Généralités sur les entérobactéries

GENERALITES SUR LES ENTEROBACTERIES

Définition des entérobactéries

La famille des Entérobactériaceae est constituée de genres bactériens qui sont rassemblés en raison de caractères bactériologiques communs.
Ce sont des bacilles à Gram négatifs dont les dimensions varient de 1 à 6 µm de long sur 0,3 à 1 µm de large. Elles peuvent être mobiles par ciliature péritriche ou immobiles et se développent en aéro-anaérobiose et sur milieu nutritifs. Elles acidifient le glucose par voie fermentaire avec souvent production de gaz, ne possèdent pas d’oxydase et réduisent les nitrates en nitrites.

Classification des entérobactéries

Une centaine d’espèces d’Entérobacteriaceae sont individualisées, mais 23 d’entre elles représentent 99% des souches isolées en cliniques .
Les Entérobactéries qui intéressent la bactériologie médicale peuvent être regroupées en 4 tribus :
 La tribu des Escherichiae
 La tribu des Klebsiellae
 La tribu des Proteae
 La tribu des Yersiniae

Habitat et pouvoir pathogène

Les bactéries de la famille des Entérobactériaceae représentent la majorité de la flore intestinale aéro-anaérobie. Chez l’homme, l’entérobactérie prédominante est Escherichia coli. Parmi les nombreuses espèces d’entérobactéries ; certaines se trouvent dans l’environnement, d’autres chez les végétaux, et peuvent avoir un pouvoir phytopathogéne. Parmi les espèces qui peuvent être isolées chez l’homme, certains sont constamment pathogènes (shigella). D’autres espèces se comportent comme des bactéries pathogènes opportunistes, responsables d’infections chez les malades fragilisés (klebsiella)

EPIDIMIOLOGIE DES ENTEROBACTERIES PRODUCTRICES DE BLSE

Les bêta-lactamases à spectre étendu sont retrouvées essentiellement dans la famille des entérobactéries, principalement Escherichia coli et Klebsiella, plus rarement Serratia, Citrobacter, Enterobacter, Morganella, Proteus, Salmonella, Shigella ou des bactéries Gram négatifs non fermentatives comme Pseudomonas, Acinetobacter et d’autres .
Depuis la première découverte de bactéries productrices de BLSE, on observe une augmentation du nombre de patients colonisés et du nombre d’infections à ces germes, ainsi qu’une très grande hétérogénéité de ces enzymes avec une nomenclature complexe. Les BLSE type TEM et SHV ont été décrites en premier dans le milieu hospitalier, en particulier chez Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli et d’autres entérobactéries  Indépendamment, en milieu communautaire, ce sont les BLSE type CTX qui sont apparues dans E. coli, liées à des infections urinaires.Au cours des dernières années, une circulation des souches entre les milieux hospitalier et communautaire a été observée. Il est clairement établi que le développement et la propagation de BLSE sont liés à l’utilisation des bêta-lactamines, dont la colonisation du tube digestif joue un rôle important Les données présentées sur la Figure 3 sont issues des réseaux internationaux de surveillance collectant des souches de bactéries provenant de prélèvements à visée diagnostique [8] Ces réseaux ne donnent pas une cartographie exacte de la prévalence dans les différentes régions du monde, mais ont le mérite d’en donner un aperçu à grande échelle.Ces données montrent une répartition non homogène des entérobactéries BLSE à l’échelle mondiale, avec par ordre décroissant de prévalence, l’Amérique du Sud, l’Asie/région pacifique, l’Europe et les États-Unis.Concernant le continent africain, les études régionales laissent présager d’une forte prévalence Outre ces aspects descriptifs de prévalence, ces réseaux confirment l’isolement constamment croissant de souches d’entérobactéries BLSE dans les prélèvements au cours de la dernière décennie.Dans le Royaume du Maroc, comme le reste du monde, l’émergence des BLSE est un problème majeur de santé publique

