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Epidémiologie du cancer du col utérin
Dans le monde Le cancer du col utérin représente 10 % des cancers féminins avec une incidence mondiale évaluée à environ 500 000 cas par an dont 80% dans les pays en voix développement. Selon l‟OMS, si aucune action préventive n‟est programmée, les décès par cancer devraient augmenter de 25% au cours des dix prochaines années dans ces mêmes pays [rapport-gratuit.com]. L‟incidence varie considérablement en fonction de la région géographique ainsi les taux les plus élevés sont observés dans le Sud de l‟Afrique, en Amérique Centrale, en Amérique du Sud et en Inde ; les plus faibles en Amérique du Nord, en Australie, au Moyen Orient et dans certains pays d‟Europe comme l‟Espagne, l‟Italie et l‟Angleterre [13]. L‟incidence du cancer du col varie également en fonction du facteur socio-économique des pays (figure1). Dans les pays en développement où les infrastructures de prévention et le personnel qualifié font défaut, 83% des cas de cancer sont diagnostiqués à des stades très avancés devenant ainsi le premier cancer chez la femme dans ces régions en termes de mortalité.
En Afrique De fortes incidences sont observées en Afrique avec des taux supérieurs à 50 pour 100 000 habitants et des taux de mortalité standardisés sur l‟âge dépassant parfois 40 pour 100 000 habitants . En 2002 ; 72 000 nouveaux cas ont été enregistrés et 56 000 femmes sont mortes du cancer du col de l‟utérus en Afrique subsaharienne [14]. En Afrique, l‟incidence standardisée sur l‟âge est estimée à 29,3 pour 100.000 habitants par an et varie considérablement entre les régions: 42,7 en Afrique de l‟Est (la plus haute incidence dans le monde), 38,2 en Afrique de Sud, 29,3 en Afrique de l‟Ouest, 28 en Afrique du Centre et 12,1 en Afrique du Nord.
Au Mali Les dernières études réalisées montrent que le cancer du col utérin vient en première position des cancers féminins et en troisième position pour tous les cancers avec une fréquence de 27,2% au Mali [16,17].
Rappel anatomique et histologique du col de l’utérus
Le col utérin de forme cylindrique ou conique, correspond à la portion basse de l‟utérus, et mesure 3 à 4 cm de long pour 2,5 à 3,5 de diamètre. Ses dimensions etsa forme varient en fonction de l‟âge de la femme, de sa parité et de son statut hormonal. Un canal endocervical traverse le col et met en relation la cavité utérine avec le vagin s‟étendant de l‟orifice interne à l‟orifice externe. La moitié inférieure du col désignée sous le nom de portion intra-vaginale comprend une muqueuse exo-cervicale et une muqueuse endocervicale contiguës sur une ligne appelée zone de jonction pavimento-cylindrique (JPC) correspondant au point de départ des lésions (Figure 3). En dessous de ces deux muqueuses existent des tissus conjonctifs à composante musculaire dominante [19,20]. L‟exocol et l‟endocol sont respectivement tapissés par l‟épithélium pavimenteux pluristratifié non kératinisé (ou malpighien) et épithélium cylindrique uni-stratifié (ou glandulaire) [20] (Figure 3).
Classification des lésions précancéreuses du col
Le cancer invasif épidermoïde du col de l‟utérus est précédé par de lésions précancéreuses, le plus souvent asymptomatiques. Diverses classifications ont été proposées pour les caractériser. L‟OMS en 1968, distingue différents grades : dysplasie légère, modérée et sévère ou carcinome in situ, alors que Richart en 1973 propose une classification cytologique et histologique en terme de néoplasies cervicales intraépithéliales (CIN) en 3 grades selon la sévérité des lésions : CIN1, CIN2 et CIN3. Par rapport à un épithélium normal, une CIN comporte des perturbations architecturales de l‟épithélium et une prolifération des cellules atypiques plus ou moins différenciées. La classification cytologique de Bethesda quant à elle propose deux groupes pathologiques : les lésions de bas grade ou LSIL (Low Squamous Intraepithelial Lesion), regroupant les condylomes et CIN1; et les lésions de haut grade ou HSIL (High Squamous Intraepithelial Lesion), correspondant à la CIN 2 et à la CIN3 [22]. Cette classification proposée initialement pour la cytologie, est aussi couramment employée pour le diagnostic histologique. Dans cette dernière, constamment réactualisée, a été introduit en 2001 le frottis ASCUS (Atypy Squamous Cell Undetermined Signifiance) correspondant à des frottis ambigu, de signification indéterminée.
