Soutenance mémoire
Gestion des animaux
Principe et techniques de cryopréservation
Principe
La congélation L’objectif est d’atteindre la température de – 196°C dans de l’azote liquide. A cette température la plupart des réactions chimiques sont inhibées et l’activité métabolique cellulaire est suspendue (Mandelbaum, 1999). Seules les radiations terrestres et des virus pourraient perturber une conservation illimitée (Shaw, 2000). Cependant la descente de température produit de nombreux effets délétères sur les cellules de l’embryon. En effet, le comportement de l’eau libre intra et extra cellulaire au cours des changements de phase est responsable de phénomènes physico-chimiques remarquables. La congélation se fait au cours d’une descente en température jusqu’à un point où il y a transformation de l’eau libre en cristaux de glace. Pour les cellules embryonnaires, cette réaction exothermique se fait à une température dite de surfusion, inférieure à celle du point de congélation de l’eau pure. Les cristaux se forment de façon extracellulaire dans un premier temps (Fahy, 1995). La membrane cellulaire empêcherait la croissance des cristaux extracellulaires dans la cellule (Mazur, 1970). La pression de vapeur étant plus élevée à l’intérieur (eau en surfusion toujours liquide par rapport au milieu extracellulaire), les cellules s’équilibrent en se déshydratant progressivement. Mais si la diminution de température est trop rapide, cette équilibration des pressions se fait par formation de cristaux de glace intracellulaires (Mazur, 1970). Ces cristaux cellulaires engendrent des dommages mécaniques au niveau de la membrane plasmique (Seidel, 1996). Suite à la formation des différents cristaux, il y a moins d’eau libre, les solutés se concentrent et peuvent précipiter. Cela conduit à des variations de pH et de concentration des sels dissous ; c’est ce qui est appelé l’effet solution. Cet effet solution est une seconde cause de dommages cellulaires dont l’origine est soumise à hypothèses et concerne la membrane cellulaire (Mazur, 1970). Il existe un autre effet néfaste au cours de la chute de température : la déshydratation des cellules embryonnaires. Elle suit les lois de l’osmose et qui, si elle dépasse 60%, produit des lésions irréversibles du cytosquelette et la mort cellulaire (Mandelbaum, 1999). Face à ces contraintes de descente en température, plusieurs solutions sont envisageables : – contrôler la cinétique de refroidissement : Il existe un point critique de la vitesse de refroidissement quant au pourcentage de survie des cellules congelées qui dépend du type de cellules congelées et du cryoprotecteur ajouté (Mazur, 1985). Les cellules refroidies trop rapidement n’ont pas le temps de se déshydrater pour éviter la formation de cristaux de glace intracellulaires. Mais pour les cellules refroidies trop lentement les concentrations des sels (et du cryoprotecteur) deviennent élevées et toxiques (effet solution pour les sels). Il est donc nécessaire de trouver une courbe de refroidissement adaptée. – réaliser une protection physico-chimique : L’ajout de certaines molécules dites cryoprotectrices peut abaisser le point de congélation des solutions, réduire l’effet solution et limiter la vitesse de croissance des cristaux de glace (Mandelbaum, 1999). Des cryoprotecteurs perméables sont très utilisés comme le glycérol, le diméthyl sulfoxide, le propanediol ou l’éthylène glycol. Il existe aussi des molécules qui ne pénètrent pas dans les cellules comme des molécules de sucre (sucrose, galactose…) ou des protéines et lipoprotéines. Elles agissent surtout sur l’établissement d’équilibres osmotiques et la réduction des cristaux de glace, moins traumatisants. D’autres molécules peuvent être employées pour potentialiser les effets des premiers cryoprotecteurs tels que les AFP (antifreezing proteins) (Lagneaux et al., 1997), la