Technique de prélèvement

Prélèvement de surface

La surface a été frottée à l’aide d’un écouvillon humidifié avec de l’eau physiologique stérile, sur des zones définies en stries parallèles rapprochées en le faisant tourner légèrement, puis sur les mêmes zones en stries perpendiculaires aux premières. Les écouvillons sont remis dans leurs étuis protecteurs et ils sont transmis au laboratoire dans une glacière maintenue entre 2° et 5°C. Les écouvillons ont été transférés en milieu d’enrichissement BHI concentré pour réaliser les analyses microbiologiques

Ensemencement sur des milieux spécifiques 

Les écouvillons ont été ensemencés par épuisement sur des milieux de culture spécifiques des bactéries
 Pour la recherche des entérobactéries fermentaires et non fermentaires, l’ensemencement a été réalisé sur des boites contenant le milieu EMB (annexe1) et incubées à 37 °C pendant 24H.
 Après, les colonies sont disposées dans un milieu nutritif TSA (annexe 2) pour passer aux tests d’identification biochimiques.
 La culture isolée est ensemencée dans un tube contenant de la gélose inclinée pour qu’elle soit conservée et afin de réaliser par la suite des tests d’identification.

Détection phénotypique des bêta-lactamases à spectre étendu

La détection phénotypique est utilisée en routine. Elle repose sur le choix des bêta-lactamines testées, leur disposition dans l’antibiogramme classique par disque de diffusion et l’observation des diamètres de zone d’inhibition. Les synergies ou antagonismes entre certains antibiotiques permettent de décrire des phénotypes et d’en déduire les mécanismes de résistance précis.

L’Antibiogramme

L’antibiogramme est un examen de laboratoire visant à déterminer la sensibilité d’une bactérie à différents antibiotiques par la méthode de diffusion. Il s’agit d’un antibiogramme standard en milieu gélosé, selon les recommandations du Comité de l’antibiogramme de la Société française de microbiologie (Recommandations 2013).

Principe

Le principe consiste à rechercher une synergie sur gélose de MH entre un disque d’amoxicilline + acide clavulanique et des disques (placés à 2 ou 3 cm du disque central) de ceftazidime, de céfotaxime, de céfépime et d ’aztréonam:
 Le céfépime, naturellement plus résistant aux céphalosporinases permet de mettre en évidence l’éventuelle association d’une BLSE à une céphalosporinase hyperproduite
 Le céfotaxime permet de mettre en évidence les BLSE de type CTX-M

Matériel

 Géloses Mueller-Hinton
 Disques d’antibiotiques

Milieu de culture

Pour réaliser la méthode d’antibiogramme, un milieu non sélectif (le milieu MH) et utilisé dont l’épaisseur de la gélose doit être strictement de 4 mm et répartie uniformément. Les boites doivent être séchées 30 minutes avant leur emploi.

Réalisation de l’inoculum bactérien

Pour préparer l’inoculum bactérien, il faut travailler au départ avec une souche pure. A partir d’une colonie bien isolée au niveau de la gélose nutritive qui représente une culture jeune, une suspension turbide en bouillon échelle 0,5 de Mac Farland est réalisée en effectuant par la suite une dilution de 1/10 de la culture ainsi préparée.

Ensemencement par écouvillonnage

Un ensemencement en stries sur toute la surface du milieu à 3 reprises selon 3 angles (60 °) est effectué, avant de réaliser un écouvillonnage partout autour du bord de la surface de la gélose.

Application des disques

Les disques choisis ont été posés à l’aide d’une pince flambée, tout en appuyant légèrement sur les disques pour qu’ils soient bien collés sur la surface de la gélose. Une distance minimale de 15 mm doit séparer un disque périphérique du bord de la boite et deux disques doivent être éloignés au maximum de 30 mm de sorte que les zones d’inhibition ne se chevauchent pas.