Taxonomie des papillomavirus
A l‟origine regroupés dans la famille des Papovaviridae les papillomavirus forment aujourd‟hui la famille des Papillomaviridae, comportant de très nombreux virus infectant diverses espèces de mammifères et d‟oiseaux de manière spécifique. Ce sont les Human Papilloma Virus (Virus Papillome Humain) « HPV» qui ont été les plus étudiés et plus de 200 types d‟HPV sont recensés actuellement dont environ 80 génotypes séquencés [46]. Le gène L1, codant la protéine majeure de capside est le plus conservé chez les différents génomes de papillomavirus. Donc, c‟est en fonction des homologies desséquences de ce gène et des analyses phylogénétiques que leur classification a été établie. Ainsi les papillomavirus sont subdivisés en 16 genres (nommés alpha à pi avec moins de 60 % d‟identité) dont 5 correspondant aux HPV (Figure 6); ces genres sont subdivisés en espèces (60 à 70 % d‟identité) désignée par un chiffre arabe. Chaque espèce comprend différents types (71 à 89 % d‟identité), au seind‟un même type, les sous-types partagent 90% à 98% d‟identité et les variants ont des différences d‟identité inférieures à 2% dans leur séquence L1 et inférieures à 5% dans des régions moins conservées [47]. Les variants, décrits essentiellement pour les HPV16 permettent de distinguer 5 branches phylogéniques distinctes selon leur degré d‟homologie et leur origine géographique :
E (Europe) : Variants retrouvés dans le monde entier (principalement en Europe et en Amérique)
As (Asie) : Variants retrouvés principalement en Asie du Sud-Est
Af1 (Afrique1) et Af2 (Afrique2) : Ils sont retrouvés principalement en Afrique
AA (Asie-Amerique) : Variants principalement retrouvés en Espagne, en Amérique centrale et du Sud.
Les différents types d‟HPV peuvent être classés aussi selon leur tropisme tissulaire qui est soit cutané ou muqueux (muqueuses ano-génitales, sphère oro-pharyngée). Les HPV à tropisme muqueux se caractérisent également par leur pouvoir oncogène et on distingue les types à bas risque oncogène et ceux à haut risque oncogène [48].
Mécanismes moléculaires d’induction de la carcinogenèse du col par les HPV
Comme tout virus, les HPV dépendent de la machinerie cellulaire pour la réplication et l‟expression de leur génome, mais les particules virales ne sont produites que dans des cellules épithéliales en cours de différenciation donc présentant des activités de synthèse génomique et de prolifération réduites. Le potentiel oncogénique acquis par les HPV-HR dérive clairement de cette stratégie complexe de maintenance dans un contexte cellulaire hostile [54].
Dérégulation de la prolifération cellulaire
La protéine E7 des HPV-HR est capable d‟interagir avec les protéines p105Rb,p107 et p130 avec une très grande affinité et induire leur dégradation via le protéasome et séquestration aboutissant à la dissociation du complexe pRb/E2F. En effet, ces protéines régulent le cycle cellulaire en interagissant avec le facteur de transcription hétérodimérique E2F/DP. Ainsi la dégradation de la pRb libère le complexe E2F/DP qui stimule l‟entrée en phase S du cycle cellulaire. Laprotéine E7 est capable aussi d‟activer les complexes cyclines (E/CDK2, A/CDK2) et d‟inactiver leurs inhibiteurs permettant ainsi le franchissement de la transition G1/S et la progression en phase S de manière continue. Enfin, la protéine E7 d‟HPV 16 peut s‟associer aux co-activateurs transcriptionnels p300, CBP (CREB binding protein) et p/CAF (facteur associé à p300/CBP). Ces facteurs participent à l‟activation de la transcription médiée par E2F, et leur association avec la protéine E7 conduit à une prolifération aberrante. L‟effet de la protéine E7 est renforcé par la protéine E6. En effet, suite au stress causé par la réactivation aberrante de la réplication de l‟ADN, la cellule tente d‟activer l‟apoptose via l‟induction de la protéine p53. Cependant, la protéine E6 des HPV-HR possède la capacité de lier p53 et d‟entraîner sa dégradation par le protéasome. Ainsi, la division cellulaire ne sera pas inhibée car l‟expression des protéines cibles de p53 impliquées dans l‟arrêt du cycle en G1ou dans l‟apoptose n‟est pas induite. Indépendamment de la protéine E7, la protéine E6 joue aussi un rôle dans la prolifération cellulaire via son domaine de liaison aux protéines à domaine PDZ.
