Glycolipides fluorescents et gouttelettes glycosylées

Lectines et multivalence

Les lectines

Les lectines ont été décrites comme des protéines d’origine non-immune qui se lient spécifiquement et de façon totalement réversible aux sucres sans avoir aucune activité enzymatique [1]. Les lectines sont des macromolécules que l’on retrouve dans tous les organismes : microorganismes (virus, bactéries), plantes, insectes et animaux supérieurs. Elles peuvent être parfois appelées agglutinines car elles sont capables d’agglutiner les cellules (comme les globules rouges) via les glycoconjugués de surface. Cette caractéristique des lectines est due au fait que ces protéines sont multivalentes. Elles sont ainsi impliquées dans de nombreux processus d’adhésion entre cellules animales ou entre microorganisme et cellules animales [2,3].

Les anciennes méthodes utilisées pour les identifier consistaient à mélanger un extrait (ex : d’un tissu ou d’une plante) avec des érythrocytes en solution. Si une agglutination ou une précipitation des cellules étaient observées cela signifiait que l’échantillon contient une ou des molécules agglutinantes. Les premières lectines ont été identifiés chez les plantes, la toute première lectine isolée étant la ricine dans le travail de thèse de Peter Hermann Stillmark 1888 Tartu, Estonie mais un véritable intérêt n’y sera porté qu’à partir des années soixante, en même temps que le développement de la glycobiologie. L’intérêt d’utiliser ces lectines est la détection, l’isolement et la caractérisation d’oligosaccharides, comme la détermination des groupes sanguins et la caractérisation de glycoconjugués. Maintenant, les lectines sont considérées comme des molécules bioactives et de nombreux groupes se sont intéressés aux rôles biologiques de ces molécules [4–6].

Les lectines sont en fait des récepteurs spécifiques (Tableau 1) pour les interactions protéinesucre qui jouent des rôles importants ou indispensables dans les processus de reconnaissance et de signalisation cellulaire. Par exemple, l’hémagglutinine du virus de la grippe reconnaît et se lie spécifiquement aux oligosaccharides terminés par un acide sialique situés sur les cellules épithéliales des voies aériennes [7]. De même, les lectines situées sur les bactéries, et les virus reconnaissent les glycoconjugués présents sur la surface des cellules épithéliales et donc permettent les processus de colonisation et d’infection.

Les cellules dendritiques et la lectine DC-SIGN

Les cellules dendritiques 

La réponse immunitaire spécifique est différente de la réponse immunitaire innée car elle est spécifique d’un antigène. Les principales cellules impliquées dans cette réponse sont les cellules présentatrices d’antigènes (CPA) et les lymphocytes qui sont activés par la reconnaissance de l’antigène. Trois types de cellules ont des propriétés de présentation de l’antigène: les cellules dendritiques, les macrophages et les lymphocytes B. Cependant, les cellules dendritiques sont les plus efficaces et elles sont appelées cellules présentatrices professionnelles. Ce sont les seules capables de stimuler des lymphocytes T naïfs. Les cellules dendritiques représentent une population hétérogène de cellules ayant comme origine des précurseurs médullaires. Il existe deux grands sous-types : les cellules dendritiques myéloïdes (mDC) et les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC). Les cellules dendritiques ont pour rôles de capturer, le transporter, apprêter et la présenter des antigènes aux lymphocytes T. Elles sont présentes dans tout l’organisme, peuvent migrer, et de ce fait elles se déplacent du site où elles ont capturé des antigènes vers les sites d’interactions cellulaires. Les cellules dendritiques ont la capacité de déclencher une réponse immunitaire, qui est la réponse immunitaire adaptative. Les cellules dendritiques représentent d’ailleurs le lien entre l’immunité innée et l’immunité spécifique adaptative.

DC-SIGN

L’efficacité des cellules dendritiques à déclencher une réponse immunitaire est due à la grande diversité des récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires exprimés à leur surface. Hormis les récepteurs de type Toll, les cellules dendritiques possèdent des lectines de type C (CLRs) dédiées spécifiquement à la reconnaissance de pathogènes ayant des motifs glycosylés. Parmi eux, DC-SIGN (Dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin) a attiré beaucoup d’attention durant la décennie passée pour son rôle dans les infections HIV mais aussi dans la réponse antivirale [8,9]. DC-SIGN, est une protéine transmembranaire de type II de 44kDa comportant 404 acides aminés, organisée en domaines et distribuée aléatoirement sur la surface des cellules dendritiques. DC SIGN est composée de trois parties (Figure 1) : un domaine extracellulaire, une région transmembranaire et une région cytoplasmique. Le domaine extracellulaire est divisé en deux domaines : un domaine de reconnaissance de sucre (CRD) et le domaine Neck.