Incubation

Les boites sont ensuite portées à l’étuve à 37°C pendant 18 à 24 heures. Après incubation, chaque disque sera entouré d’une zone d’inhibition de la croissance bactérienne.

Choix des antibiotiques

Les antibiotiques testés lors de la réalisation de l’antibiogramme pour les entérobactéries ainsi que leur concentration sont les suivantes :
 Deux aminopénicillines : l’Amoxicilline (AML). (30 µg) et Amoxicilline / Acide clavulanique (AMC) (10µg)
 Une céphalosporine de première génération : la Céfalotine (KF) (30 µg)
 Une céphalosporine de deuxième génération : la Céfoxitine (FOX) (30 µg).
 Deux céphalosporines de troisième génération : le Céfotaxime (CTX) (30 µg) et la Céftazidime (CAZ) (30 µg)
 Deux aminosides : la gentamicine (CN) (10 µg) et l’Amikacine (AK) (30 µg)
 Trois quinolones : l’acide nalidixique (NA) (30 µg) et la ofloxacine (OFX) (5 µg). ciprofloxacine (CIP) (5 µg).
 Un sulfamide : Sulfaméthoxazole (SXT) (1,25-23,75 µg).
 Une carbapénème : Ertapénème (ETP) (10 µg).
 Lors de la réalisation d’un antibiogramme standard, après ensemencement, et au moment de l’application des disques sur la gélose, le disque porteur l’amoxicilline / acide clavulanique (AMC) a été placé en face d’un à deux céphalosporines de 3ème génération : Céfotaxime (CTX), Céftazidime (CAZ).
La réalisation du test de synergie et l’obtention d’une image sous forme de « bouchon de champagne », permet de confirmer qu’il y a la présence de BLSE et alors conclure que la souche est productrice de bêta lactamase à spectre élargie.

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Table des matières

Introduction
Objectif de stage
Structure d’accueil
Revue bibliographiques 
I/ Généralités sur les entérobactéries
a) Définition des entérobactéries
b) Classification des entérobactéries
c) Habitat et pouvoir pathogène
II / Historique des beta-lactamases à spectre étendu
a) Définition des beta-lactamases
b) Historique de beta-lactamases à spectre étendu
c) Classification de beta-lactamases à spectre étendu
d) Différents type de beta-lactamases à spectre étendu
III/ épidémiologie des entérobactéries productrices de BLSE
a) Réservoir de beta-lactamases à spectre étendu
b) Transmission de beta-lactamases à spectre étendu
c) Dissémination de beta-lactamases à spectre étendu
d) Prévalence de beta-lactamases à spectre étendu
e) Facteurs de risque d’acquisition d’une entérobactérie BLSE
f) Durée de portage
Matériel et méthodes
I/ lieu de prélèvement 
II/ prélèvement
III/ technique de prélèvement
IV/ Ensemencements sur des milieux spécifiques
1. Milieu EMB
2. Milieu TSA
V/ Tests d’identifications biochimiques
A. Milieu hajna-kligler
B. Milieu citrate de simmons
C. Test d’oxydase
D. Milieu urée indole
VI/ Détection phénotypiques de beta-lactamase à spectre étendu 
1) L’antibiogramme
VII/ Confirmation moléculaire des beta-lactamases à spectre étendu par PCR
a) Diagnostic des BLSE par PCR
b) Extraction d’ADN
c) Caractérisation des gènes codant aux beta-lactamases
d) Préparation de gel
e) Electrophorèse
f) Révélation
Résultats et discussion
I/ Fréquence de EBLSE
II/ Résultat de la détection phénotypiques 
1) Interprétation
2) Taux de résistance par rapports aux antibiotiques testés
III/ Résultat de la recherche de gènes de résistance retrouvés chez les entérobactéries productrices de béta-lactamases isolées à partir des prélèvements réalisés 
Discussion
Conclusion

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