Échappement des HPV-HR au système immunitaire
En plus du caractère de mauvais site inducteur et effecteur des réponses immunes du tractus génital féminin de nombreux mécanismes d‟échappement des HPV sont identifiables, à différentes étapes de la réponse immunitaire, probablement liés entre autres : A la faible immunogénicité des HPV se traduisant par :
Un défaut de lyse cellulaire et de réaction inflammatoire locale,
Une faible production de protéines virales,
L‟altération de la réponse immune locale et inhibition de la synthèse, d‟interféron par les protéines virales (E6, E7),
La sous-expression des molécules du complexe majeur d‟histocomptabilité (CMH1) Le déficit de la cytotoxicité cellulaire dans les lésions de haut grade :
Faible réponse cellulaire T aux protéines virales
Déséquilibre de la balance Th 1/Th 2 au profit de la réponse Th 2 dans les lésions évolutives (CD4 non détectables).
Epidémiologie des infections à HPV
L‟infection virale par HPV est la plus commune des infections du tractus anogénital, survenant le plus fréquemment chez les adolescentes et les jeunes femmes.Sa prévalence varie en fonction de l‟âge avec un premier pic entre 20 et 25 ans correspondant au début de l‟activité sexuelle et un deuxième plus petit vers 45-50 ans pour les HPV à haut risque [69,70]. Au contraire, l‟incidence des types à bas risque décroit avec l‟âge [59]. Cette prévalence varie aussi selon les pays, la population étudiée; néanmoins l‟HPV est retrouvé en général au niveau du col de l‟utérus chez 5 à 50 % des femmes asymptomatiques d‟âge reproductif [71]. Une étude épidémiologique menée par l‟International Agency for Research on Cancer (AIRC) sur 15000 femmes issues de 11 pays (Niger, Inde, Vietnam, Thaïlande, Corée, Colombie, Argentine, Chili, Pays Bas, Italie et Espagne) [72], montre que pour, tous âges confondus, la plus faible prévalence est retrouvée en Espagne (1,4%) et la plus élevée au Niger (25,6%). Parmi toutes les infections aux HPV, quelque soit le pays considéré, la prévalence est plus élevée pour les HPV à hautrisque (66,8%) qu‟à bas risque (27,7%). Le HPV le plus fréquemment retrouvé chez les personnes infectées est le HPV16 à haut risque (19,7%) [71].
Génotypage des HPV
Ces techniques comportent une étape d‟amplification (PCR) d‟un fragment d‟ADN viral. Le choix de la région amplifiée est très important ; elle doit répondre à deux critères : la séquence d‟ADN doit être suffisamment conservée aux extrémités afin de permettre une PCR de genre, mais divergente dans sa région interne pour permettre le génotypage par comparaison avec des séquences de génotypes connus. On distingue principalement : le génotypage par sondes immobilisées sur bandelettes, par puce à ADN, par cytométrie à flux, par séquençage et par PCR en temps réel. Cette dernière permet de détecter le génotype d‟HPV à haut risque, dont la distribution varie selon les zones géographiques, mais aussi peut facilement diagnostiquer les infections multiples.