glutamine (Lagneaux et al., 2000) ou des molécules non perméables de poids moléculaires importants (polyvinylpyrolidone, dextran, composants protéiques du sérum…). – contrôler le volume cellulaire : Au cours de la congélation, la pression osmotique extracellulaire augmente et les cellules se déshydratent : leur volume se réduit donc. De plus, lorsque l’embryon est placé dans la solution de cryoprotection, il subit un choc osmotique avec un flux d’eau vers le milieu extracellulaire. La cellule se déshydrate et il se produit en retour un appel d’eau lié au cryoprotecteur qui a pénétré les cellules. Lors de cette phase de rééquilibration, le volume des cellules, après avoir diminué, tend à retrouver son état initial sans y parvenir complétement (Hochi et al., 1994). Afin de minimiser ces variations de volume qui pourraient être néfastes au développement embryonnaire, après transfert (Huhtinen et al., 1997), il faut premièrement contrôler la cinétique. Deuxièmement, on peut jouer sur l’ajout progressif de cryoprotecteur (voir paragraphe 2.5.2). Ensuite, les cryoprotecteurs extracellulaires trouvent ici leur importance en contrebalançant l’appel d’eau intracellulaire des cryoprotecteurs intracellulaires. – induire la cristallisation (« seeding »): En induisant la formation des premiers cristaux de glace à –7°C, on évite la surfusion des cellules embryonnaires qui entrainerait une cristallisation à des températues de –15°C (Shaw, 2000). Cette cristallisation spontanée à – 15 °C conduirait à la formation de gros cristaux intra et extra cellulaires néfastes à la survie des cellules (Seidel, 1996). Le « seeding » se pratique le plus souvent manuellement en plaçant des pinces refroidies à l’azote liquide sur la paroi externe de la paillette qui contient l’embryon, loin de celui-ci. On induit ainsi la formation d’un premier cristal de glace loin de l’embryon et on enclenche la déshydratation des cellules afin d’éviter la formation de gros cristaux de glace intracellulaires. Le «seeding » permet aussi d’évacuer plus progressivement la chaleur latente de la cristallisation exothermique (Shaw, 2000).
La décongélation La phase de décongélation présente aussi des risques, notamment une recristallisation. Ce phénomène de recristallisation débute lors de la montée en température à partir de –120°C: de nouveaux cristaux de glace apparaissent et les anciens vont croître (Shaw, 2000). Cette recristallisation est importante s’il reste beaucoup d’eau intracellulaire (refroidissement rapide) ; il faut alors réchauffer plus rapidement. Au contraire, lors d’un refroidissement lent, les cellules se sont déshydratées suffisamment pour minimiser cet effet de recristallisation (Mazur, 1985). Il est donc nécessaire d’adapter le programme de décongélation à celui de congélation. Le choc osmotique est un deuxième risque survenant à la décongélation : si celle-ci se fait trop rapidement au niveau extracellulaire, les solutés intracellulaires n’ayant pas le temps de sortir, l’eau extracellulaire rentre et peut provoquer l’explosion de la cellule (Mazur, 1985). La loi de l’équilibre osmotique intervient aussi lors du retour des cellules dans un milieu physiologique hypotonique afin de retirer le ou les cryoprotecteurs pénétrants. Les cellules contenant du cryoprotecteurs ont tendance à gonfler et peuvent se lyser. Il faut empêcher cet afflux d’eau intracellulaire en diminuant progressivement la concentration extracellulaire. On peut alors jouer soit sur une concentration décroissante en cryoprotecteur, soit sur l’ajout d’une molécule non pénétrante qui attire l’eau vers le milieu extracellulaire pour contrebalancer son entrée (Seidel, 1996). La combinaison d’une concentration décroissante en glycérol et en sucrose lors du retrait du cryoprotecteur semble réduire le nombre de cellules mortes après cryoconservation (Huhtinen et al., 1997).
