et objectifs du projet de thèse
I. Modèles pour les pathologies mitochondriales
II. Travaux de recherche : développement de nouveaux modèles ciblés sur le métabolisme énergétique mitochondrial
1. Caractérisation d’un modèle pour le syndrome de Leigh
2. Caractérisation d’un modèle d’haplogroupe de l’ADNmt Caractérisation de l’effet du MPTP sur la chaine respiratoire
I. Introduction
1. Le syndrome de Leigh
1.1. Définition du syndrome de Leigh
1.2. Atteintes neurologiques
1.3. Origine génétique du syndrome de Leigh
2. Développement d’un modèle animal applicable au syndrome de Leigh
2.1. Mutants et inhibiteurs mitochondriaux
2.2. La neurotoxine MPTP
3. Objectif de ce projet
II. Publication scientifique
III. Discussion
1. La fonction hépatique pourrait instaurer un environnement enrichi en MPP+
2. Le MPTP augmente la masse mitochondriale des tissus musculaires
3. Les terminaisons nerveuses du striatum sont plus sensibles à l’intoxication
4. L’inhibition du cervelet et le cortex est différente malgré des caractéristiques tissulaires similaires
5. Le modèle murin par intoxication au MPTP peut être utilisé comme modèle du syndrome de Leigh
Influence des haplogroupes de l’ADNmt sur la bioénergétique de la mitochondrie
1. Les haplogroupes peuvent-ils modifier le métabolisme mitochondrial ?
2. Hypothèse de la géolocalisation des haplogroupes
3. Modification des fonctions mitochondriales
4. Impacts sur l’expression de pathologies
4.1. Distribution des haplogroupes dans les pathologies
4.2. Le paradoxe J
5. Objectif du projet
IV. Matériels et méthodes
1. Choix des haplogroupes de l’ADNmt
1.1. Haplogroupes européens
1.2. Focus sur l’haplogroupe J
2. Source de l’ADNmt : les plaquettes
2.1. Préparation des échantillons de plaquettes
2.2. Extraction et quantification de l’ADN
2.3. Caractérisation des ADNmt issus des plaquettes
3. Elaboration des modèles cellulaires : les cybrides
3.1. Culture cellulaire : identification et conditions de culture
3.2. Elaboration des lignées de cybrides
4. Caractérisation phénotypique des cybrides
4.1. Courbe de croissance
5. Caractérisation biochimique des cybrides
5.1. Détermination de la concentration protéique et de la masse mitochondriale
5.2. Dosages de l’activité des complexes de la chaines respiratoire
6. Modélisation du métabolisme énergétique mitochondrial
6.1. Principes de base des cinétiques enzymatiques
6.2. Modèle cinétique des complexes OXPHOS
6.3. Détermination des paramètres cinétiques des complexes I et IV pour les cellules 143B et les cybrides
6.4. Estimation des paramètres cinétiques
6.5. Modélisation des OXPHOS
V. Résultats
1. Collection de cybrides
2. Courbe de croissance
3. Caractéristique biochimique
3.1. Détermination de la concentration protéique
3.2. Détermination de la masse mitochondriale
3.3. Détermination des paramètres cinétiques du complexe I
3.4. Détermination des paramètres cinétiques du complexe IV
4. Cybrides virtuels
4.1. Etude des paramètres essentiels des OXPHOS
4.2. Etude de la relation flux-force
4.3. Etude de l’effet de seuil
5. Etude préliminaire sur l’haplogroupe J : évaluation structurale de l’impact des polymorphismes m.T14798C et m.G15257A sur le complexe III
VI. Discussion
1. Création de la banque de plaquettes de différents haplogroupes de l’ADNmt
2. Création et culture des cybrides
3. Analyse des cybrides au niveau cellulaire
4. Analyses biochimiques des cybrides : détermination des paramètres cinétiques des complexes I et IV de la chaine respiratoire.
5. Construction des cybrides virtuels et analyse théorique des propriétés de leur métabolisme énergétique mitochondrial (OXPHOS)
6. Utilisation des cybrides virtuels
7. Analyse structurelle in silico
VII. Perspectives
Conclusion Générale
Listes
Annexes
Références bibliographiques
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