Principe de la PCR en temps réel
Le principe de la PCR en temps réel repose sur le suivi cycle par cycle de la réaction d‟amplification enzymatique au moyen d‟une molécule rapporter fluorescente capable d‟émettre dans des conditions bien définies un rayonnement fluorescent dont l‟intensité sera directement mesurée à un moment donné au cours de chaque cycle PCR. Nous avons réalisé une PCR en temps réel faite d‟amplification multiplex de 4 tubes pour chaque échantillon. Chaque tube contient des amorces dirigées contre des régions de trois ou quatre (4) types HPV et du gène de la bêta-globine utilisé comme contrôle interne. Nous avons quatre types de fluorescences à savoir : Fam pour une fluorescence de couleur bleu, Hex pour une fluorescence de couleur verte, Rox pour une fluorescence de couleur jaune et Cy5 pour une fluorescence de couleur orange.
Préparation des échantillons pour l’amplification
Un mix constitué de 60 μl de Hot Start DNA Polymérase et 0,6 ml de PCR-bufferFRT mélangé au vortex a été préparé. Cette préparation est valable pour 132 réactions et est stable durant 3 mois lorsqu‟elle est conservée à 4°C. Ce mix (DNA polymérase+ PCR-buffer-FRT) est équitablement ajouté dans quatre tubes PCR auquel on ajoute les PCR-mix-1 contenant les amorces des 14 génotypes recherchés et on obtient ainsi la réaction Mix. Pour préparer cette réaction Mix nous avons suivi le protocole du kit « HPV Génotypes 14 Real-TM Quant » qui comprend quatre PCR-mix-1 à savoir : PCRmix-1 « 16-18-31-IC » couvercle bleue ; PCR-mix-1 « 39-45-59-IC » couvercle incolore ; PCR-mix-1 « 33-35-56-68 » couvercle verte ; PCR-mix-1 « 51-52-58-66 » couvercle orange. Le volume de PCR-mix-1 et le volume de la préparation mix composée de PCR-buffet-FRT et de Polymérase ont été déterminés, selon le nombre d‟échantillons, en suivant la figure 3 du protocole (SACACE, 2014). La préparation finale pour la PCR est obtenue en ajoutant 15μl de Mix « 16, 18,31, CI » dans le premier tube PCR, 15μl de Mix « 39, 45, 59, CI » dans le deuxième tube PCR, 15μl de Mix « 33, 35, 56, 68 » dans le troisième tube PCR et 15μl de Mix « 51, 52, 58, 66 » dans le quatrième tube PCR. Dans les quatre tubes PCR de chaque échantillon, nous y avons ajouté 10μl d‟ADN de l‟échantillon correspondant. Nous avons préparé un contrôle négatif et deux standards K1 et K2 qui représentent les contrôles positifs, en ajoutant 10μl de DNA-buffer dans les 4 tubes PCR correspondant au contrôle négatif et 10μl de Positive K1 et K2 dans les 4 tubes PCR correspondant à chaque contrôle positif (K1 et K2). Le volume réactionnel total est de 25μl.
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Table des matières
1.INTRODUCTION
OBJECTIFS
OBJECTIF GENERAL
OBJECTIFS SPECIFIQUES
2.GENERALITE
2.1 CANCER DU COL DE L’UTERUS
2.2. GENERALITES SUR LES VIRUS DU PAPILLOME HUMAIN (HPV)
2.3. TECHNIQUES DE MISE EN EVIDENCE DES HPV
2.4. PROPHYLAXIE DU CANCER DU COL
3. MATERIEL ET METHODES
3.1 CADRE ET LIEU D’ETUDE
3.2 TYPE ET PERIODE D’ETUDE
3.3 POPULATION D’ETUDE
3.4.1.2 REACTIF
3.4.2.1 DETECTION DES GENOTYPES DU HPV
3.4.2.2 INTERPRETATION DES RESULTATS DE LA PCR
3.4.2.3 ANALYSE DES DONNEES
3.4.2.4 CONSIDERATIONS ETHIQUES
4. RESULTATS
5. COMMENTAIRES ET DISCUSSION
CONCLUSION
RECOMMANDATIONS
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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