Le CRD de DC-SIGN dispose d’une structure globulaire et est composée de 2 hélices alpha, 12 feuillets beta, et 3 ponts disulfures (Figure 2) [11]. Une boucle dépasse de la surface de la protéine et participe à la formation des 2 sites de fixation au Ca2+. Le premier site est responsable du maintien de la structure du CRD et le second est responsable de l’interaction avec les structures glycosylées, c’est ce site qui permet la spécificité de la reconnaissance de DC-SIGN pour les groupes mannosylés (Man), N-acétylglucosamines (GlcNAc), glucosylés (Glc) et L-fucosylés (Fuc) [11].

DC-SIGN est exclusivement exprimé par les cellules dendritiques interstitielles immatures et matures [12]. Elle n’est pas exprimée sur les monocytes, les lymphocytes T, lymphocytes B, et les cellules de la moelle osseuse. L’affinité pour un résidu mannose de DC-SIGN est faible (le Kd est de l’ordre de 2 mM) [13]. Cependant l’oligomérisation de la lectine en tétramère et les ligands hautement glycosylés permettent d’avoir une avidité plus importante (Kd de l’ordre du nM). La multivalence est donc nécessaire dans la reconnaissance des ligands.

Concanavaline A 

La concanavaline A (Figure 3) va nous servir de premier modèle, c’est une lectine accessible commercialement et particulièrement étudiée. Comme DC-Sign, la ConA est un homotétramère : chaque sous-unité (de 26.5KDa, 237 amino-acides, fortement glycosylée) lie deux atomes, un Ca2+ et un métal de transition (Mn2+). Sa structure tertiaire a été élucidée, et l’on connait bien les bases moléculaires de ses interactions avec les métaux qui la composent, et de son affinité pour le mannose et le glucose.

Peanut agglutinin (PNA) ou lectine d’arachide

La PNA (Figure 4) va nous servir de second exemple de lectine, c’est une lectine à beta-Dgalactose qui ne reconnaît pas l’alpha D-galactose, ni le mannose. La PNA est une lectine tétramérique (100 kDa) constituée de quatre protomères identiques (25 kDa) associés par des liaisons faibles mais en nombre suffisant pour assurer la cohésion de l’édifice moléculaire. Chaque protomère possède un site de reconnaissance des glycanes : c’est une lectine tétravalente (à quatre possibilités de liaison aux glycanes) [15]. Cette lectine tétramérique aussi est aussi beaucoup étudiée en particulier pour son utilisation sur des asialo protéines portant la séquence terminale Gal-β(1-3)-GalNAc [16].

Multivalence

La reconnaissance spécifique de saccharides par des protéines est essentielle à la régulation de l’activité cellulaire telle que l’endocytose [17]. Comme vu précédemment dans le cas de DC-Sign, cette interaction est faible (Kd @ 1 mM) [13]. mais cette faible interaction est améliorée par des interactions multivalentes [18].

Les interactions entre récepteurs et ligands multivalents résultent en une augmentation de l’affinité. Cette augmentation d’affinité est un effet multivalent si l’affinité pour un système comportant X unités est au moins X fois supérieure à celle du ligand monovalent. De façon intuitive on pourrait penser que l’affinité est la somme des contributions individuelles de chaque ligand monovalent. Cependant la réalité est tout autre. La multivalence met en jeu des interactions simultanées entre ligands et récepteurs tous deux multivalents [19].

Effet de la concentration

Le concept de concentration effective (Ceff) a été proposé pour expliquer l’effet chélate de complexes métalliques observé. Il n’a été appliqué aux interactions multivalentes que plus tard. [21–23] L’effet de concentration fait la différence entre les interactions inter- et intramoléculaires et tient compte de la proximité ligands/récepteurs dans l’interaction de deux entités multivalentes. La molarité effective est le terme plus général utilisé, représentant le ratio des constantes d’association des processus intra- sur intermoléculaire [24]. La première interaction entre les deux entités est forcément intermoléculaire. La deuxième interaction est soit intermoléculaire avec un autre ligand soit intramoléculaire avec le second épitope. Suivant l’espaceur entre les deux épitopes, la concentration locale autour du récepteur, c’est-à-dire la concentration effective, peut être plus importante que la concentration globale de la solution (Csol). Cependant cette explication même si elle est intuitive ne tient pas compte de l’espaceur. Depuis la mise au point de Whitesides [20], on sait que la rigidité de l’espaceur est un point clé (si c’est un polymère c’est la longueur de persistance) : un lien rigide ou les deux ligands sont déjà bloqués à la bonne distance est le plus favorable. Un espaceur trop long ou trop court créer une tension defavorable (Figure 5).