Protocoles On peut distinguer trois types de protocoles de congélation et décongélation (Figure 1). Les deux étapes sont indissociables car la décongélation dépendra du mode de congélation. 2.3.2.1 La congélation lente Cette congélation classique est dite « équilibrée ». Les embryons sont exposés à des concentrations croissantes d’un cryoprotecteur jusqu’à atteindre l’équilibre des concentrations de cryoprotecteur intra et extracellulaire. Parallèlement les cellules se déshydratent progressivement évitant la future formation de cristaux de glace intracellulaire. La descente en température est de 1 à 3°C par minute, en partant de la température ambiante jusqu’à –7°C où la cristallisation est induite par « seeding ». On ne descend ensuite que de 0.1 à 0.3°C par minute jusqu’à –30°C où l’embryon est alors plongé dans l’azote liquide. La décongélation se fait généralement dans un bain marie de 37°C puis on retire progressivent le cryoprotecteur avec différents bains. C’est un procédé qui est simple et où le cryoprotecteur avec de faibles concentrations est peu toxique. Son inconvénient majeur est sa lenteur. Elle est utilisée pour les embryons ovins, bovins, caprins et équins. 2.3.2.2 La congélation rapide On parle désormais de congélation « non équilibrée ». Ses principes sont de fortes concentrations de cryoprotecteurs (souvent un mélange), pour déshydrater rapidement les cellules, et des vitesses de refroidissement rapides (2500°C par minute). En général, le temps d’équilibration est court. L’embryon, partiellement déshydraté, est refroidi rapidement et plongé dans l’azote liquide. Des cristaux de glace intracellulaires peuvent alors se former (à la congélation ou à la décongélation) et il est nécessaire d’avoir une vitesse de décongélation rapide pour éviter de détériorer l’embryon. La solution cryoprotectrice est alors enlevée en une seule étape le plus souvent. C’est une méthode qui n’est pas employée pour la cryoconservation des embryons équins. 2.3.2.3 La vitrification Les principes sont les mêmes que pour la congélation rapide cependant aucun cristal de glace ne se forme au cours des procédures de congélation-décongélation (Figure 1). Cela se produit pour des concentrations de cryoprotecteurs élevées (supérieures à 40%, Shaw, 2000). Lors du passage de la température ambiante à –196°C, l’eau libre et les solutés dissous forment une phase vitreuse (Mandelbaum, 1999).
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Guide du mémoire de fin d’études avec la catégorie Utilisation d’adjuvants au cryoprotecteur |
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Table des matières
Remerciements
Table des illustrations
Liste des abréviations
1 Introduction
2 Introduction au sujet et présentation de la question
2.1 Avantages et intérêts du transfert d’embryons cryopréservés
2.2 Historique et données chiffrées
2.3 Principe et techniques de cryopréservation
2.3.1 Principe
2.3.2 Protocoles
2.4 Les limites de la congélation des embryons équin
2.5 Les points de recherche actuels sur la cryoconservation des embryons équins
2.5.1 En amont de la congélation
2.5.2 Congélation et décongélation au sens strict
2.6 Présentation de l’étude expérimentale
3 Matériel et méthode
3.1 Gestion des animaux
3.1.1 Les ponettes donneuses et receveuses
3.1.2 Maîtrise artificielle des cycles
3.1.3 Les échographies
3.1.4 Calendrier des interventions
3.1.5 Les inséminations
3.2 Collecte des embryons
3.2.1 Age des embryons collectés
3.2.2 Matériel
3.2.3 Méthode
3.2.4 Préparation de l’embryon : recherche et lavage
3.3 La congélation
3.3.1 Groupes expérimentaux et incorporation du cryoprotecteur
3.3.2 Montage de l’embryon dans une paillette
3.3.3 Le processus de congélation stricte
3.3.4 Répartition des paillettes dans le canister d’azote liquide
3.4 Le transfert dans les receveuses
3.4.1 Décongélation
3.4.2 Transfert chirurgical
3.5 Suivi du transfert embryonnaire
3.5.1 Diagnostic de gestation
3.5.2 Collecte embryonnaire
3.5.3 Test de filiation
3.5.4 Evaluation des embryons
3.6 Analyse des résultats
4 Résultats
4.1 Bilan de la collecte des donneuses
4.2 Perte et élimination des embryons au cours de l’étude
4.3 Etude des variations du volume externe
4.4 Etude des variations du volume interne
4.5 Etude de l’évolution des notes morphologiques
4.6 Etude des taux de gestation
4.7 Taux de gestation comparés entre les lots témoin et direct
4.8 Corrélation de la note morphologique à la décongélation et de la viabilité in vivo (diagnostic de gestation positif à J11)
5 Discussion
5.1 Collecte des embryons
5.2 Le choix du transfert chirurgical
5.2.1 Choix d’un transfert chirurgical sur les ponettes
5.2.2 Choix d’un transfert multiple
5.3 Le diagnostic de gestation à J11 : une évaluation in vivo de la cryopréservation des embryons
5.4 Le volume : un indicateur des flux de cryoprotecteurs
5.5 Score morphologique : une bonne évaluation de la viabilité in vivo ?
5.6 Méthode d’ajout du cryoprotecteur
5.6.1 Intérêt de l’ajout direct du cryoprotecteur
5.6.2 Temps de contact avec le cryoprotecteur : un paramètre à définir
5.6.3 Utilisation d’adjuvants au cryoprotecteur
6 Conclusion
7 Bibliographie
Annexes
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