Structures glycosylées multivalentes

Historique sur les particules pour la vectorisation

Il existe trois générations de particules. La première génération correspond à des nanoparticules stables emprisonnant des molécules actives, le but recherché étant de limiter leur élimination par le corps. Un exemple est le liposome, qui est une nanoparticule limitée par une bicouche lipidique. Même si ces particules sont à une échelle microscopique cela n’est pas suffisant pour permettre rester longtemps dans le milieu sanguin. Elles sont généralement considérées comme étant étrangers par notre corps, elles sont alors reconnues par les défenses immunitaires (par des opsonines) qui les éliminent. Dans le but d’augmenter leur durée de vie dans le circuit sanguin afin d’atteindre la zone ciblée, la surface des nanoparticules a été fonctionnalisée pour obtenir des nanoparticules dites « furtives », elles constituent la seconde génération. Les « éléments » de furtivité, permettent d’avoir une couche protectrice qui diminue la probabilité de la fixation des opsonines (substance qui se lie à des antigènes et induit leur phagocytose) et permet ainsi d’échapper aux cellules du système immunitaire [28,29]. Le PEG (polyéthylène glycol) est probablement le plus utilisé à cet effet car il est entre autre biocompatible, non toxique et faiblement immunogène, de plus, son injection à l’homme est approuvée par l’ANSM (Agence Française de Sécurité Sanitaire Produits de Santé) et par la FDA (Food and Drug Administration). Afin de pouvoir cibler précisément un tissu, des nanoparticules de troisième génération, dites « furtives et ciblantes », ont été fabriquées. Ces nanoparticules ont vu leur surface fonctionnalisée par des ligands biologiques reconnus de façon spécifique par les cellules visées. Les ligands pouvant être utilisés sur les nanoparticules sont variés : anticorps [30], peptides [31], des oligonucléotides [32] ou des saccharides [33,34].

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Table des matières

Introduction
Chapitre 1 : Introduction et état de l’art
I. Lectines et multivalence
A. Les lectines
B. Multivalence
II. Structures glycosylées multivalentes
A. Historique sur les particules pour la vectorisation
B. Structures glycosylées multivalentes
III. Un autre type de particules à interface fluide : les émulsions
A. Généralités sur les émulsions
B. Tensioactifs : structure et classification
C. Fabrication et stabilité des émulsions
D. Tension interfaciale : définition et mesure
IV. Emulsions : état de l’art sur leur utilisation en pharmaceutique et biophysique
A. Administration de principes actifs avec des émulsions
B. Les émulsions fonctionnalisées comme un outil biophysique
V. Objectifs du travail de doctorat
Chapitre 2 : Conception et synthèse des glycolipides
I. Le choix des structures initiales
A. Le choix des sucres
B. Le choix des fluorophores
II. Synthèse des Monobrins
A. Synthèse des fluorophores
B. Synthèse des glycolipides α-D-mannosides
C. Synthèse du glycolipide β-D-galactoside
D. Synthèse du glycolipide galactitol
III. Évolution de la structure de base : un raft de glycolipide
A. Choix de la structure
B. Synthèse du raft
IV. Synthèses de composés d’intérêts non abouties
A. Synthèse d’un glycolipide monochaîne avec un espaceur PEG
B. Synthèse d’un glycolipide portant un dimannoside
Chapitre 3 : Fonctionnalisation des gouttes par les glycolipides
I. Caractéristique physico chimique
A. Fluorescence
B. Détermination de la CMC des glycolipides par les isothermes de Gibbs
II. Préparation des gouttes d’émulsions fonctionnalisées
A. Choix des matériaux utilisés
B. Fabrication d’émulsions polydisperses au mortier
III. Mise en contact avec des lectines solubles
A. Optimisation des conditions expérimentales
B. Études sur la spécificité de la reconnaissance des gouttes par les lectines
Chapitre 4 : Préparation des sondes pH et propriétés
I. Des sondes fluorescentes déjà disponibles
A. BCECF un fluorophore pH sensible très largement utilisé
B. Le phénol : détecteur du pH
II. Le choix des sondes pH
A. Sonde DCNQ
B. Sonde hydroxynaphtalimide
Conclusion

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